专利名称：鸡ibd病毒vp2蛋白和ltb的融合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程亚单位疫苗技术领域，具体涉及IBD病毒VP2蛋白和LTB的融合蛋白及其应用，即鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白和大肠杆菌肠毒素LTB的融合蛋白及应用。
背景技术：
鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)主要侵害鸡的中枢免疫器官法氏囊，从而导致免疫抑制，增加了机体对其它病原体的易感性，降低对其它疫苗的反应性，国外学者形象地称该病为鸡的“艾滋病”。虽然各国学者在IBD疫苗的研究上取得了巨大成就，但均未能从根本上扭转IBD流行日趋严重的现状。近十几年来，由于鸡传染性法氏囊病病毒IBDV超强毒株和变异株的出现、抗原变异和血清亚型的多样性，使目前的商品化疫苗不能提供足够的保护，其保护率仅达109^70%。超强毒株的毒力是标准病毒株的两倍以上，使鸡的发病率和死亡率明显上升，年龄较大的鸡甚至18周龄以上的后备母鸡也能致病。传统的灭活疫苗和弱毒疫苗已经面临着严峻的考验，大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-liable enterotoxin, LT)是由肠产毒性大肠杆菌(Enterotox1-genetic E. coli,ETEC)分泌的一种外毒素,具有很强的免疫佐剂特性。大肠埃希菌不耐热肠毒素是六聚体蛋白，由I个分子质量为28 ku的A亚基和5个分子质量为11 ku的B亚基单体组成，形成AB5型结构。A亚基具有毒性作用，而B亚基具有较强的免疫佐剂作用，并可避免A亚基的毒性作用，无毒且具有佐剂活性的B亚单位被研究者所关注。研究发现IBD通常通过经消化道和呼吸道等粘膜途径感染，良好的局部粘膜免疫是抵抗该病感染的重要防线，所以通过模拟病原体的自然感染途径，增强病原体最初侵入的呼吸道和消化道粘膜局部产生特异性的抗体，进而引起全身性系统免疫应答，对防治该病具有重要意义。因此，建立一种能够预防鸡传染性法氏囊病的基因工程亚单位疫苗就具有重要的现实意义和市场开发价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种IBD病毒VP2蛋白和LTB的融合蛋白及其应用，涉及一种IBDV VP2蛋白与大肠杆菌LTB融合蛋白的制备及应用，即将临床分离的IBDV超强毒株的VP2蛋白与具有粘膜免疫佐剂作用的大肠杆菌LTB蛋白通过I inker连接起来，获得了一个融合蛋白，该蛋白经过纯化后制成疫苗可以是免疫鸡抵抗IBDV强毒及超强毒的攻击而不引起免疫抑制。本发明的融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO :1。用于编码上述融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO :2。本发明的融合蛋白用于制备亚单位疫苗。一种亚单位疫苗的制备方法如下取注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相罐中混合均匀，加热融化至半透明状，再加6份的司本-80高压灭菌作为油相备用；取灭菌的4份吐温-80，加入96份的融合蛋白，充分搅拌至吐温-80完全溶解作为水相；按水相和油相体积比1:3比例混合乳化即可制备鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位疫苗。上述制备的亚单位疫苗用来防治鸡传染性法氏囊病。本发明是将鸡IBDV超强毒的VP2蛋白与具有粘膜免疫佐剂大肠杆菌LTB蛋白融合表达，制备的疫苗经皮下注射后对鸡抵抗鸡传染性法氏囊病强毒攻击具有坚强的抵抗力。
具体实施例方式IBDV的主要结构蛋白VP2蛋白是最主要宿主保护性抗原，而大肠杆菌不耐热肠毒素LTB是良好的粘膜免疫佐剂，本发明是用重叠延伸PCR方法将两种基因通过linker连接起来，克隆到pET-28a载体上，转化BL21(DE3)，经IPTG诱导后VP2-LTB融合蛋白获得了表达，将表达菌体高压匀浆破碎后离心取上清即为VP2-LTB蛋白溶液，加入矿物油佐剂制成 油乳剂疫苗，可用于预防鸡传染性法氏囊病，效果优于VP2亚单位疫苗。下面结合具体的实施例对本发明的融合蛋白进行详细的描述。一、VP2基因的筛选用Primer5. 0软件设计了一对扩增鸡传染性法氏囊病病毒VP2全基因引物，并在上游引物5'端加入保护性碱基及BamH I酶切位点，在下游引物的5'端加入保护性碱基和Xho I酶切位点，引物序列为Primer1:5' -GCG TCG ACA TGA CAA ACC TGC AAG ATC - 3'Primer 2 :5' -CCC TCG AGT TAT CCT TAT GGC CCG GAT T -3'取200 W用临床分离的疑似IBDV的病料感染的鸡胚接种尿囊膜悬液上清液，按RNAisoReagent说明书所述方法提取病毒RNA,按反转录试剂盒使用说明书进行反转录合成cDNA，进行PCR扩增，扩增体系为(50 m) 10XPCR Buffer 5W，dNTP (lOmM each) ml,上、下游引物(IOmM)各 1耵，cDNA 3 W，25mM MgCl2 4 W，Taq酶(5U/>1 ) ll^l，ddH2034W ;PCR 反应参数95 °C 5min，95°C lmin，58°C 2min，72°C 2min，35 个循环，72 °CIOmin。