抑制神经胶质瘤生长的组合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抑制神经胶质瘤生长的组合物及其应用。所述组合物由提高序列表序列1所示蛋白（PTEN）表达的物质和抑制序列表序列3所示蛋白（B）表达的物质组成。实验证明，恢复蛋白PTEN协同抑制蛋白B的表达与单独恢复蛋白PTEN的表达或单独抑制蛋白B的表达相比，重组胶质瘤细胞系的AKT磷酸化水平明显下调，细胞增殖、集落形成受到明显的抑制，细胞停在G0/G1时期的比例和细胞凋亡率显著提高；移植小鼠体内的胶质瘤在经恢复蛋白PTEN协同抑制蛋白B的表达治疗的第20—48天肿瘤体积没有增长，且肿瘤重量在治疗的第48天几乎为0。本发明为神经胶质瘤提供了一种新的有效的联合治疗方案，具有广阔的应用前景。
【专利说明】抑制神经胶质瘤生长的组合物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抑制神经胶质瘤生长的组合物及其应用。
【背景技术】
[0002]神经胶质瘤，又称胶质细胞瘤，简称胶质瘤，是神经上皮或支持细胞所衍生。脑胶质瘤起源于脑部神经胶质细胞，是成人中最常见的原发性脑肿瘤，占颅脑肿瘤比例的40-50%ο脑部神经胶质细胞由星形细胞(astrocytoma)、室管腔细胞(ependymal)和寡树突神经胶质细胞共同组成。在脑胶质瘤中，起源于星形胶质细胞或星形胶质细胞祖细胞的星形细胞瘤具有最高发病率。根据世界卫生组织的规定标准和病人的存活情况，星形细胞瘤被分为四个等级:纤维性星形细胞瘤(I级)，弥漫性星形细胞瘤(II级)，间变性星形细胞瘤(III级)，多形性胶质母细胞瘤(GBM，IV级)。其中，间变性星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤属于恶性胶质瘤，而且预后不佳。尤其是多形性胶质母细胞瘤，尽管采取手术，放疗以及化疗的联合治疗，病人也只有不到12个月的生存期。
[0003]神经胶质瘤细胞的多药耐药性是化疗失败的最主要原因。研究发现在GBM型脑胶质瘤中，染色体7p的扩增和染色体IOq上的等位基因丢失频繁地发生。更进一步研究表明染色体7p的扩增源于EGFR (epidermal growth factor receptor)蛋白的上调表达而染色体IOq丢失的基因则是肿瘤抑制基因PTEN(phosphatase and tensinhomologue)。EGFR的扩增和PTEN的丢失，导致了 PI3K/AKT信号通路的过度活跃，这可能是GBM高度恶性表型和化疗耐药性的重要原因。因此，PI3K/AKT信号通路的过度激活和脑胶质瘤的形成与发展之间的关系将成为很有吸引力的GBM基因治疗研究内容。
【发明内容】
`[0004]本发明的目的是提供一种抑制神经胶质瘤生长的组合物及其应用。
[0005]所述组合物由如下A)和B)两种物质组成:
[0006]A)在离体细胞中表达PTEN蛋白的物质；
[0007]B)抑制神经胶质瘤细胞中pllO β蛋白表达的物质。
[0008]所述Α)物质可为PTEN蛋白、PTEN蛋白的编码基因或编码PTEN蛋白的载体；
[0009]所述Α)物质和所述B)物质分别独立包装。
[0010]在上述组合物中，所述PTEN蛋白具体可为序列表序列I所示蛋白；所述ρΙΙΟβ蛋白具体可为序列表序列3所不蛋白。
[0011]PTEN蛋白是肿瘤抑制基因PTEN所表达的蛋白，PllO β蛋白是PIK3CB基因所表达的ΡΙ3Κ β亚型脂激酶的一个催化亚单位pllO。
[0012]在上述组合物中，所述A)物质为含有所述PTEN蛋白编码基因的表达盒、重组表达载体、重组细胞或重组病毒；
[0013]所述B)物质为所述pllO β蛋白的抑制剂，该抑制剂可为抑制所述ρΙΙΟβ蛋白表达的干扰RNA、所述干扰RNA的编码基因或含有所述干扰RNA的编码基因的表达盒、重组表达载体或重组细胞；也可为磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂如LY294002或Wortmannin。
