专利名称：人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法
技术领域：
本发明涉及一种人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法，以及利用该诱导方法得到的角膜内皮细胞作为种子细胞用于组织工程角膜构建及内皮移植的用途，属于组织工程及眼科领域。
背景技术：
角膜内皮细胞位于角膜最内层呈六边形结构单层排列，对于维持角膜透明及其正常生理功能具有十分重要的意义。人角膜内皮细胞缺乏增殖能力，受损后主要依赖损伤区周边细胞的扩展和移行进行修复，当细胞密度小于500-800个/mm2时则会引起角膜内皮功能失代偿，导致角膜持续水肿失去透明性，表现为大泡性角膜病变，患者视力受损并出现眼磨、畏光、流泪等不适症状。感染、炎症、外伤(机械伤、化学伤、产伤、激光射线等)、眼部手术(白内障手术，抗青光眼手术，及其他眼内操作如前房异物取出等)、遗传性疾病、代谢性疾 病等都可引起内皮细胞损伤，受损到一定程度导致大泡性角膜病变，此时恢复视力、改善症状的唯一有效途径是角膜移植。但是角膜供体来源匮乏是全世界面临的难题，极大地限制了角膜移植手术的开展，使众多角膜病患者不能得到及时医治，只能在痛苦中等待角膜材料，带来极大的社会负担。近年来，随着国家复明工程的推进以及各地区医疗水平的不断提高，白内障、抗青光眼等手术得以广泛开展，随之而来的术中内皮受损，术后内皮细胞功能失代偿问题日显严峻。因此，体外获得大量具有正常功能的人角膜内皮细胞用于临床替代病变受损的角膜内皮具有重要的临床实践意义。人们一直致力于探索体外大规模扩增人角膜内皮细胞的方法。早期研究人员利用血管内皮细胞替代人角膜内皮细胞，能够在一定时间内维持角膜透明性，但要长期保持角膜透明及其生物安全性需要进一步实验验证。随着研究深入，人们尝试诱导前体细胞或祖细胞向人角膜内皮样细胞分化，比如人脐静脉内皮细胞具有祖细胞特性，将其移植到眼内在角膜基质和房水微环境的诱导下，细胞形态发生内皮样变化，同时角膜水肿减轻，表明其具有一定的内皮泵功能。有报道利用共培养的方法将骨髓内皮祖细胞诱导分化为角膜内皮样细胞，诱导细胞移植后角膜部分恢复透明。此外，近年来多个实验室研究发现在角膜基质、周边部内皮、小梁网以及过渡区内存在角膜内皮前体细胞，如能将这些细胞分离提纯，将为角膜内皮细胞体外诱导提供新的细胞来源。虽然人们进行了大量实验研究，期望实现人角膜内皮细胞的体外大规模扩增，但目前人们仍未找到体外获取具有正常功能的人角膜内皮细胞的方法。追溯人体发育过程，所有的体细胞均来源于胚胎干细胞。1998年人们成功实现了胚胎干细胞的分离培养。胚胎干细胞作为全能干细胞具有强大自我更新能力和分化能力，理论上可以分化为所有类型的成体细胞。目前已有报道成功诱导人胚胎干细胞分化为神经嵴干细胞、间充质干细胞以及脂肪细胞、神经元细胞和成骨细胞等终末分化细胞。人胚胎发育过程中，角膜内皮细胞来源于神经嵴干细胞，目前人们原代培养鼠神经嵴干细胞通过一定诱导条件使其分化为鼠角膜内皮细胞。涉及到伦理学争议，我们尚无法通过原代培养的方法获取人神经嵴干细胞，从而阻碍了人角膜内皮细胞的诱导分化。因此，我们期望诱导人胚胎干细胞分化为人神经嵴干细胞。有研究表明，将人胚胎干细胞与胚胎鼠颅骨基质细胞(PA6)共培养，利用基质细胞的诱导活性成功诱导出人神经嵴干细胞；角膜基质细胞具有很强的增殖能力在体外可以大量扩增。
发明内容
