一种木蹄复方提取物及其制备方法与用途
【专利摘要】本发明涉及生物医药【技术领域】。具体的说，本发明涉及一种木蹄复方提取物及其制备方法和用途。木蹄复方按重量比组成为：木蹄层孔菌(1～10)∶松针层孔菌(1～9)∶赤芝(1)，复方提取物的提取方法为：配制好的术蹄复方，混合之后粉碎，加纯水，水提醇沉后取上清液，减压浓缩，浓缩液真空干燥，即得。本发明中木蹄复方提取物中三萜和三萜皂苷的含量不低于5.5％。该提取物具不仅具有有显著的体外和体内抗肿瘤功效，而且没有明显急性毒性，小鼠的最大耐受量为0.2g(折合生药量为4.58g)，为人口服用量的327倍。该提取物与药学上可接受的载体混合，可制成复方制剂，其中复方制剂包括口服液、注射液、混悬剂、丸剂、片剂、胶囊、散剂、颗粒剂或滴丸剂。
【专利说明】一种木蹄复方提取物及其制备方法与用途 1【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药【技术领域】。具体的说，本发明涉及一种木蹄复方提取物及其 制备方法，该复方提取物主要用于体外和体内抑制肿瘤细胞生长。 2【背景技术】
[0002] 近年来，我国肿瘤发病率处于快速上升期，每年癌症发病人数约260万，死亡180 万，已成为中国城市和农村居民第一死因。由于肿瘤手术切除、化疗和放疗都存在固有缺 陷，天然药物或中药抗肿瘤研究被日益重视。药用真菌是天然药物中的一个重要组成部分， 而抗肿瘤作用是药用真菌重要的功效之一。
[0003] 其中，木蹄层孔菌Fomes fomentarius(L. :Fr)Kick.又名桦菌芝，是多孔菌科、层 孔菌属的药用真菌。《中华本草》中记载：木蹄层孔菌子实体无柄。菌盖马蹄形，长径3-40cm， 短径2-27cm，厚2-18cm。表面有厚角质皮壳，灰色、浅褐色或黑色，光滑，有明显的同心环棱 纹。管口面浅褐色或灰色，管口圆形，每1mm间3-4个。纵剖面可见菌管多层，每层厚5-25mm。 木栓质。气微，味淡。其药理作用主要是：显着提高实验小鼠减压缺氧的耐受能力，延长其 存活时间，具有抗疲劳、抗高温的作用。并且能影响缺氧机体肠系膜微循环的流速、流态，对 微循环具有改善作用。主治：消积；化瘀；抗癌（食管癌；胃癌和子宫癌）。通过小鼠实验已 证明：木蹄层孔菌中分离出的单宁类酚性物对小鼠移植性肿瘤S180有明显杀灭作用，而张 丽萍等深入研究发现木蹄层孔菌多糖对S180肿瘤细胞并无直接杀伤作用，而是通过激活 动物机体的免疫功能，激活巨噬细胞、自然杀伤细胞、杀伤性T细胞的活性，从而增强对肿 瘤免疫功能。
[0004] 松针层孔菌Phellinus pini.又名松针灵芝、松木层孔菌，为多孔菌科、层孔菌属 药用真菌。《中国大型真菌原色图鉴》记载：其子实体多年生，木栓质，无辆，菌盖扁米球形 至马蹄形，4-14厘米7X24厘米，罕达23厘米X40厘米，厚2. 5-18. 5厘米或更大。盖面初 期有红褐色胶状皮壳，渐角质化而成灰色至黑色，并有宽的棱带，边缘往钝，初期近白色，后 渐变淡黄色至赤粟色，下侧无子实层。菌肉近白色至淡黄褐色，有环纹，木栓质至木质。厚 0.5-2厘米，味苦。菌管多层，每层厚3-5毫米，淡黄色，管口白色至乳白色。孢子卵圆形或 椭圆形，无色。生于松、云杉、冷杉、铁杉及落叶松等针叶树的树干或朽木上。偶尔也生于阔 叶树的枯腐木上。王稳航、刘安军等对松针层孔菌的药理作用进行了比较系统的研究，结果 显示：松针灵芝的三种多糖均不同程度地提高了小鼠血清、心、肝、脑、脾中SOD、GSH-Px活 力，降低了 MDA生成量，而对T0AC值影响较小；同时，三利多糖均显著提高了小鼠体内血清 N0生成量。