得到一个1300bp左右的片段，切胶回收该片段，与pMD-18T载体连接。PCR回收片段 6W，T 载体 2W (稀释 10 倍后)，T4 DNA 连接酶 1W，T4 buffer 2. 5W，水13. 5W，总计25沿。16°C过夜连接，取20沿连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，挑选10个白色菌落培养，提取质粒鉴定正确的选取3个测序，结果3个质粒的测序结果都一致，证明获得的核苷酸片段在扩增的过程中没有产生错误，其核苷酸序列为SEQ ID N0:4，翻译的氨基酸序列为 SEQ ID NO:3。将该核苷酸序列在NCBI上Blast比对，有十几个碱基发生了点突变，导致翻译的氨基酸序列也有几个位点发明变化。表明该毒株为一新的流行毒株。这是由于VP2蛋白是主要宿主保护性抗原，经常发生突变而导致抗原性发生差异。二、VP2重组蛋白的表达将鉴定正确的上述一个质粒用BamH I和Xho I双酶切回收基因片段，与用这两个酶切的pET-28a载体连接，转化感受态大肠杆菌JM109，提取质粒鉴定正确后转化感受体的BL21 (DE3)，挑取单菌落，转接5mlLB小管培养基，37°C振荡培养3 4小时至0D600为0. 6时，加入终浓度为0. 8mM的IPTG诱导4飞小时，SDS-PAGE电泳结果证实为分泌表达。将表达菌用10倍菌体湿重PBS重悬，高压匀浆破碎细菌，离心取上清，做琼脂免疫扩散试验，结果琼扩效价不低于1:64。三、VP2蛋白的纯化用镍柱纯化，200mM的咪唑洗脱，洗脱液用PBS透析过夜。所得透析液即为纯化的蛋白，可用于制苗。四、VP2亚单位疫苗的制备取注射用白油94份、司本-80 6份、硬脂酸铝2份，混合后，加热溶化，116°C灭菌30分钟做为制苗用油相；加入灭菌的吐温-80 4份，然后加入上述制备的VP2重组蛋白发酵提取液96份，充分振摇，使吐温-80完全溶解，做为制苗用水相；取油相3份放于胶体磨 内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相I份，加完后再以10000r/min搅拌2 5分钟，在终止搅拌前加入I %硫柳汞溶液，使其最终浓度为0. 01 %。VP2亚单位疫苗的免疫效果将20只SPF鸡随机分为两组，每组10只，其中一组在21日龄时以0. 3ml/只的剂量皮下注射VP2亚单位疫苗，免疫21日后连同不免疫对照组每只经点眼途径接种100BID鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85株毒液，攻毒后每天观察鸡只的临床表现及死亡情况，记录发病和死亡鸡数，剖检观察死亡鸡法氏囊等病变，72 96小时扑杀存活鸡，逐只剖解，观察法氏囊等病理变化。结果不免疫对照组8只鸡发病，而免疫组鸡只无发病。上述结果证明本发明制备的VP2亚单位疫苗具有很好的免疫原性。五、VP2蛋白与大肠杆菌LTB基因的融合采用重叠延伸PCR方法扩增融合基因。分别使用以下引物。其中P5引入Not I的酶切位点。P1:5' -GGATCCGCGTCGACATGACAA ACCTGCAAGATC - 3'P 3 :5' - AACGCCGTAAATAAAACCATGCCAGAGCCGCCAGAGCC - 3'P 4:5' -GGCTCTGGCGGCTCTGGCATGGTTTTATTTACGGCGTT - 3'P 5 :5' -GCGGCCGCCTAGTTTTCCATACTGATTG - 3'用Pl 和 P3 扩增 IBDV 的 VP2 基因(SEQ ID N0:4)，扩增体系为(50 m) =IOXPCRBuffer 5m,dNTP (IOmM each) 1W，上、下游引物(IOmM)各 1耵，cDNA 3 Pl，25mM MgCl24 Taq酶(5U/W ) lW，ddH20 3姐 JCR反应条件95°C预变性 5min，94°C变性 lmin，52°C退火 lmin, 72°C延伸 lmin,循环 5 次后，94°C变性 lmin, 56°C退火 lmin, 72°C延伸 Imin,30个循环，72°C延伸lOmin。胶回收试剂盒回收大约1400bp的PCR片段。用P4和P5扩增大肠杆菌LTB基因，用质粒提取试剂盒从产肠毒素大肠杆菌中提取质粒，以质粒为模板进行PCR扩增，PCR体系为(50 m) 10XPCR Buffer 5W，dNTP (IOmMeach) 1W，上、下游引物(IOmM)各 1耵，质粒 DNA 3 W，25mM MgCl2 4 W，TaqT 酶(5U/m ) m, ddH20 3姐。