针对上述现有技术，基于现有技术中的研究，本发明提供了一种人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法。本发明利用人角膜基质细胞诱导人胚胎干细胞转化为神经嵴干细胞，从而避免了动物细胞成分的污染，提高了生物安全性；再将诱导分化得到的人神经嵴干细胞进一步诱导转变为人角膜内皮细胞。该过程模拟人角膜内皮细胞胚胎发育，诱导出的细胞理论上最接近正常人角膜内皮细胞。本发明还将诱导分化人胚胎干细胞获得的人角膜内皮细胞应用于角膜内皮功能失代偿动物模型，为进一步临床应用奠定了基础。本发明是通过以下技术方案实现的·一种人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法，步骤如下(I)人角膜基质成纤维细胞的原代培养将不适合用于角膜移植的新鲜人角膜环浸于含100U/ml青霉素-100U/ml链霉素的平衡盐溶液冲洗消毒,置于倒置显微镜下,上皮刀刮除角膜上皮，显微镊子撕除后弹力层及内皮，剩余角膜基质用显微剪剪成ImmX Imm组织块，均匀贴壁于培养皿，待贴壁牢固后加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37°C、5%C02孵箱内孵育培养，每3天更换一次培养基；培养7天发现部分基质细胞游出，10天左右，剔除组织块，继续培养7天，倒置显微镜下观察待细胞铺满培养皿底部70% 80%时I :2传代培养；传代培养至第四代，加入上述培养基及丝裂霉素C(加入后，丝裂霉素C的终浓度为10ug/ml，丝裂霉素C可随培养基一起加入，也可单独加入)，抑制2小时，获得人角膜基质成纤维细胞层；所述含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基是在普通的DMEM/F12培养基基础上添加胎牛血清制成的，添加后，胎牛血清占总液体量的10% (在本专利申请中，如无特别说明，溶液百分比均表示添加物在终溶液中的体积分数);(2)常规原代培养小鼠胚胎成纤维细胞，取其3 4代作为饲养层，采用人胚胎干细胞培养基常规培养人胚胎干细胞，机械法分选形态状态良好的人胚胎干细胞克隆团，按照8 12个克隆/cm2密度接种于步骤(I)制备的人角膜基质成纤维细胞层上，采用不含bFGF的人胚胎干细胞培养基(在不含bFGF的培养环境下，有利于人胚胎干细胞进一步分化)培养7天，人胚胎干细胞分化成菊形团，机械法将菊形团从人角膜基质成纤维细胞层分离移至lOug/ml纤维连接蛋白包被的培养瓶内，采用神经嵴干细胞培养基继续培养7天，流式细胞仪分选出P75(+)细胞(人神经嵴干细胞)；所述人胚胎干细胞培养基是在DMEM knock out基础培养基上添加以下物质制成的knock out血清替代物,巯基乙醇,谷氨酰胺，非必需氨基酸(购自美国Invitrogen公司，货号11140)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);添加后，knock out血清替代物占总液体量的20% (体积分数)，巯基乙醇的浓度为0. ImM，谷氨酰胺的浓度为0. ImM，非必需氨基酸的浓度为0. ImM，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为4ng/ml ；
所述不含bFGF的人胚胎干细胞培养基是指未添加bFGF的人胚胎干细胞培养基(其它成分如上述);所述形态状态良好的人胚胎干细胞是指圆形或类圆形、边缘光滑、细胞排列紧密均质、未分化的人胚胎干细胞；所述神经嵴干细胞培养基是在DMEM/F12培养基上添加以下物质制成的B27，ITS, EGF, bFGF和NGF ;添加后各物质的终浓度分别为B27占总液体量的2%，ITS占总液体量的 l%，EGF20ng/ml，bF GF 10ng/ml, NGF 10ng/ml ；(3)人神经嵴干细胞诱导分化为人角膜内皮细胞将步骤(2)分选出的人神经嵴干细胞用人角膜内皮细胞条件培养基重悬，加入经10ug/ml层粘连蛋白/10ug/ml硫酸软骨素包被的培养瓶内，置于37°C、5%C02孵箱孵育培养，隔天更换人角膜内皮细胞条件培养基，倒置显微镜下观察细胞形态由梭形逐渐变为多边形，至10天左右细胞基本长满，互相间形成紧密连接呈多边形单层排列，体外光学显微镜观察、实时定量聚合酶链式反应、免疫荧光等证实诱导细胞具有与正常人角膜内皮细胞相似的形态和表型，诱导出的人角膜内皮细胞增殖能力类似正常人角膜内皮细胞，体外最多能传I 2代。