一种龙胆苦苷原料的制备方法
【专利摘要】本发明属于医药【技术领域】，本发明公开了一种龙胆苦苷原料的制备方法，该方法采用秦艽水提取后，大孔树脂纯化，硅胶柱层析，静置析晶，得到龙胆苦苷原料。该方法得到的龙胆苦苷原料中马钱酸的含量小于0.5％，该方法得到的龙胆苦苷原料具有更好的安全性。
【专利说明】一种龙胆苦苷原料的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药【技术领域】，具体涉及一种龙胆苦苷原料的制备方法。
【背景技术】
[0002]龙胆苦苷从秦艽等药材提取精制而成中药有效成分，国内外有关龙胆苦苷药效学方面研究较多:1、龙胆苦苷对化学和免疫致小鼠肝损伤的抑制作用，龙胆苦苷对CCl4和脂多糖/芽孢杆菌致小鼠鼠肝炎的影响。小鼠每天一次腹腔注射龙胆苦苷(30~60mg/Kg.d)，能抑制口服CCl4及静脉注射芽孢杆菌引起的转氨酶的升高。2、龙胆苦苷对大鼠肝细胞实验性保护作用的病理观察，龙胆苦苷在浓度为1.4X KT1~1.4X10_2mg/ml时，能抗0:14致肝损伤，即保肝作用，并呈良好的量效关系。3、增加大鼠胆汁分泌，促进胆囊收缩。4龙胆苦苷对化学和免疫性诱导的肝损伤的抑制作用，采用两种药理模型，即
诱导的肝炎。在造模型之前，连续5天给予小鼠龙胆苦苷(30~60mg/kg.d)，明显抑制出CCl4和诱导的血清中转氨酶的升高。在另一组实验中，小鼠在灌注BCG7天给予LPS，血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活力增强，在LPS给药前，腹腔注射龙胆苦苷(60mg/kg.d)连续5天，血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶水平在4~8h期间明显降低，给予龙胆苦苷后，明显抑制血清中TNF的产生，表明龙胆苦苷通过抑制TNF，而抑制肝炎。5龙胆苦苷保肝作用，动物试验研究表明龙胆苦苷能明显促进豚鼠肝组织的修复，对豚鼠同种免疫性肝损伤具有明显的保护作用。龙胆苦苷给药后，胆红素分泌量显著增高，表明具有明显利胆作用。龙胆苦苷能明显降低模型小鼠的ALT、AST，且呈良好的量效关系，还能增加肝组织GSH-Px的活力；大鼠口服龙胆苦苷后龙胆苦苷能增加胆汁中总胆红素、游离胆红素的浓度。
[0003]总之，秦艽药材在古代都作为治疗黄疸的要药。主要成分是龙胆苦苷。现代药理学研究表明它具有保肝利胆抗炎的作用，几乎无毒，有着扎实的实验研究。
【发明内容】
[0004]基于上述原因， 申请人:通过科学的试验，研究确定新的龙胆苦苷原料的制备方法，该方法采用水提取后，大孔树脂纯化，硅胶柱层析，静置析晶，得到龙胆苦苷原料，该方法得到的龙胆苦苷原料中马钱酸的含量小于0.5%，该方法得到的龙胆苦苷原料具有更好的安全性。
[0005]本发明所述的马钱酸为马钱苷酸、落干酸。
[0006]本发明通过下述方案实现的。
[0007]—种龙胆苦苷原料的制备方法，该方法将秦艽或龙胆草水提取后，大孔树脂纯化，硅胶柱层析，得到龙胆苦苷原料。
[0008]上述所述秦艽提取方法为:取秦艽，加入药材重量8-10倍量的水，提取3次，每次20-40分钟，合并提取液，提取液浓缩，浓缩至60°C下相对密度为1.05-1.10，得到浓缩液。
[0009]上述所述的大孔树脂纯化方法为:取浓缩液，过滤，滤液上DlOl型大孔树脂，用2-6倍柱体积的水洗脱，洗脱液弃去，再用柱体积5-8倍、浓度为25% -35%的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽，浓缩至药材量0.20-0.25倍，得到浸膏。
[0010]上述所述的硅胶柱层析的方法为:取浸膏，加入浸膏重量0.6-0.7倍的硅胶，混合均匀，上硅胶柱，用体积比为1: 1-3: 1-3的乙酸乙酯、乙醇和水的流动相洗脱，洗脱至薄层检测无龙胆苦苷，收集洗脱液，浓缩至洗脱液体积1/3-1/2，静置析晶，过滤，滤饼用乙醇洗涤，干燥，得到龙胆苦苷原料。
[0011]上述所述的硅胶柱层析的方法为:取浸膏，加入浸膏重量0.6-0.7倍的硅胶，混合均匀，上硅胶柱，用体积比为1: 2: 2的乙酸乙酯、乙醇和水的流动相洗脱，洗脱至薄层检测无龙胆苦苷，收集洗脱液，浓缩至洗脱液体积1/3-1/2，静置析晶，过滤，滤饼用乙醇洗涤，干燥，得到龙胆苦苷原料。
[0012]上述所述的一种龙胆苦苷原料的制备方法得到龙胆苦苷原料制备的药物制剂。
[0013]上述所述的药物制剂，其中药物制剂包括口服制剂。
[0014]上述所述的药物制剂，其中药物制剂包括注射制剂。
[0015]本发明发明目的是为了得到一种可用于药用的龙胆苦苷原料。
[0016]本发明发明目的为了得到一种含有马钱酸的含量低于0.5%的龙胆苦苷原料。