PCR 反应条件95°C预变性 5min，94°C变性 lmin，52°C退火 lmin，72°C延伸lmin，循环5次后，94°C变性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸Imin，30个循环，72 °C延伸lOmin。胶回收试剂盒回收大约350bp的PCR片段，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 5。再用Pl和P5以回收的VP2 PCR片段及LTB PCR片段为模板，扩增融合基因，反应条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环，72°C延伸IOmin0得到片段大约1700bp。核苷酸测序结果为SEQ ID NO:2，翻译的氨基酸序列为SEQID NO:1 ;都与最初设计的一致。六、融合蛋白的诱导表达1、将上述制备的融合基因与pET_28a载体分别经BamH I和Not I双酶切回收后进行连接连接，将重组载体用氯化钙法转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3)，克隆后筛选出的阳性克隆测序确定插入的片段正确。将阳性克隆用IPTG诱导表达，将表达产物后电泳可见65kd左右的蛋白，表达量大约为7 8%，琼脂扩散试验及western-blot方法鉴定表明，表达的蛋白为VP2-LTB融合蛋白，超声破碎细菌后分别取上 清和沉淀SDS-PAGE电泳，表明蛋白为可溶性表达。2、重组蛋白的纯化用镍柱纯化，200mM的咪唑洗脱，洗脱液用PBS透析过夜。所得透析液即为纯化的
蛋白，可用于制苗。七、VP2亚单位疫苗与VP2-LTB亚单位疫苗制备取注射用白油94份、司本-80 6份、硬脂酸铝2份，混合后，加热溶化，116°C灭菌30分钟做为制苗用油相；加入灭菌的吐温-80 4份，然后分别加入上述制备的VP2重组蛋白、VP2-LTB融合蛋白发酵提取液96份，充分振摇，使吐温-80完全溶解做为制苗用水相；取油相3份放于胶体磨内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相I份，加完后再以10000r/min搅拌2 5分钟，在终止搅拌前加入I %硫柳汞溶液，使其最终浓度为0. 01 %。制备的疫苗分别为VP2亚单位疫苗与VP2-LTB亚单位疫苗。八、VP2亚单位疫苗与VP2-LTB亚单位疫苗的免疫效果将制备的两种基因工程亚单位疫苗分别免疫21日龄SPF鸡，每种疫苗免疫30只，免疫后7日分别测定采集抗凝血测定淋巴细胞转化率，免疫21日后采血分离血清测定法氏囊琼扩效价，并连同不免疫对照10只用强毒BC6-85点眼攻毒，结果表明7日淋巴细胞转化率VP2-LTB免疫组明显高于VP2免疫组与对照组；21日攻毒后两免疫组均能得到10/10保护，对照组9/10发病；血清的琼脂扩散抗体效价的几何平均数VP2-LTB免疫组的明显高于VP2免疫组。上述结果表明本发明所制备的融合蛋白作为疫苗具有很好的效果。
权利要求
1.一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白和大肠杆菌肠毒素LTB的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
2.一种核苷酸，所述的核苷酸用于编码权利要求1所述的融合蛋白。
3.如权利要求2所述的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸的序列为SEQID N0:2。
4.权利要求1所述的融合蛋白在制备亚单位疫苗中的应用。
5.一种亚单位疫苗，其制备方法如下取注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相罐中混合均匀，加热融化至半透明状，再加6份的司本-80高压灭菌作为油相备用；取灭菌的4 份吐温-80，加入96份的权利要求1所述的融合蛋白，充分搅拌至吐温-80完全溶解作为水相；按水相和油相体积比1:3比例混合乳化即制成亚单位疫苗。
6.权利要求5所述的亚单位疫苗用来防治鸡传染性法氏囊病。
全文摘要
本发明涉及一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白和大肠杆菌肠毒素LTB的融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO1。本发明是将鸡IBDV超强毒的VP2蛋白与具有粘膜免疫佐剂大肠杆菌LTB蛋白融合表达，表达产物乳化制备疫苗，免疫21日龄SPF鸡，并设VP2亚单位疫苗免疫对照及不免疫对照，免疫后7日测定淋巴细胞转化率，免疫 21日采血测定血清琼脂免疫扩散抗体效价并连同不免疫对照攻毒，结果各疫苗免疫组均能抵抗强毒攻击，而淋巴细胞转化率和血清抗体效价均明显高于VP2免疫对照组，具有良好的免疫原性。
文档编号A61K39/39GK102993311SQ20121050908
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者王雷, 凌红丽, 王宏华, 王睿智 申请人:青岛康地恩药业股份有限公司, 青岛宝依特生物制药有限公司