专利名称：二甲双胍在对放化疗损伤起保护作用的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及二甲双胍的新用途，特别涉及一种二甲双胍对放疗和/或化疗药物引起的造血免疫细胞损伤起保护作用的药物中的应用。
背景技术：
许多肿瘤患者在接受放疗、化疗过程中出现严重的毒副作用，致使不能坚持治疗，导致预后不良。其中急性和慢性骨髓抑制是常出现的治疗毒副反应。急性骨髓抑制主要是放化疗引起的造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells, HPCs)凋亡反应,对静止期的造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)的影响程度较轻,临床表现明显,在早 期就可以采取治疗措施。但也有部分患者出现远期损伤即出现了长期骨髓抑制，表现为急 性骨髓抑制恢复之后的HSCs储备降低和HSCs自我更新能力下降。造血干细胞具有自我更新、增殖、分化生成全血细胞的功能，受损后引起骨髓持久抑制甚至个体死亡。接受全身照射(total body irradiation, TBI)或某些化疗药物如卡钼、马利兰(busulfan, BU)、卡氮芥(BCNU)的个体更容易出现持久性骨髓损伤。由于持久性骨髓损伤是迟发性的，一般情况下细胞库数量减少但外周血细胞数正常，在临床容易被忽视。临床上各种生长因子的治疗可能会加速HSC的耗竭，在后续的抗癌治疗或骨髓移植时出现再障性贫血等严重后果。照射引起HSCs衰老的分子机制尚未阐明，目前缺乏有效的治疗手段。寻找新的手段防止放化疗的骨髓损伤始终是临床迫切需要解决的问题。并且随着核能利用的增加，核恐怖威胁持续存在，放射性物质的广泛使用，导致辐射暴露的可能性增加，出于国家安全需要，各国也都在加紧辐射损伤防治药物的研发。研究发现，放化疗导致的HSCs衰老是发生长期骨髓抑制的主要原因之一。HSCs衰老与端粒缩短、DNA损伤和ROS升高有关，其中受到辐射和药物作用后HSCs中ROS持续升高可能是HSC衰老重要分子机制。二甲双胍广泛应用的II型糖尿病治疗药物，可以激活 LKBI-AMPK (AMP-activated protein kinase)等信号通路，包括后续的 ACC (acetyl-CoAcarboxylase),继而抑制肝脏的糖异生(hepatic gluconeogenesis),促进脂肪酸氧化，改善胰岛素敏感性，降低血糖水平。近年来研究发现有抗衰老的作用以及肿瘤防治作用，其中抗氧化作用可能是重要的分子机制，直接或者间接通过调节主要由NADPH氧化酶产生的超氧阴离子的量来清除细胞内的R0S。另外二甲双胍可以通过LKB1-AMPK通路抑制哺乳动物的雷帕霉素祀(mammalian target of rapamycin,mT0R),进而发挥抑制细胞衰老和防治肿瘤作用。根据二甲双胍作用的分子机制，发明人通过研究发现了二甲双胍对放和/或化疗药物引起的造血免疫细胞损伤起保护作用的药物中的应用，同时本发明利用Y射线全身照射、环磷酰胺、顺钼腹腔注射制备放疗和/或化疗损伤小鼠模型，二甲双胍对照射引起和/或化疗药物引起的造血免疫细胞损伤具有一定的保护作用，降低造血干细胞氧化应激水平，本发明将放化疗损伤的研究引入了更深的层次，从而更快地促进了放化疗损伤方面的研究。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种二甲双胍在制备对放疗和/或化疗药物引起的造血免疫细胞损伤起保护作用的药物中的新用途。本发明的另一目的是提供一种利用二甲双胍降低放疗和/或化疗损伤的小鼠模型及其构建方法。本发明采用的技术方案为一种二甲双胍在制备对放疗和/或化疗药物引起的造血免疫细胞损伤起保护作用的药物中的应用；作为一个优选的实施方案是，二甲双胍在制备对放疗引起的长期骨髓抑制起保护 作用的药物中的应用；所涉及的放疗如137Cs源Y射线照射。作为一个优选的实施方案是，二甲双胍在制备对化疗药物引起的长期骨髓抑制起保护作用的药物中的应用；所涉及的化疗药物如卡钼、马利兰(busulfan，BU)、卡氮芥(BCNU)。上述所涉及的应用中，其特征在于将治疗有效量的二甲双胍与药学上可接受的载体和/或赋形剂混合制成组合物；所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药用制品辅剂等。本发明还提供了一种利用二甲双胍降低放疗和/或化疗损伤的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤针对放疗和/或化疗损伤的小鼠进行二甲双胍灌胃给药，给药量二甲双胍 125mg/kg-500mg/kg(最优为 250mg/kg)，每天一次。