[0014]磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)为一种由调节亚单位p85或plOl和催化亚单位pllO组成的脂激酶，通过催化磷脂酰肌醇4，5- 二磷酸(PIP2)磷酸化为磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(PIP3)而激活下游的Akt等从而对细胞的增殖、生存和代谢等起关键作用。
[0015]在上述组合物中，所述A)物质中的所述PTEN蛋白的编码基因为序列表序列2所示的DNA分子；
[0016]所述B)物质中的所述干扰RNA为短发夹RNA或由所述短发夹RNA衍生的小干扰RNA ；
[0017]所述短发夹RNA的核苷酸序列由一个茎环序列及两个分别位于所述茎环序列两侧的反向重复序列组成，所述两个反向重复序列分别为序列表序列5和序列表序列6所示序列。
[0018]在上述组合物中，所述A)物质中的所述重组表达载体是将所述PTEN蛋白编码基因插入载体pRetro-on的BamH I和NotI位点间得到的重组载体；
[0019]所述B)物质中的所述由所述短发夹RNA衍生的小干扰RNA —条链的核苷酸序列如序列表序列5所示，另一条链的核苷酸序列如序列表序列6所示；
[0020]在上述组合物中，所述B)物质中的所述干扰RNA的编码基因为由序列表序列7和序列表序列8的单链DNA组成的双链DNA分子。
[0021]在上述组合物中，所述B)物质中的所述重组表达载体为将所述干扰RNA的编码基因插入载体PRNAT-U6.Ι/Neo的BamH I和Hind III位点间得到的重组载体。
[0022]本发明保护上述任一所`述组合物在制备下述任一所述产品(或药物)中的应用:
[0023]I)降低神经胶质瘤细胞中的AKT磷酸化水平的产品(或药物)；
[0024]2)抑制神经胶质瘤细胞的增殖和/或集落形成的产品(或药物);
[0025]3)抑制神经胶质瘤细胞周期进程(或提高神经胶质瘤细胞停在G0/G1时期的比例)的产品(或药物);
[0026]4)促进神经胶质瘤细胞凋亡的产品(或药物)；
[0027]5)抑制动物体内神经胶质瘤生长的产品(或药物)。
[0028]本发明所述神经胶质瘤或神经胶质瘤细胞为缺失序列表序列I所示蛋白的神经胶质瘤或神经胶质瘤细胞，在本发明的实施例中，所述神经胶质瘤或神经胶质瘤细胞来源于人类U251胶质母细胞瘤细胞株或SHG-44胶质母细胞瘤细胞株。
[0029]本发明还保护抑制所述pllO β蛋白表达的干扰RNA、所述干扰RNA的编码基因或含有所述干扰RNA的编码基因的表达盒、重组表达载体或重组细胞。
[0030]所述干扰RNA可为短发夹RNA或由所述短发夹RNA衍生的小干扰RNA ；
[0031]所述短发夹RNA的核苷酸序列由一个茎环序列及两个分别位于所述茎环序列两侧的反向重复序列组成，所述两个反向重复序列分别为序列表序列5和序列表序列6所示序列；
[0032]所述小干扰RNA —条链的核苷酸序列如序列表序列5所示，另一条链的核苷酸序列如序列表序列6所示；
[0033]所述干扰RNA的编码基因具体可为由序列表序列7和序列表序列8的单链DNA组成的双链DNA分子。[0034]实验证明，恢复蛋白PTEN (序列表序列I所示蛋白)协同抑制PllO β蛋白(序列表序列3所示蛋白，简称蛋白B)的表达与单独恢复蛋白PTEN的表达或单独抑制蛋白B的表达相比，重组胶质瘤细胞系的AKT磷酸化水平明显下调，细胞增殖、集落形成受到明显的抑制，细胞停在G0/G1时期的比例和细胞凋亡率显著提高；移植小鼠体内的胶质瘤在经恢复蛋白PTEN协同抑制蛋白B的表达治疗的第20— 48天肿瘤容积没有增长，且肿瘤重量在治疗的第48天几乎为O。本发明为神经胶质瘤提供了一种新的有效的联合治疗方案，具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1为各重组胶质瘤细胞系中目的基因或蛋白的表达检测。其中，图A为Westernblot检测转染PTEN基因的重组表达载体后的重组胶质瘤细胞系UP中PTEN表达，左侧泳道为对照U251，右侧泳道为UP ;图B为实时荧光定量PCR检测转染PIK3CA基因的RNA干扰重组表达载体后的重组胶质瘤细胞系UA中PIK3CA基因的相对表达量，UC为对照；图C为实时荧光定量PCR检测转染PIK3CB基因的RNA干扰重组表达载体后的重组胶质瘤细胞系Ul和U2中PIK3CB基因的相对表达量，UC为对照。