所述人角膜内皮细胞条件培养基是通过以下方法制备得到的(I)人角膜内皮细胞B4G12细胞系的培养将装有B4G12细胞的冻存管从超低温冰箱取出，迅速转移至37°C水浴锅内将管内冰块溶解，将冻存管内细胞悬液移至15ml离心管内，加入5mlB4G12细胞培养基，1000转/分钟离心5分钟后弃上清，再加入4ml B4G12细胞培养基重悬细胞沉淀，最后将细胞加入10ug/ml层粘连蛋白/10ug/ml硫酸软骨素包被的培养瓶内，采用B4G12细胞培养基培养，隔日换液；所述B4G12细胞培养基是在人内皮无血清培养基(购自美国Invitrogen公司，货号11111)的基础上添加10ng/mlbFGF制成的；(2)条件培养基的制备倒置显微镜下观察B4G12细胞生长，至其铺满培养瓶底部70 90%满时，更换新鲜培养基继续培养12小时，收集细胞培养上清液，用O. 22 μ m滤器过滤后-80°C保存备用；待收集完成后，将该收集的上清液与含有10%胎牛血清DMEM/F12培养基按照体积比3 1的比例混合配制成上清液浓度为75%的人角膜内皮细胞条件培养基，
4°C保存备用。本发明得到的角膜内皮细胞，可以作为种子细胞用于组织工程角膜构建及移植。本发明建立了一套高效可行的人胚胎干细胞定向分化为人角膜内皮细胞的诱导方案，能够得到形态结构及增殖能力与正常人角膜内皮细胞类似的人角膜内皮细胞，体外最多能传I 2代。经试验证明，将该诱导分化获取的角膜内皮细胞移植到恒河猴角膜内皮功能失代偿眼内，其在体内可以发挥内皮细胞功能，为进一步用于临床奠定了实验基础。
图I :人角膜基质成纤维细胞原代培养，其中，a :人角膜基质组织块贴壁培养7天，倒置显微镜下观察，部分基质细胞从组织块游出，呈梭形。b :人角膜基质成纤维细胞传代培养，第4代密度达80%,呈长梭形,趋向同一方向生长。图2 :人胚胎干细胞，其中，a :未分化的人胚胎干细胞形态为圆形或类圆形、边缘光滑、细胞排列紧密均质。b :诱导分化的人胚胎干细胞接种到人角膜基质成纤维细胞层上的胚胎干细胞培养7天，分化形成菊形团。图3 :人神经嵴干细胞诱导分化为人角膜内皮细胞，其中，a :条件培养基培养人神经嵴干细胞7天，部分细胞形成角膜内皮细胞形态多边形或六边形。b :条件培养基培养人神经嵴干细胞10天，形成典型的角膜内皮形态，呈六边形结构单层紧密排列。图4:诱导分化获取的人角膜内皮细胞移植到恒河猴角膜内皮功能失代偿眼内3个月，行激光角膜共聚焦显微镜检查示术眼角膜后表面形成内皮细胞结构。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例I.人角膜基质成纤维细胞的原代培养获取临床不适合用于角膜移植的新鲜捐献人角膜环，将其浸于含100U/ml青霉素-100U/ml链霉素的平衡盐溶液中反复冲洗3次，每次10分钟，置于倒置显微镜下，上皮刀刮除角膜上皮，显微镊子撕除后弹力层及内皮，剩余角膜基质用平衡盐溶液反复冲洗清除残留的角膜上皮及内皮碎片，显微剪将其剪成ImmX Imm组织块，均匀贴壁于培养皿，待贴壁牢固后加入含有10%胎牛血清DMEM/F12培养基，置于37°C、5%C02孵箱内孵育培养。