具体地，本发明还提供了一种降低放疗损伤的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤照射前24h对C57BL/6小鼠开始灌胃给药，给药量二甲双胍125mg/kg-500mg/kg (最优为250mg/kg)，给予小鼠I次137Cs源Y射线全身照射，剂量4Gy，剂量率O. 76Gy/min,照射后继续灌胃给药，给药量二甲双胍125mg/kg-500mg/kg(最优为250mg/kg),每天一次,照射后继续灌胃给药持续7天，即得降低放疗损伤的小鼠模型。本发明还提供了应用上述方法构建的降低放疗损伤的小鼠模型，该模型应属于本发明的保护范围之内。具体地，本发明还提供了一种利用二甲双胍降低化疗损伤的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤对ICR小鼠进行二甲双胍250mg/kg灌胃给药，每日一次，共10次，对ICR小鼠腹腔注射顺钼或环磷酰胺，顺钼lmg/kg，每日一次，从第二天开始给药，共给药7次；环磷酰胺50mg/kg，第2天、5天、8天腹腔注射给药，即得降低化疗损伤的小鼠模型。本发明还提供了应用上述方法构建的降低化疗损伤的小鼠模型，该模型应属于本发明的保护范围之内。本发明所具有的有益效果本发明验证了二甲双胍对照射引起和/或化疗药物引起的造血免疫细胞损伤具有一定的保护作用，降低造血干细胞氧化应激水平，本发明将放疗和/或化疗损伤的研究引入了更深的层次，从而更快地促进了放疗和/或化疗损伤方面的研究。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但不限定本发明的保护范围。实施例I
一种降低放疗损伤的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤照射前24h对C57BL/6小鼠开始灌胃给药，给药量二甲双胍250mg/kg，给予小鼠I次137Cs源Y射线全身照射，剂量4Gy，剂量率O. 76Gy/min,照射后继续灌胃给药，给药量二甲双胍250mg/kg，每天一次，照射后继续灌胃给药持续7天，不同时间检测小鼠外周血细胞计数及淋巴细胞分型、免疫脏器指数、脾结节形成计数、骨髓造血祖细胞和干细胞功能等指标。实施例2一种降低化疗损伤的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤对ICR小鼠进行二甲双胍250mg/kg灌胃给药，每日一次，共10次，对ICR小鼠腹腔注射顺钼，顺钼lmg/kg，每日一次，从第二天开始给药，共给药7次；不同时间检测小鼠外周血细胞计数及淋巴细胞分型、免疫脏器指数、脾结节形成计数、骨髓造血祖细胞和干细胞 功能等指标。实施例3一种降低化疗损伤的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤对ICR小鼠进行二甲双胍250mg/kg灌胃给药，每日一次，共10次，对ICR小鼠腹腔注射环磷酰胺，环磷酰胺50mg/kg，第2天、5天、8天腹腔注射给药，不同时间检测小鼠外周血细胞计数及淋巴细胞分型、免疫脏器指数、脾结节形成计数、骨髓造血祖细胞和干细胞功能等指标。下面通过具体的实验来验证二甲双胍对放化疗引起的造血免疫损伤的保护作用。I)、实验动物C57BL/6雄性小鼠(SPF级)由中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号[SCXK (京)2005-0013]，体重 20. 0-22. Og,周龄 8-12。包括 C57BL/6-Ly5. I 为实验小鼠，C57BL/6-Ly5. 2为竞争移植实验受体小鼠，C57BL/6_Ly5. 1/2为竞争移植实验竞争小鼠。2)、全身照射实验小鼠(C57BL/6)分组后，按实验设计给药。照射组和给药组I次137Cs源Y射线全身照射(TBI),照射源为Cammacel 1-40 (Atomic Energy,加拿大)，剂量率O. 76Gy/min,Control组(对照组)小鼠接受假照射。3)、药物配制及给药二甲双胍(Metformin),粉剂，分析纯。生产厂家碧云天进口分装，产品号S1741。用无菌双蒸水配制到相应药物浓度，灌胃给药，O. 4ml/只。注射用环磷酰胺，O. 2g/瓶；江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H32020857 ;产品批号11081421。使用时用注射用生理盐水配制。注射用顺钼，IOmg/支；齐鲁制药有限公司，国药准字H20023460 ;产品批号106019108。使用时用注射用生理盐水配制。4)、骨髓单个核细胞分离无菌取小鼠股骨，含2% FCS的Hunks液冲洗骨髓，Ficoll淋巴细胞分离液离心分离，制备单个核细胞悬液，洗涤，计数调整所需的细胞浓度后待用。