[0036]图2为Western blot检测重组胶质瘤细胞系中AKT的磷酸化水平。其中，图A为Western blot结果，图B为各重组胶质瘤细胞系中的ρ-ΑΚΤ/ΑΚΤ值相对于对照UPC，中ρ-ΑΚΤ/ΑΚΤ值的百分比。
[0037]图3为培养I一6天时各重组胶质瘤细胞系的细胞存活率。
[0038]图4为各重组胶质瘤细胞系的集落形成分析。其中，图A为克隆形成的荧光照片，标尺代表500 μ m，图B为相对克隆数，**表示两组数据在P < 0.01有极显著差异。
[0039]图5为各重组胶质瘤细胞系锚地依赖性的集落形成分析。其中，图A为克隆形成的结晶紫染色图，图B为相对克·隆数，**表示两组数据在P < 0.01有极显著差异。
[0040]图6为各重组胶质瘤细胞系的细胞周期检测。其中，图A为流式细胞图，图B为不同细胞周期所占比例的柱形统计图。
[0041]图7为各重组胶质瘤细胞系的细胞凋亡检测。其中，图A为经Annexin V-PE试剂处理的流式细胞图；图B为DAPI染色的细胞核形态图，标尺代表250 μ m ;图C为细胞凋亡率的柱形统计图，**表示两组数据在P < 0.01有极显著差异。
[0042]图8为各重组胶质瘤细胞系移植小鼠体内试验结果。其中，图A为移植第48天的小鼠外观；图13为移植第20—48天小鼠体内肿瘤体积变化线形图；图C为移植第48天小鼠体内肿瘤重量的柱形统计图；*表示与UPC’相比差异显著(P < 0.05) 表示与UPC’相比差异极显著(P < 0.01)。
【具体实施方式】
[0043]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0044]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045]下述实施例中的实验均设置三次重复，结果取平均值。
[0046]实施例1、RNA干扰重组表达载体构建
[0047]1、RNA干扰靶序列的选择[0048]I)针对序列表序列3所示蛋白(简称为蛋白B)的全长cDNA序列(如序列表序列4所示，即PIK3CB基因)，选择如下两段DNA序列为RNA干扰抑制序列表序列3所示蛋白表达的靶序列:
[0049]sh-Ι:序列表序列 4 的第 1166-1184 位(SP 5’ -CCACTGGAATTTGATATTA-3 ’ )；
[0050]sh-2:序列表序列 4 的第 439-457 位(B卩 5’ -GGATCCTGAAGTAAATGAA-3’ )；
[0051]序列表序列4中第17位至第3229位为开放阅读框，编码序列表序列3所示的蛋白，该蛋白为PI3K β亚型脂激酶的一个催化亚单位pllO。
[0052]2)针对PI3K α亚型脂激酶的一个催化亚单位pllO (简称为蛋白A)的全长cDNA序列(NCBI号:NM_002645，即PIK3CA基因)，选择如下一段DNA序列为RNA干扰抑制该蛋白表达的靶序列:
[0053]sh-A: 5，-CCACTGGAATTTGATATTA-3，。
[0054]3)对照:不针对任何人类基因，选择如下一段DNA序列为RNA干扰的对照靶序列:
[0055]sh-C: 5，-GTGGACTCTTGAAAGTACTAT-3，。
[0056]2、小干扰 RNA (siRNA)
[0057]根据步骤I的靶序列，抑制蛋白B表达的两种siRNA (siRNA-1和siRNA_2)的序列如下:
[0058]I) siRNA-Ι
[0059]siRNA-1-F:5’ -CCACUGGAAUUUGAUAUUA-3，；