同时，他们提出三种多糖的抗氧化机制可能与其它抗氧化剂不同，其对小鼠体内 氧化压力和抗氧水平呈双重增加效果，可能是由于多糖作为免疫物质引起机体的免疫反 应造成的。松针层孔菌是针叶林里红野生松、落叶松、云杉最主要的、危害最大的火立木腐 朽菌，对于针叶林无疑是一种癌，但是对于人类却是抑制肿瘤、治疗癌症的一剂良药。《中国 大型真菌原色图鉴》73页中记载：松针子实体含齿孔酸等活性物质，是所有真菌中治疗癌症 效果最好的品种，子实体提取物对小白鼠肉瘤180及艾氏腹水癌的抑制率均达100 %。然 而，松针具有毒性，为达到中医理论中扶正祛邪的目的，所以松针必须要与其他中药配合才 可解除毒性，安全使用。目前采用松针层孔菌为主要成份治疗各类癌症的有效配方的机构， 国内外仅有两家，一家是美国的CELG，另一家用国内的汉草荟。
[0005] 赤芝Ganoderma lucidum(Leyss. ex Fr)Karst为多孔菌科、灵芝属药用真菌。据 《中国药典》记载：赤芝外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形，直径10?18cm，厚1? 2cm。皮壳坚硬，黄褐色至红褐色，有光泽，具环状棱纹和辐射状皱纹，边缘薄而平截，常稍内 卷。菌肉白色至淡棕色。菌柄圆柱形，侧生，少偏生，长7?15cm，直径1?3. 5cm，红褐色 至紫褐色，光亮。孢子细小，黄褐色。气微香，味苦涩。其主要功效为：补气安神，止咳平喘。 用于眩晕不眠，心悸气短，虚劳咳喘。此外，赤芝抗肿瘤功效已被广泛报道，其抗肿瘤机制也 已被深入研究，主要包括：1.促凋亡：通过促进Bax表达，同时抑制Bcl-2和Bcl-xl等基因 表达，从而抑制淋巴瘤、炎性乳腺癌等生长，促使其凋亡；2.生长抑制：通过抑制周期蛋白 cyclinDl，抑制卵巢癌细胞生长；3.提高免疫：灵芝多糖和三萜类物质能广泛调节免疫细 胞和免疫相关细胞的功能，包括B细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞等，同时它们 还时以促进TNF-α表达，降低IL-10, TGF-β 1和VEGF表达，增强免疫应答强度。
[0006] 目前，中药、天然药物复方已经成为治病用药的最主要形式之一，把不同药理机制 的真菌组成复方更有利于抗肿瘤治疗。本研究首次提出木蹄层孔菌、松针层孔菌和赤芝三 者结合，以达到扶正气，提高肿瘤免疫、肿瘤杀伤的作用。 3
【发明内容】
[0007] 本发明目的在于提供一种高效低毒的木蹄复方提取物及制备方法。
[0008] 本发明的另一目的在于提供该提取物在体内和体外抗肿瘤中的用途。该提取物能 在体外显著杀伤肿瘤细胞，并有效抑制小鼠体内肿瘤生长；并且小鼠口服和腹腔注射均没 有发现明显毒性，最大耐受剂量为l〇g/kg。
[0009] 本发明涉及一利有显著抗肿瘤功效的、低毒性的木蹄复方提取物及制备方法。
[0010] 本发明木蹄复方中，木蹄层孔菌：松针层孔菌：赤芝的重量比为1?10 : 1? 9:1。
[0011] 优选地，本发明木蹄复方中，木蹄层孔菌：松针层孔菌：赤芝的重量比为2? 7 : 1 ?6 : 1。
[0012] 更优选地，本发明木蹄复方中，木蹄层孔菌：松针层孔菌：赤芝的重量比为4? 5 : 1 ?3 : 1。
[0013] 本发明制备木蹄复方提取物方法步骤如下：
[0014] 步骤一：木蹄层孔菌、松针层孔菌和赤芝按照重量比要求配成木蹄复方，混合之后 粉碎；