5)、集落(克隆)形成(CFU-GM)试验分装甲基纤维素培养基M3534 (Stemcell Technology), -20°C保存。用前置于2-8°C冰箱内或室温下融化；分离小鼠骨髓细胞，胎盘蓝染色计数细胞调整细胞浓度加入M3534，振荡器充分混匀，静置待气泡消失，用3ml注射器连接16#平头注射器针头，加入24孔板放入湿盒，置入37°C ,5% CO2培养箱中培养14天。从培养第5天开始在倒置显微镜下进行观察。低倍观察集落形成情况，细胞数^ 30为阳性集落，集落形成率以每IO5个细胞形成的集落数表示。6)、外周血免疫细胞分型测定每只小鼠眼内眦取血，K3EDTA抗凝。外周血取50 μ 1，加入Iml O. 83%的NH4Cl裂解液，室温lOmin，离心5min(400g)，弃上清，PBS洗涤；加入造血细胞分型抗体，室温孵育15分钟，加入400 μ I PBS终止，过滤后转入流式测定管进行流式分析(LSRII，BDBioscience)。
7)、造血干细胞(LirTc-kit+Scal+，HSC)、造血祖细胞(LirTc-kit+Scar，HPCs)分型检测LirTBMCs分离把骨髓单个核细胞浓度调整为I X 107/mL,按体积比I : 100加入系标记阳性抗体(eBioscience)B220(B淋巴细胞)，Ter-119 (T淋巴细胞)，CD3e(T淋巴细胞)，Gr-I和Mac-I (髓系细胞)的混合液，置于4°C，反应30min ;含2% FBS的HBSS溶液洗涤后用原体积悬起细胞。按I X IO8细胞加入ImL羊抗鼠免疫球蛋白磁珠(DynabeadsSheep anti-Rat IgG, Invitrogen)使磁珠与细胞比在4 :1,充分混勻，4°C, 30min。分离获得LirT细胞。调Lin-细胞浓度为5X 106，然后按I :100加入抗体Sca-I和c-Kit冰上避光孵育30min，洗涤后，重悬。流式细胞仪收取细胞检测分析(BD公司Aria FACS II，SanJose, CA)。8)、小鼠脾结节计数处死小鼠后,剥离脾脏,置入过饱和苦味酸固定染色。6h后双盲法在放大镜下进行小鼠自发性脾结节计数。9)、骨髓竞争性抑制试验各实验组小鼠(供体小鼠，C57BL/6-Ly-5. 2)收集BMCs，与正常C57BL/6_Ly-5. I小鼠的BM-MNCs混合，比例是5 I，经外眦静脉窦注入接收致死剂量照射(9. OGy，TBI)的受体小鼠(C57BL/6-Ly-5. 1/5. 2)体内。接种后2个月，从小鼠内眦静脉窦取50 μ L外周血，裂解红细胞，加入抗体 FITC-CD45. 1(1 200)、ΡΕ_45· 2 (I 200)、PerCP_B220 (I 100)、PE/Cy7-CDllb(l 100)、APC-CD3 (I 200)、PE/CY7_Ly6G/Gr_l (I 200)，冰上避光孵育30min。使用流式细胞仪检测，分析供体小鼠造血细胞比例。10)、鶴卵石造血区形成细胞(cobblestone area-forming cell, CAFC)CAFC第4、第5周结果是体外反映造血干细胞增殖功能的检测分析方法。在96孔板内预先使用小鼠骨髓基质细胞贴壁形成滋养层，然后待测小鼠骨髓细胞按不同的稀释度接种骨髓细胞。浓度为每孔81000/27000/9000/3000/1000/333。每个浓度组接种20孔、放置于33°C，5% CO2培养5周。每周半量换液(含10% FBS，5%马血清，氢化可的松，2-巯基乙醇的MDM培养基)。在培养的第2周和第5周读每个浓度20孔Cobblestone area阳性孔的个数。Cobblestone area定义为在倒置显微镜视野内，位于基质细胞下,至少由5个无折光性的细胞组成的区域。读取的结果使用L-Cal软件通过Poisson statistics计算第4周每IO5个 BM-MNCs 内 CAFC 数。实施例4 :不同剂量二甲双胍对造血免疫系统辐射损伤的保护作用C57BL/6小鼠按体重随机分为对照组、照射组(4Gy)、照射组+给药组(下述简称给药组)；给药组分为低剂量组(二甲双胍125mg/kg)、中剂量组(二甲双胍250mg/kg)、高剂量组(二甲双胍500mg/kg)。照射前24h开始灌胃给药，全身照射，照射后第15d取材进行造血免疫细胞学指标检测。包括外周血和骨髓细胞计数、骨髓粒-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)和免疫脏器指数。外周血计数结果发现，与对照组小鼠比较，照射组小鼠外周血白细胞、血小板计数明显降低(p〈0.01)。给药组与照射组比较有升高趋势，尤其是中剂量组趋势比较明显。结果见表I. I。表I. I 二甲双胍对受照小鼠外周血损伤保护作用观察·