`[0060]siRNA-1-R:5，-UAAUAUCAAAUUCCAGUGG-3，；
[0061]2) siRNA-2
[0062]siRNA-2-F:5’ -GGAUCCUGAAGUAAAUGAA-3’(序列表序列 5 所示)；
[0063]siRNA-2-R:5’ -UUCAUUUACUUCAGGAUCC-3’(序列表序列 6 所示)。
[0064]根据步骤I的靶序列，抑制蛋白A表达的siRNA (siRNA-A)的序列如下:
[0065]3) siRNA-A
[0066]siRNA-A-F:5，-CCACUGGAAUUUGAUAUUA-3，；
[0067]siRNA-A-R:5，-UAAUAUCAAAUUCCAGUGG-3，；
[0068]根据步骤I的靶序列，对照的siRNA (siRNA-C)的序列如下:
[0069]4) siRNA-C
[0070]siRNA-C-F:5，-GUGGACUCUUGAAAGUACUAU-3，；
[0071]siRNA-C-R:5，-AUAGUACUUUCAAGAGUCCAC-3，。
[0072]3、短发夹 RNA (shRNA)
[0073]衍生步骤2所示siRNA的shRNA的序列分别如下(小写字母表示茎环序列，大写字母表示两个短的反向重复序列):
[0074]I) shRNA-Ι (衍生 siRNA-Ι):
[0075]5， -CCACUGGAAUUUGAUAUUAaactcgagttUAAUAUCAAAUUCCAGUGG-3，；
[0076]2) shRNA-2 (衍生 siRNA-2):
[0077]5， -GGAUCCUGAAGUAAAUGAAaactcgagttUUCAUUUACUUCAGGAUCC-3，；
[0078]3) shRNA-A (衍生 siRNA-A):
[0079]5，-CCACUGGMUUUGAUAUUAaactcgagttUMUAUCAMUU(XAGUGG-3，；[0080]4) shRNA-C (衍生 siRNA-C):
[0081 ]5，-GUGGACUCUUGAMGUACUAUaactcgagttAUAGUACUUUCMGAGU(XAC-3，。
[0082]4、编码siRNA及shRNA的DNA分子的设计与合成
[0083]I)以sh-Ι为靶点的表达shRNA-Ι的双链DNA分子(DNA-1)的两条单链DNA序列如下:
[0084]DNA-1-F:
[0085]5’-gatccCCACTGGAATTTGATATTAaactcgagttTAATATCAAATTCCAGTGGttttttggaaa_3，
[0086]DNA-1-R:
[0087]5’-agcttttccaaaaaaCCACTGGAATTTGATATTAaactcgagttTAATATCAAATTCCAGTGG￡-3，
[0088]2)以sh-2为靶点的表达shRNA-2的双链DNA分子(DNA-2)的两条单链DNA序列如下:
[0089]DNA-2-F:
[0090]5’-gatccGGATCCTGAAGTAAATGAAaactcgagttTTCATTTACTTCAGGATCCttttttggaaa-3'(序列表序列7所示)；
[0091]DNA-2-R:
[0092]5’-agcttttccaaaaaaGGATCCTGAAGTAAATGAAaactcgagttTTCATTTACTTCAGGATCC￡-3’(序列表序列8所示)；
[0093]3)以sh-A为靶点的表达shRNA-A的双链DNA分子(DNA-A)的两条单链DNA序列如下:
[0094]DNA-A-F:
[0095]5’-gatccGCCACTGGAATTTGATATTAaactcgagttTAATATCAAATTCCAGTGGttttttggaaa_3
[0096]DNA-A-R:
[0097]5’-agcttttccaaaaaaCCACTGGAATTTGATATTAaactcgagttUAAUAUCAAATTCCAGTGG￡-3，