[0017]本发明制备方法得到的龙胆苦苷原料，具有更好的安全性。
[0018]制备实施例
[0019]实施例1
[0020]取秦艽，加入药材重量8倍量的水，提取3次，每次40分钟，合并提取液，提取液浓缩，浓缩至60°C下相对密度为1.05，得到浓缩液。
[0021]取浓缩液，过滤，滤液上DlOl型大孔树脂，用2倍柱体积的水洗脱，洗脱液弃去，再用柱体积5倍、浓度为35%的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽，浓缩至药材量0.25倍，
得到浸膏。
[0022]取浸膏，加入浸膏重量0.6倍的硅胶，混合均匀，上硅胶柱，用体积比为1:1:1的乙酸乙酯、乙醇和水的流动相洗脱，洗脱至薄层检测无龙胆苦苷，收集洗脱液，浓缩至洗脱液体积1/3，静置析晶，过滤，滤饼用乙醇洗涤，干燥，得到龙胆苦苷原料。检测原料中龙胆苦苷含量99.1 %，马钱酸含量0.2%。
[0023]实施例2
[0024]取秦艽，加入药材重量9倍量的水，提取3次，每次30分钟，合并提取液，提取液浓缩，浓缩至60°C下相对密度为1.08，得到浓缩液。 [0025]取浓缩液，过滤，滤液上DlOl型大孔树脂，用4倍柱体积的水洗脱，洗脱液弃去，再用柱体积6倍、浓度为30%的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽，浓缩至药材量0.22倍，
得到浸膏。
[0026]取浸膏，加入浸膏重量0.65倍的硅胶，混合均匀，上硅胶柱，用体积比为1: 2: 2的乙酸乙酯、乙醇和水的流动相洗脱，洗脱至薄层检测无龙胆苦苷，收集洗脱液，浓缩至洗脱液体积1/2，静置析晶，过滤，滤饼用乙醇洗涤，干燥，得到龙胆苦苷原料。检测原料中龙胆苦苷含量99.5%,马钱酸含量未检出。
[0027]实施例3
[0028]取秦艽，加入药材重量10倍量的水，提取3次，每次40分钟，合并提取液，提取液浓缩，浓缩至60°C下相对密度为1.10，得到浓缩液。[0029]取浓缩液，过滤，滤液上DlOl型大孔树脂，用6倍柱体积的水洗脱，洗脱液弃去，再用柱体积8倍、浓度为35 %的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽，浓缩至药材量0.25倍，
得到浸膏。
[0030]取浸膏，加入浸膏重量0.7倍的硅胶，混合均匀，上硅胶柱，用体积比为1: 3: 3的乙酸乙酯、乙醇和水的流动相洗脱，洗脱至薄层检测无龙胆苦苷，收集洗脱液，浓缩至洗脱液体积1/2，静置析晶，过滤，滤饼用乙醇洗涤，干燥，得到龙胆苦苷原料。检测原料中龙胆苦苷含量99.0 %，马钱酸含量0.2%。
[0031]实施例4
[0032]取秦艽，加入药材重量8倍量的水，提取3次，每次25分钟，合并提取液，提取液浓缩，浓缩至60°C下相对密度为1.08，得到浓缩液。
[0033]取浓缩液，过滤，滤液上DlOl型大孔树脂，用5倍柱体积的水洗脱，洗脱液弃去，再用柱体积8倍、浓度为25 %的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽，浓缩至药材量0.20倍，
得到浸膏。
[0034]取浸膏，加入浸膏重量0.7倍的硅胶，混合均匀，上硅胶柱，用体积比为1:1: 2的乙酸乙酯、乙醇和水的流动相洗脱，洗脱至薄层检测无龙胆苦苷，收集洗脱液，浓缩至洗脱液体积1/3，静置析晶，过滤，滤饼用乙醇洗涤，干燥，得到龙胆苦苷原料。检测原料中龙胆苦苷含量99.3 %，马钱酸含量0.1%。
[0035]实施例5
[0036]取秦艽，加入药材·重量10倍量的水，提取3次，每次35分钟，合并提取液，提取液浓缩，浓缩至60°C下相对密度为1.09，得到浓缩液。
[0037]取浓缩液，过滤，滤液上DlOl型大孔树脂，用5倍柱体积的水洗脱，洗脱液弃去，再用柱体积7倍、浓度为35%的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽，浓缩至药材量0.20倍，
得到浸膏。
[0038]取浸膏，加入浸膏重量0.6倍的硅胶，混合均匀，上硅胶柱，用体积比为1: 2: 2的乙酸乙酯、乙醇和水的流动相洗脱，洗脱至薄层检测无龙胆苦苷，收集洗脱液，浓缩至洗脱液体积1/2，静置析晶，过滤，滤饼用乙醇洗涤，干燥，得到龙胆苦苷原料。检测原料中龙胆苦苷含量99.2 %，马钱酸含量0.1%。
[0039]实施例6
[0040]取秦艽，加入药材重量10倍量的水，提取3次，每次25分钟，合并提取液，提取液浓缩，浓缩至60°C下相对密度为1.05，得到浓缩液。
[0041]取浓缩液，过滤，滤液上DlOl型大孔树脂，用6倍柱体积的水洗脱，洗脱液弃去，再用柱体积5倍、浓度为35%的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽，浓缩至药材量0.22倍，