[0015] 步骤二：粉碎之后的木蹄复方加纯水，l〇〇°C加热回流提取3次，每次2小时，料液 比分别为1 : 20、1 : 15和1 : 10,4°C静置24小时后，gOOOr.mirT1离心30分钟，上清液 减压浓缩20倍体积。之后，浓缩液再加95%乙醇，使乙醇终浓度为80%，在4°C静置24小 时后，9000r · mirT1离心30分钟，取上清液，减压浓缩20倍体积，浓缩液真空干燥，即得。
[0016] 本发明制备的木蹄复方提取物，其成分分析结果显示其含有机酸，氨基酸、多肽和 蛋白质，糖、多糖和苷类，皂苷，内酯、香豆素及其苷类，植物留醇和三萜成分以及挥发油和 油脂等多种成分，其中三萜类和三萜皂苷的含量不低于5. 5%。
[0017] 本发明制备的木蹄复方提取物，其用途在于：⑴该提取物在体外对人肺腺癌 细胞（A549)、人宫颈癌细胞（Hela)、人肝癌细胞（QGY)、人前列腺癌细胞（DU145)、人结 肠癌细胞（HCT116)、人食管癌细胞（Ecal09)、人乳腺癌细胞（MDA-MB-435S)、人胃癌细胞 (SGC-7901)、人成骨肉瘤细胞（Saos-2)、人骨肉瘤细胞（U20s)等肿瘤细胞株有显著杀伤作 用。（2)该提取物能有效诱导细胞凋亡，终浓度为100 μ g/ml作用24h后，A549的凋亡率为 14.8%。（3)该提取物在体内对小鼠肉瘤S180和Lewis肺癌移植瘤模型肿瘤有显著的抑制 作用，在给药剂量为150mg/kg时对S180肉瘤的抑瘤率为57. 7% ;在给药剂量为100mg/kg 时对Lewis肺癌的抑瘤率为56. 5%。（4)该提取物能有效提高荷瘤小鼠免疫功能，能使荷 瘤小鼠的胸腺指数和外周血TNF-a含量提高。
[0018] 本发明制备的木蹄复方提取物与药学上可接受的载体混合，可制成复方制剂，其 中复方制剂包括口服液、注射液、混悬剂、丸剂、片剂、胶囊、散剂、颗粒剂或滴丸剂。
[0019] 本发明与已有技术相比，具有如下显著特征：
[0020] (1)提供一种新的抗肿瘤的木蹄复方：木蹄层孔菌抗肿瘤的作用机理在于其毒性 作用，作为复方中君药，而松针层孔菌也有显著抗肿瘤作用，作为臣药，而赤芝有提高机体 免疫力的功效，与前两者配伍使用，有很好扶正祛邪的作用。
[0021] ⑵提供一种新的抗肿瘤木蹄复方提取物，该提取物的提取方法为：水提醇沉，然 后离心取上清液，浓缩，干燥，即得。
[0022] (3)该提取物成分分析结果显示其含有机酸，氨基酸、多肽和蛋白质，糖、多糖和苷 类，皂苷，内酯、香豆素及其苷类，植物留醇和三萜成分以及挥发油和油脂等多种成分，其中 三廠类和三廠阜苷的含量不低于5. 5%。
[0023] (4)该提取物具有明显体内、体外抑制肿瘤细胞生长的作用；能提高荷瘤小鼠免 疫功能，能使荷瘤小鼠的胸腺指数和外周血TNF-a含量提高；且该提取物小鼠口服和腹腔 注射没有明显毒性，最大耐受剂量为l〇g/kg。
[0024] (5)该提取物易溶于水，水溶液颜色为棕色。
[0025] (6)该提取物与药学上可接受的载体混合，可制成复方制剂 4【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1木蹄复方提取物对A549细胞凋亡的影响 5【具体实施方式】
[0027] 以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件。
[0028] 实施例1木蹄复方提取物的制备
[0029] 木蹄层孔菌60g、松针层孔菌30g和赤芝15g，粉碎，加水，100°C加热回流提取3 次，每次2h，料液比分别为1 : 20、1 : 15和1 : 10,过滤，合并滤液，4°C静置24h，9000r/ min离心30min，上消液减压浓缩20倍体积，浓缩液加95%乙醇，使乙醇终浓度为80%，4°C 静置24h，9000r/min离心30min，上清液减压浓缩20倍体积，浓缩液真空干燥，即得。