[0098]4)以sh-C为靶点的表达shRNA-C的双链DNA分子(DNA-C)的两条单链DNA序列如下:
[0099]DNA-C-F:
[0100]5’-gatccGUGGACUCUUGAAAGUACUAUaactcgagttAUAGUACUUUCAAGAGUCCACttttttggaaa-3';
[0101]DNA-C-R:
[0102]5’-agcttttccaaaaaaGUGGACUCUUGAAAGUACUAUaactcgagttAUAGUACUUUCAAGAGUCCAQg-3，。
[0103]5、RNA干扰重组表达载体构建
[0104]I)分别取步骤4中合成的互补的单 链DNA混合，退火获得四种双链DNA分子，分别取这四种双链DNA进行磷酸化处理，获得四种双链DNA反应体；
[0105]2)取载体pRNAT-U6.Ι/Neo(南京金斯瑞生物科技有限公司)先用BamH I和HindIII酶切后，回收PRNAT-U6.Ι/Neo的载体骨架片段；
[0106]3)将步骤2)获得的pRNAT-U6.Ι/Neo的载体骨架片段与步骤I)获得的四种双链DNA反应体分别连接，得到四种RNA干扰重组表达载体pRNA1-sh-1、pRNA1-sh_2、pRNAi_sh_A 和 pRNAi_sh_C ;经测序证实,载体 pRNAi_sh_l 为载体 pRNAT_U6.1/Neo 的 BamH
I和Hind III位点间插入了步骤4的双链DNA分子DNA-1获得的重组载体；载体pRNA1-sh_2为载体pRNAT-U6.Ι/Neo的BamH I和Hind III位点间插入了步骤4的双链DNA分子DNA-2获得的重组载体；载体pRNA1-sh-A为载体pRNAT-U6.Ι/Neo的BamHI和Hind III位点间插入了步骤4的双链DNA分子DNA-A获得的重组载体；载体pRNA1-sh_C为载体pRNAT_U6.1/Neo的BamH I和Hind III位点间插入了步骤4的双链DNA分子DNA-C获得的重组载体。
[0107]实施例2、蛋白PTEN的重组表达载体构建
[0108]将蛋白PTEN (如序列表序列I所不)的编码基因(如序列表序列2所ττΟ插入到多西环素诱导的逆转录病毒表达载体pRetro-on (BD Clontech公司)的BamH I和NotI位点间，获得重组表达载体PTEN/pRetro-on,经测序证实,载体PTEN/pRetro-on是在pRetro-on的BamH I和NotI位点间插入了序列表序列2所示的DNA分子。
[0109]实施例3、恢复蛋白PTEN协同抑制蛋白B的表达对重组胶质瘤细胞中AKT磷酸化水平的影响
[0110]人类U251胶质母细胞瘤细胞株(U251):在中国典型培养物保藏中心细胞库的编号为 3115CNCB00312 ；
[0111]人类SHG-44胶质母细胞瘤细胞株(SHG-44):中国科学院细胞库，目录编号为TCHu48 ；
·[0112]U251和SHG-44均为PTEN缺失的神经胶质瘤细胞株；
[0113]实施例3— 5的重组胶质瘤细胞除特别说明外的培养条件如下:
[0114]培养基:DMEM培养基(Gibco，货号12800-017)，辅以10%热灭活胎牛血清(FBS)，4mM谷氨酰胺,50units/ml青霉素和50 μ g/ml链霉素；
[0115]培养条件:37 °C，5%C02培养箱培养。
[0116]1、稳定重组胶质瘤细胞系的构建
[0117]将实施例2获得的载体PTEN/pRetro-on用Pheonix细胞(Orbingen)包装,取病毒上清液在MOI=I (即感染时病毒与细胞数量的比值为I)下感染U251细胞；感染的细胞在添加I μ g/ml嘌呤霉素的培养基中筛选直到未转染的细胞完全消失，获得了含有载体PTEN/pRetro-on的U251重组胶质瘤细胞系(命名为UP)。
[0118]按Iipofectamine 2000 (Invitrogen)试剂说明书将实施例1步骤5获得的四种 RNA 干扰重组表达载体 pRNA1-sh-1、pRNAi_sh_2、pRNA1-sh-A 和 pRNAi_sh_C 分别按照