每3天更换一次培养基，培养7天发现部分基质细胞游出(如图Ia所示)，10天左右，置于倒置显微镜下，显微镊仔细剔除组织块，继续培养7天，倒置显微镜下观察待细胞铺满培养瓶底部70% 80%时，I 2传代培养；传代培养至第四代(如图Ib所示)，加入上述培养基及丝裂霉素C (加入后，丝裂霉素C的终浓度为IOug/ml，丝裂霉素C随培养基一起加入)，抑制2小时；平衡盐溶液反复冲洗，去除残留的丝裂霉素C，O. 25%胰酶(将O. 25g胰酶溶于PBS平衡盐溶液，定容至IOOml制备而成)消化2分钟，1000转/分钟离心5分钟后弃上清，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞沉淀并调整细胞密度至4 X IO4个/ml，接种至培养皿内，即为人角膜基质成纤维细胞层，备用。所述含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基是在普通的DMEM/F12培养基基础上添加胎牛血清制成的，添加后，胎牛血清占总液体量的10%。2.人角膜内皮细胞条件培养基的制备I)人角膜内皮细胞B4G12系的培养将装有B4G12细胞的冻存管从超低温冰箱取出，迅速转移至37°C水浴锅内将管内冰块溶解，将冻存管内细胞悬液移至15ml离心管内，加入5ml的含有10ng/mlbFGF的人内皮无血清培养基，1000转/分钟离心5分钟后弃上清，再加入4ml含有10ng/mlbFGF的人内皮无血清培养基重悬细胞沉淀，最后将细胞加入IOug/ml层粘连蛋白/10ug/ml硫酸软骨素包被的培养瓶内，置于37°C、5%C02孵箱内孵育培养，隔日换液。2)条件培养基的制备待B4G12细胞生长至70 90%满时更换新鲜培养基培养12小时，收集细胞培养上清液，将收集好的上清液用0. 22 μ m滤器过滤后_80°C保存备用；待收集完成后将收集的上清液与含有10%胎牛血清DMEM/F12培养基(体积比)按照3:1的比例混合配制成上清液浓度为75%的人角膜内皮细胞条件培养基，4°C保存备用。所述B4G12细胞培养基是在人内皮无血清培养基的基础上添加10ng/mlbFGF制成的。3.人胚胎干细胞和人角膜基质细胞共培养诱导分化为人神经嵴干细胞常规原代培养小鼠胚胎成纤维细胞，取其3 4代作为饲养层，采用人胚胎干细胞培养基常规培养人胚胎干细胞；待细胞贴壁后，机械法分选形态为圆形或类圆形、边缘光滑、细胞排列紧密均质、未分化的人胚胎干细胞克隆团(如图2a所示)，按照8 12个克隆/cm2密度接种于上述培养皿，更换为不含bFGF的人胚胎干细胞培养基(在不含bFGF的培养环境下，有利于人胚胎干细胞进一步分化)培养7天，人胚胎干细胞分化成菊形团(如图2b所示)，机械法将菊形团从人角膜基质成纤维细胞层分离移至lOug/ml纤维连接蛋白包被的培养瓶内，采用神经嵴干细胞培养基继续培养7天，流式细胞仪分选出P75(+)细胞(人神经嵴干细胞)。所述人胚胎干细胞培养基是在DMEM knock out基础培养基上添加以下物质制成的knock out血清替代物,巯基乙醇,谷氨酰胺，非必需氨基酸(购自美国Invitrogen公司，货号11140)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);添加后，knock out血清替代物占总液体量的20% (体积分数)，巯基乙醇的浓度为O. ImM，谷氨酰胺的浓度为O. ImM，非必需氨基酸的浓度为O. ImM，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为4ng/ml ；所述神经嵴干细胞培养基是在DMEM/F12培养基上添加以下物质制成的B27， ITS, EGF, bFGF和NGF ;添加后各物质的终浓度分别为B27占总液体量的2%，ITS占总液体量的 l%，EGF20ng/ml，bFGF 10ng/ml, NGF 10ng/ml ；4.