[0030] 实施例2木蹄复方提取物的制备
[0031] 木蹄层孔菌70g、松针层孔菌20g和赤芝15g，粉碎，加水，KKTC加热回流提取3 次，每次2h，料液比分别为1 : 20、1 : 15和1 : 10,过滤，合并滤液，4°C静置24h，9000r/ min离心30min，上清液减压浓缩20倍体积，浓缩液加95%乙醇，使乙醇终浓度为80%，4°C 静置24h，9000r/min离心30min，上清液减压浓缩20倍体积，浓缩液真空干燥，即得。
[0032] 实施例3木蹄复方提取物成分分析
[0033] (1)组分分析
[0034] 把木蹄复方提取物溶于80%乙醇溶液，即得供试液，然后采用系统预试法对其进 行鉴别。①试管预试法向盛有供试液的试管中加入相关试剂，根据颜色、沉淀、荧光等反应 现象判断某化学成分的存在。②圆形滤纸层法用毛细点样管吸取供试液在圆形滤纸上点 样，待干后使乙醇从中心展开，喷以不同显色剂，根据出现的颜色、斑点或产生的荧光等现 象判断某化学成分的存在。结果如表1所示，可知其含有有机酸，糖、多糖和苷类，皂苷，内 酯、香豆素及其苷类，植物留醇、三萜成分以及挥发油和油脂。可能含有生物碱，氨基酸、多 肽和蛋白质，黄铜及其苷类以及蒽醌及其苷类。
[0035] 表1木蹄复方提取物化学成分
[0036]
【权利要求】
1. 木蹄复方提取物，其特征在于三萜类和三萜皂苷的含量不低于5. 5%。
2. 权利要求1所述木蹄复方提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤， 步骤一：将木蹄复方粉碎； 步骤二：粉碎之后的木蹄复方加水，加热回流提取，低温静置后，离心，上清液减压浓 缩。之后，浓缩液再加乙醇，使乙醇终浓度为80%，在低温静置后，离心，取上清液，再次减压 浓缩，浓缩液真空干燥，即得。
3. 权利要求1中所述木蹄复方提取物的用途，其特征为：（(1)该提取物在体外对人肺 腺癌细胞（A549)、人宫颈癌细胞（Hela)、人肝癌细胞（QGY)、人前列腺癌细胞（DU145)、人 结肠癌细胞（HCT116)、人食管癌细胞（Ecal09)、人乳腺癌细胞（MDA-MB-435S)、人胃癌细胞 (SGC-7901)、人成骨肉瘤细胞（Saos-2)、人骨肉瘤细胞（U20s)等肿瘤细胞株有显著杀伤作 用。（2)该提取物能有效诱导包括A549在内的肿瘤细胞凋亡。（3)该提取物在体内对小鼠 肉瘤S180和Lewis肺癌移植瘤模型肿瘤有显著的抑制作用。（4)该提取物能有效提高荷瘤 小鼠免疫功能，能使荷瘤小鼠的胸腺指数和外周血TNF-a含量提高。
4. 根据权利要求2所述木蹄复方，其特征在于：木蹄层孔菌：松针层孔菌：赤芝的重 量比为1?10 : 1?9 : 1。
5. 权利要求2中所述木蹄复方提取物与药学上可接受的载体混合，可制成复方制剂。
6. 权利要求5中所述复方制剂包括口服液、注射液、混悬剂、丸剂、片剂、胶囊、散剂、颗 粒剂或滴丸剂。
【文档编号】A61K36/074GK104055803SQ201210355671
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2012年9月19日 优先权日:2012年9月19日
【发明者】刘琼, 沈先荣, 何颖, 蒋定文, 刘玉明, 侯登勇, 陈伟, 王庆蓉, 钱甜甜, 莫琳芳 申请人:中国人民解放军海军医学研究所