2μ g:1 X 106个细胞的比例转染至U251细胞或含有载体PTEN/pRetro-on的U251重组胶质瘤细胞，用添加了 600 μ g/ml G418的培养基筛选稳定表达的转染细胞，获得表1所示的重组胶质瘤细胞系。
[0119]表1.重组胶质瘤细胞系中所含有的载体
[0120]
【权利要求】
1.一种抑制神经胶质瘤生长的组合物，由如下A)和B)两种物质组成: A)在离体细胞中表达PTEN蛋白的物质； B)抑制神经胶质瘤细胞中pllOβ蛋白表达的物质。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于:所述PTEN蛋白为序列表序列I所示蛋白；所述ρΙΙΟβ蛋白为序列表序列3所不蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于: 所述Α)物质为含有所述PTEN蛋白编码基因的表达盒、重组表达载体、重组细胞或重组病毒; 所述B)物质为抑制所述pllO β蛋白表达的干扰RNA、所述干扰RNA的编码基因或含有所述干扰RNA的编码基因的表达盒、重组表达载体或重组细胞。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于: 所述Α)物质中的所述PTEN蛋白的编码基因为序列表序列2所不的DNA分子；所述B)物质中的所述干扰RNA为短发夹RNA或由所述短发夹RNA衍生的小干扰RNA ；所述短发夹RNA的核苷酸序列由一个茎环序列及两个分别位于所述茎环序列两侧的反向重复序列组成，所述两个反向重复序列分别为序列表序列5和序列表序列6所示序列。
5.根据权利要求3或4所述的组合物，其特征在于:` 所述Α)物质中的所述重组表达载体是将所述PTEN蛋白编码基因插入载体pRetro-on的BamH I和NotI位点间得到的重组载体； 所述B)物质中的所述由所述短发夹RNA衍生的小干扰RNA —条链的核苷酸序列如序列表序列5所示，另一条链的核苷酸序列如序列表序列6所示。
6.根据权利要求3-5中任一所述的组合物，其特征在于: 所述B)物质中的所述干扰RNA的编码基因为由序列表序列7和序列表序列8的单链DNA组成的双链DNA分子。
7.根据权利要求3-6中任一所述的组合物，其特征在于: 所述B)物质中的所述重组表达载体为将所述干扰RNA的编码基因插入载体PRNAT-U6.Ι/Neo的BamH I和Hind III位点间得到的重组载体。
8.权利要求1-7中任一所述组合物在制备下述任一所述产品中的应用: O降低神经胶质瘤细胞中的AKT磷酸化水平的产品； 2)抑制神经胶质瘤细胞的增殖和/或集落形成的产品； 3)抑制神经胶质瘤细胞周期进程的产品； 4)促进神经胶质瘤细胞凋亡的产品； 5 )抑制动物体内神经胶质瘤细胞生长的产品。
9.抑制pllOβ蛋白表达的干扰RNA、所述干扰RNA的编码基因或含有所述干扰RNA的编码基因的表达盒、重组表达载体或重组细胞； 所述ρΙΙΟβ蛋白具体可为序列表序列3所不蛋白。
10.根据权利要求9所述的干扰RNA，其特征在于:所述干扰RNA为短发夹RNA或由所述短发夹RNA衍生的小干扰RNA ； 所述短发夹RNA的核苷酸序列由一个茎环序列及两个分别位于所述茎环序列两侧的反向重复序列组成，所述两个反向重复序列分别为序列表序列5和序列表序列6所示序列； 所述小干扰RNA —条链的核苷酸序列如序列表序列5所示，另一条链的核苷酸序列如序列表序列6所示； 所述干扰RNA的编码基因具体可为由序列表序列7和序列表序列8的单链DNA组成的双链DNA分子。`
【文档编号】A61P35/00GK103784962SQ201210429837
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年11月1日 优先权日:2012年11月1日
【发明者】黄来强, 陈红波, 申晓萌, 周兰贞, 郑义, 梅林 , 王丽君 申请人:清华大学深圳研究生院