得到浸膏。
[0042]取浸膏，加入浸膏重量0.65倍的硅胶，混合均匀，上硅胶柱，用体积比为1: 2: 2的乙酸乙酯、乙醇和水的流动相洗脱，洗脱至薄层检测无龙胆苦苷，收集洗脱液，浓缩至洗脱液体积1/3，静置析晶，过滤，滤饼用乙醇洗涤，干燥，得到龙胆苦苷原料。检测原料中龙胆苦苷含量为99.2 %，马钱酸含量0.1%。
[0043]上述任一实施例得到龙胆苦苷原料制备的药物制剂。所述的药物制剂包括口服制剂。所述药物制剂包括注射制剂。[0044]实施例1 的 LD50 为 2814mg/kg。
[0045]龙胆苦苷原料中龙胆苦苷含量为99.0%，马钱酸含量0.5%, LD50为2103mg/kg，该原料LD50低于2500mg/kg。
[0046]上述原料按照下述检测分析方法进行检测
[0047]1、龙胆苦苷检测方法[0048]照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。
[0049]色谱条件与系统适用性实验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(3: 7)为流动相；检测波长为270nm。理论板数按龙胆苦苷峰计算，应不低于3000。
[0050]对照品溶液的制备精密称取龙胆苦苷对照品适量，加流动相制成每Iml含0.5mg的溶液，即得。
[0051]供试品溶液的制备精密称取本品适量，加流动相制成每Iml含0.5mg的溶液，即得。
[0052]测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0053]2、马钱酸检测方法
[0054]照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。
[0055]色谱条件与系统适用性实验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.5%乙酸水(25: 75)为流动相；检测波长为238nm。
[0056]对照品溶液的制备精密称取马钱酸对照品适量，加流动相制成每Iml含0.5mg的溶液，即得。
[0057]供试品溶液的制备精密称取本品适量，加流动相制成每Iml含0.5mg的溶液，即得。
[0058]测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0059]所述实施例包括但不限于上述。
【权利要求】
1.一种龙胆苦苷原料的制备方法，其特征在于将秦艽水提取后，大孔树脂纯化，硅胶柱层析，静置析晶，得到龙胆苦苷原料。
2.根据权利要求1所述的一种龙胆苦苷原料的制备方法，其中秦艽提取方法为:取秦艽，加入药材重量8-10倍量的水，提取3次，每次20-40分钟，合并提取液，提取液浓缩，浓缩至60°C相对密度为1.05-1.10，得到浓缩液。
3.根据权利要求1所述的一种龙胆苦苷原料的制备方法，其中大孔树脂纯化方法为:取浓缩液，过滤，滤液上DlOl型大孔树脂，用2-6倍柱体积的水洗脱，洗脱液弃去，再用柱体积5-8倍、浓度为25% -35%的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽，浓缩至药材量0.20-0.25倍，得到浸膏。
4.根据权利要求1所述的一种龙胆苦苷原料的制备方法，其中硅胶柱层析的方法为:取浸膏，加入浸膏重量0.6-0.7倍的硅胶，混合均匀，上硅胶柱，用体积比为1: 1-3: 1-3的乙酸乙酯、乙醇和水的流动相洗脱，洗脱至薄层检测无龙胆苦苷，收集洗脱液，浓缩至洗脱液体积1/3-1/2，静置析晶，过滤，滤饼用乙醇洗涤，干燥，得到龙胆苦苷原料。
5.根据权利要求1所述的一种龙胆苦苷原料的制备方法，其中硅胶柱层析的方法为:取浸膏，加入浸膏重量0.6-0.7倍的硅胶，混合均匀，上硅胶柱，用体积比为1: 2: 2的乙酸乙酯、乙醇和水的流动相洗脱，洗脱至薄层检测无龙胆苦苷，收集洗脱液，浓缩至洗脱液体积1/3-1/2，静置析晶，过滤，滤饼用乙醇洗涤，干燥，得到龙胆苦苷原料。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种龙胆苦苷原料的制备方法得到龙胆苦苷原料制备的药物制剂。
7.根据权利要求6所述的药物制剂，其中药物制剂包括口服制剂。·
8.根据权利要求6所述的药物制剂，其中药物制剂包括注射制剂。
【文档编号】A61P1/16GK103848875SQ201210499853
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年11月30日 优先权日:2012年11月30日
【发明者】朱吉满, 王禹, 夏瑞雪, 阎文君 申请人:哈尔滨誉衡药业股份有限公司