专利名称：具有抑制内皮细胞生长活性的重组EDI-8t蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程药物领域，具体涉及重组内皮细胞生长抑制剂，其基因工程表达及临床应用。
背景技术：
胶原蛋白(Collagen)又叫胶原质，是组成各种细胞外间质的聚合物，是细胞外基质最重要的组成成份，同时也是动物结构组织最主要的构造性蛋白质，主要是以不溶性纤维蛋白的形式存在。在人体的组成中，胶原蛋白约占蛋白质总量的33%，能保证并连结各种组织支撑起人体的结构。近年来，胶原蛋白来源的血管生长抑制研究正正逐渐成为热点。1997年哈佛医学院的Folkman教授和他的团队发现了第一个胶原蛋白来源的内皮细胞生长抑制剂 angiostatin(0' Reilly MS, Holmgren L, Shing Y, Chen C, Rosenthal RA, Moses Μ, Lane WS et al.. Cell ,1994，79 (2) :315_328)，随后另一个抑制分子endostatin也被从尿液中提取(0，Reilly MS，Boehm T, Shing Y，Fukai N, VasiosG, Lane WS, Flynn E, Birkhead JR, Olsen BR,Folkman J. Cell, 1997,88(2) :277_285)。Angiostatin 禾口 endostatin 这两个内皮抑制剂分子的发现和动物实验的成功掀开了这个领域的研究热潮。随后一系列胶原蛋白来源的内皮细胞抑制剂被发现，如来源于胶原蛋白XV的Restin(Ramchandran R5Dhanabal M, Volk R, Waterman MJ,Segal Μ,Lu H,Knebelmann B,Sukhatme VP. BiochemBiophys Res Commun, 1999,255(3) :735_739)、来源于胶原蛋白 IV 的 canstatin(Kamphaus GD,Colorado PC, Panka DJ, Hopfer H, Ramchandran R, Torre A, Maeshima Y, Mier Jff, Sukhatme VP, Kalluri R.J Biol Chem，2000，275 (2) :1209_1215)等。这些分子均能专一性地抑制内皮细胞的生长，但是对正常细胞如成纤维细胞和肿瘤细胞的生长没有抑制活性。这种通过抑制血管生成抑制实体瘤的生长的方法，为治疗肿瘤提供了一种新的思路，常被形象地称作“饿死癌细胞”的疗法[Folkman J. N Eng J Med，1971，285 (21)，1182-1186]。这种新思路相比以前的各种肿瘤治疗方法具有许多优点。它具有广谱的治疗范围，对绝大多数肿瘤的生长都有效，且不容易产生抗药性。目前，世界首个也是唯一一个内皮细胞抑制剂类抗癌药-恩度(endostatin)已在我国上市，取得了不错的市场反应。然而，恩度对于内皮细胞的抑制作用还比较有限，因此，本领域还需要进一步进行研究，以开发改进的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组的内皮细胞生长抑制剂，其基因工程表达及临床应用。在本发明的第一方面，提供一种分离的人内皮生长抑制蛋白-8(EDI-8t)多肽，该多肽选自下组(a)如SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽；
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(b)将SEQ ID NO 2氨基酸序列经过一个或多个(如1_20个，更佳地1_10个，更佳地1-5个，更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制内皮细胞生长功能的由(a)衍生的多肽。在一个优选例中，该多肽是如SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽。在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。在一个优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的多肽。在另一优选例中，该多核苷酸的序列如SEQ ID NO 1所示。在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述的载体是pPIC9。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体。在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞。更佳地，所述的宿主细胞选自 GSl 15 和 / 或 SMDl 168。在本发明的另一方面，提供一种多肽的制备方法，该方法包含(a)培养所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出人内皮生长抑制蛋白-8(rhEDI_8t)多肽。在本发明的另一方面，提供所述的多肽在制备抑制内皮细胞生长和/或迁移、或抑制肿瘤生长和/或转移的药物组合物中的用途。在另一优选例中，所述的肿瘤包括(但不限于)肝癌、肺癌。在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，它含有安全有效量的所述的多肽以及药学上可接受的载体。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示了用PCR方法得到的EDI_8t基因DNA电泳图。图2显示了重组表达菌株GpEDI_8t的发酵上清电泳图。图3显示了 EDI_8t蛋白纯品SDS-PAGE电泳图。图4显示了 EDI-St蛋白抑制内皮细胞生长的曲线图。图5显示了 EDI_8t蛋白对内皮细胞迁移的抑制。图6显示了流式细胞术验证EDI-St蛋白纯品促使内皮细胞发生凋亡。图7显示了 EDI-St蛋白对裸鼠表皮接种的肝癌细胞生长速度的影响。
具体实施例方式在本发明中，术语“EDI-8T蛋白，，、“EDI-8T多肽”或“内皮生长抑制蛋白EDI-8T” 可互换使用，都指具有人内皮生长抑制蛋白EDI-8T氨基酸序列(SEQID NO 2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的内皮生长抑制蛋白EDI-8T。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的EDI-8T蛋白或多肽”是指EDI-8T多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化EDI-8T蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。EDI-8T 多肽的纯度能用氨基酸序列分析。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括人EDI-8T蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、 “衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人EDI-8T蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽， 或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。 根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语“人EDI-8T多肽”指具有人EDI-8T蛋白活性的SEQ ID NO 2序列的多肽。该术语还包括具有与人EDI-8T蛋白相同功能的、SEQ ID NO :2序列的变异形式。 这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地 1-20个，更佳地1-10个，更佳地1-5个，更佳地1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人EDI-8T蛋白的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人EDI-8T DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人EDI-8T多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人EDI-8T 多肽或其片段的融合蛋白(如SEQID N0:3所示的融合蛋白，其羧基端携带6XHis标签)。 除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人EDI-8T多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人EDI-8T多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。发明还提供人EDI-8T蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人EDI-8T多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，“人EDI-8T蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO 2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。表 权利要求
1.一种分离的人内皮生长抑制蛋白-8多肽，其特征在于，该多肽选自下组(a)如SEQID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQID NO :2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制内皮细胞生长功能的由(a)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是如SEQID NO :2氨基酸序列的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQIDN0:2所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列如SEQIDN0:1所示。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出人内皮生长抑制蛋白_8多肽。
9.权利要求1所述的多肽在制备抑制内皮细胞生长和/或迁移、或抑制肿瘤生长和/ 或转移的药物组合物中的用途。
10.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及具有抑制内皮细胞生长活性的重组EDI-8t蛋白。本发明首次分离到该EDI-8t蛋白，并且验证了其抑制内皮细胞生长的功能以及抑制肿瘤生长的功能。因此，所述的EDI-8t蛋白具有良好的临床应用前景。
文档编号C12N5/10GK102212126SQ20101014161
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月8日 优先权日2010年4月8日
发明者丁红珍, 冯宝山, 周庆玮, 张倩, 杜鹏, 甘人宝, 钱悦 申请人:上海普洛康裕药物研究院有限公司