人神经嵴干细胞诱导分化为人角膜内皮细胞人角膜内皮细胞条件培养基重悬P75(+)细胞(人神经嵴干细胞),加入经10ug/ml层粘连蛋白/10ug/ml硫酸软骨素包被的培养瓶内，置于37°C、5%C02孵箱孵育培养，隔天更换人角膜内皮细胞条件培养基，倒置显微镜下观察细胞形态由梭形逐渐变为多边形，至10天左右细胞基本长满，互相间形成紧密连接呈多边形单层排列(如图3所示)，体外光学显微镜观察、实时定量聚合酶链式反应、免疫荧光等证实诱导细胞具有与正常人角膜内皮细胞相似的形态和表型，诱导出的人角膜内皮细胞增殖能力类似正常人角膜内皮细胞，体外最多能传I 2代。5.诱导分化获取的人角膜内皮细胞移植到恒河猴角膜内皮功能失代偿眼内实验恒河猴经氯胺酮肌注全麻后，常规消毒，铺巾，开睑器开睑；妥布霉素针冲洗结膜囊；在手术显微镜下，直径8_环钻于角膜中央刻印标记，9点位行透明角巩膜缘切口，前房注射眼科手术用粘弹剂，白内障手术所用截囊针进入前房，针尖向上按照标记划开角膜后弹力层，撕囊镊完整撕出角膜后弹力层，水密侧切口。将0. 2ml密度为4X IO4个/ml诱导分化获取的人角膜内皮细胞悬液注入前房。全麻下保持面向下体位4小时。术后抗炎，预防感染，抑制排斥反应药物点眼，每天裂隙灯显微镜观察，定期取材行HE切片，扫描电镜，激光角膜共聚焦显微镜等检查(如图4所示)。
权利要求
1.一种人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于步骤如下 (1)人角膜基质成纤维细胞的原代培养将新鲜人角膜环浸于含100U/ml青霉素-100U/ml链霉素的平衡盐溶液冲洗消毒，置于倒置显微镜下，上皮刀刮除角膜上皮，显微镊子撕除后弹力层及内皮，剩余角膜基质用显微剪剪成1_X Imm组织块，均匀贴壁于培养皿，待贴壁牢固后加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37°C、5%C02孵箱内孵育培养，每3天更换一次培养基；待细胞铺满培养皿底部70% 80%时I :2传代培养；传代培养至第四代，加入上述培养基及丝裂霉素C，抑制2小时，获得人角膜基质成纤维细胞层； (2)常规原代培养小鼠胚胎成纤维细胞，取其3 4代作为饲养层，采用人胚胎干细胞培养基常规培养人胚胎干细胞，机械法分选形态状态良好的人胚胎干细胞克隆团，按照8 12个克隆/cm2密度接种于步骤(I)制备的人角膜基质成纤维细胞层上，采用不含bFGF的人胚胎干细胞培养基培养7天，人胚胎干细胞分化成菊形团，机械法将菊形团从人角膜基质成纤维细胞层分离移至lOug/ml纤维连接蛋白包被的培养瓶内，采用神经嵴干细胞培养基继续培养7天，流式细胞仪分选出人神经嵴干细胞； (3)人神经嵴干细胞诱导分化为人角膜内皮细胞将步骤(2)分选出的人神经嵴干细胞用人角膜内皮细胞条件培养基重悬，加入经10ug/ml层粘连蛋白/10ug/ml硫酸软骨素包被的培养瓶内，置于37°C、5%C02孵箱孵育培养，隔天更换人角膜内皮细胞条件培养基，培养至细胞基本长满，互相间形成紧密连接呈多边形单层排列，即得人角膜内皮细胞。
2.根据权利要求I所述的人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于所述人胚胎干细胞培养基是在DMEM knock out基础培养基上添加以下物质制成的knock out血清替代物，巯基乙醇，谷氨酰胺，非必需氨基酸，碱性成纤维细胞生长因子；添加后，knock out血清替代物占总液体量的20%，巯基乙醇的浓度为0. 1禮，谷氨酰胺的浓度为0. ImM，非必需氨基酸的浓度为0. ImM，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为4ng/ml。