IISJ II WBC (KlO9ZL)RBC (xlO,2/L)Plat (xlO^/L)
对照组 47.22 士〗.0210.0±0.431290±173
照射组 41.75士0.34 爾9.72±0.76969±214**
低麵量81 51.7牡0.469,58±0.31789±100
中麵！Λ 42.30土 0.5410.0 土0.581058±167
高麵量組 41.86 士0.349.62±0.61887±87林表示照射组与对照组比较ρ〈0· 01，林*表示照射组与对照组比较ρ〈0· 001。#表示给药组与照射组比较ρ〈0· 05。与对照组比较，照射组小鼠单侧股骨骨髓有核细胞计数没有显著差异；检测反映造血祖细胞增殖功能的指标CFU-GM，显示照射组CFU-GM明显下降(ρ〈0. 01) ;二甲双胍给药组与照射组比较CFU-GM升高，中剂量组和高剂量组与照射组CFU-GM比较，差异有显著性(ρ〈0· 01，ρ<0. 05)，结果见表 I. 2。表I. 2 二甲双胍对受照小鼠骨髓细胞损伤保护作用观察
组别nBMMNC (/股骨)CFU-GM (/IO5)
对 Ilfi428.6±2.39223.5±62.5
424.6±2.84117.0+37.0***
524.7士4.05152.0±il.0
中割 Ilffl426.6±3.50176.0H8.55##
15剂:Itli524.5 土1.06164.0±21.05#照射组与对照组比较，***p<0. 001 ;给药组与照射组比较#ρ<0· 05，##ρ<0. 01。
观察药物受照小鼠免疫脏器的损伤的作用，剥离实验小鼠胸腺和脾脏，称重后计算免疫脏器指数(脏器重(mg)/体重(g))。结果可见，给药组对胸腺组织损伤有一定的保护作用。结果见表I. 3。表I. 3 二甲双胍对受照小鼠免疫器官损伤保护作用观察
权利要求
1.一种二甲双胍在制备对放疗和/或化疗药物引起的造血免疫细胞损伤起保护作用的药物中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于二甲双胍在制备对放疗引起的长期骨髓抑制起保护作用的药物中的应用。
3.根据权利要求I所述的应用，其特征在于二甲双胍在制备对化疗药物引起的长期骨髓抑制起保护作用的药物中的应用。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于将治疗有效量的二甲双胍与药学上可接受的载体和/或赋形剂混合制成组合物。
5.一种利用二甲双胍降低放疗和/或化疗损伤的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤针对放疗和/或化疗损伤的小鼠进行二甲双胍灌胃给药，给药量二甲双胍125mg/kg-500mg/kg(最优为 250mg/kg),每天一次。
6.根据权利要求5所述的构建方法,其特征在于一种降低放疗损伤的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤照射前24h对C57BL/6小鼠开始灌胃给药，给药量二甲双胍125mg/kg-500mg/kg(最优为250mg/kg),给予小鼠I次137Cs源、射线全身照射，剂量4Gy,剂量率O. 76Gy/min,照射后继续灌胃给药，给药量二甲双胍125mg/kg-500mg/kg (最优为250mg/kg)，每天一次，照射后继续灌胃给药持续7天，即得降低放疗损伤的小鼠模型。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于一种利用二甲双胍降低化疗损伤的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤对ICR小鼠进行二甲双胍250mg/kg灌胃给药，每日一次，共10次，对ICR小鼠腹腔注射顺钼或环磷酰胺，顺钼lmg/kg，每日一次，从第二天开始给药，共给药7次；环磷酰胺50mg/kg,第2天、5天、8天腹腔注射给药，即得降低化疗损伤的小鼠模型。
全文摘要
本发明涉及二甲双胍在对放化疗损伤起保护作用的药物中的应用，作为一个优选的实施方案是，二甲双胍在制备对放疗引起的长期骨髓抑制起保护作用的药物中的应用；作为一个优选的实施方案是，二甲双胍在制备对化疗药物引起的长期骨髓抑制起保护作用的药物中的应用；本发明验证了二甲双胍对照射引起和/或化疗药物引起的造血免疫细胞损伤具有一定的保护作用。
文档编号A61K31/155GK102871991SQ20121041203
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者孟爱民, 许国顺, 吴红英, 王月英, 李德冠, 王小春, 张恒, 路璐, 李程程, 王营营 申请人:中国医学科学院放射医学研究所