3.根据权利要求I所述的人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于所述形态状态良好的人胚胎干细胞是指圆形或类圆形、边缘光滑、细胞排列紧密均质、未分化的人胚胎干细胞。
4.根据权利要求I所述的人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于所述神经嵴干细胞培养基是在DMEM/F12培养基上添加以下物质制成的B27，ITS, EGF, bFGF和NGF ;添加后各物质的终浓度分别为B27占总液体量的2%，ITS占总液体量的 l%，EGF20ng/ml，bFGF 10ng/ml, NGF 10ng/ml。
5.根据权利要求I所述的人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于所述人角膜内皮细胞条件培养基是通过以下方法制备得到的 (1)人角膜内皮细胞B4G12细胞系的培养将装有B4G12细胞的冻存管从超低温冰箱取出，迅速转移至37°C水浴锅内将管内冰块溶解，将冻存管内细胞悬液移至离心管内，加入5mlB4G12细胞培养基，1000转/分钟离心5分钟后弃上清，再加入4ml B4G12细胞培养基重悬细胞沉淀，最后将细胞加入10ug/ml层粘连蛋白/10ug/ml硫酸软骨素包被的培养瓶内，采用B4G12细胞培养基培养，隔日换液； (2)条件培养基的制备观察B4G12细胞生长，至其铺满培养瓶底部70 90%满时，更换新鲜培养基继续培养12小时，收集细胞培养上清液，用0. 22 ii m滤器过滤后_80°C保存备用；待收集完成后，将该收集的上清液与含有10%胎牛血清DMEM/F12培养基按照体积比3 I的比例混合配制成上清液浓度为75%的人角膜内皮细胞条件培养基，4°C保存备用。
6.根据权利要求5所述的人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于所述B4G12细胞培养基是在人内皮无血清培养基的基础上添加10ng/mlbFGF制成的。
7.利用权利要求I 6中任一项所述的人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法得到的角膜内皮细胞。
8.权利要求7所述的角膜内皮细胞作为种子细胞用于组织工程角膜构建及移植的应用。
全文摘要
本发明公开了一种人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养人胚胎干细胞，分选状态良好的人胚胎干细胞克隆团，接种于经丝裂霉素C处理过的人角膜基质成纤维细胞层上，培养7天，人胚胎干细胞分化成菊形团，将菊形团从人角膜基质成纤维细胞层分离移至培养瓶内，采用神经嵴干细胞培养基继续培养7天，流式细胞仪分选出人神经嵴干细胞，加入培养瓶内，采用人角膜内皮细胞条件培养基置于37℃、5%CO2孵箱内孵育培养，隔天换液，培养10天左右，即得角膜内皮细胞，其增殖能力类似正常人角膜内皮细胞,体外最多能传1～2代，可以作为种子细胞用于组织工程角膜构建及移植。
文档编号A61K35/54GK102952777SQ201210501119
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年11月29日
发明者吴欣怡, 张凯, 陈红梅 申请人:山东大学