专利名称：千斤拔总黄酮提取物及其提取方法和其药物用途的制作方法
技术领域：
本发明属于中药提取物制备方法及其药物用途，具体涉及千斤拔总黄酮提取物及其提取方法和其药物用途。
背景技术：
千斤拔隶属于豆科(Leguminosac)蝶形花亚科(Papilionoideae),在我国广泛分布于东南、中南、西南地区。千斤拔以根入药，有祛风湿，强腰膝的功效，用于风湿性关节炎，腰腿痛，腰肌劳损，白带，跌打损伤。《中药大辞典》记载“千斤拔味甘辛，微苦，性温平，无毒，具有祛风利湿、消瘀解毒之功效，可治疗风湿痹痛，慢性肾炎、跌打损伤、痈肿、喉蛾等症”。国内外学者对该植物化学成分及其生物活性的研究报道很多，其化学成分含有黄酮类、香 豆素类、萜类、挥发油、留醇类等，其中以黄酮类化合物为主，尤其是异戊烯基取代的异黄酮类化合物。现代药理研究及临床试验表明千斤拔不仅对各种妇科炎症有显著疗效，具有类雌激素作用，还具有良好的抗血栓、抗炎镇痛、抗氧化的作用，对神经系统的损伤也具有一定的保护作用。千斤拔含有大量的活性物质，其中的黄酮类化合物具有抗菌、消炎、抗氧化、降血月旨、降血栓、防治血管硬化和抗衰老等作用。国内外关于千斤拔的研究主要集中在化学成分、药理作用和活性成分提取的研究。未见基于热回流提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法提取，大孔树脂树脂纯化，使千斤拔有效部位总黄酮含量大于50%的报道；未见关于千斤拔有效部位总黄酮含量大于50%提取物药物用途的研究报道。
发明内容
本发明旨在提供一种蔓性千斤拔总黄酮提取物制备方法，该方法包括以下步骤
(1)将千斤拔药材粉碎；
(2)用乙醇热回流提取、超声波辅助提取或微波辅助提取，合并提取液，过滤，浓缩，真空干燥得千斤拔粗提物；
(3)将步骤(2)中的千斤拔粗提物加水沉淀后离心，上清液备用；
(4)将(3)得到的上清液上大孔树脂柱；
(5)用水洗脱去杂后，用乙醇梯度洗脱；
(6)收集乙醇洗脱液减压浓缩真空干燥，粉碎后得到千斤拔总黄酮粗提物。其中步骤(I)中千斤拔粉碎后的粒度为30-60目。步骤(2)中乙醇的浓度为40%_85%。步骤(3)中加水量为浸膏重量的8-10倍。步骤(4)中所述大孔树脂为AB-8型大孔树脂，大孔树脂与步骤⑴中所述千斤拔的重量比为O. 5-5:1。步骤(5)中洗脱溶剂采用与大孔树脂体积比5-10的蒸馏水、10%、70%乙醇梯度洗脱，合并70%乙醇洗脱液。本发明的优点如下
(1)本发明采用溶剂提取结合大孔树脂纯化法对千斤拔中总黄酮进行纯化，有效提高了提取物中总黄酮含量，经紫外分光光度法，以芦丁为对照品，测得提取物中总黄酮含量大于 50% ；
(2)超声波辅助提取具有提取效率高、提取时间短、提取温度低、适应性广、提取药液杂质少，有效成分易于分离、纯化、提取工艺运行成本低，综合经济效益显著、操作简单易行，设备维护、保养方便的优点；
(3)微波辅助提取具有反应或萃取快、产率高，产品质量好、后处理方便、安全、无污染、生产线组成简单，节省投资的优点。
具体实施方式
I.千斤拔总黄酮的提取
(I)溶剂回流法50g千斤拔药材粗粉，加入12倍量的40-85%乙醇，回流提取3次，每次分别为3h、2h、lh，合并提取液过滤，减压浓缩，真空干燥。(2)超声波法50g千斤拔药材粗粉，加入10倍量的50%乙醇，在60°C下进行超声提取3次,每次分别为50min,30min, IOmin,合并提取液过滤,减压浓缩,真空干燥。(3)微波辅助提取法50g千斤拔药材粗粉，加入12倍量的60%乙醇，在60°C下进行微波辅助提取3次，每次分别为30min，20min，lOmin，合并提取液过滤，减压浓缩，真空干燥。2.千斤拔总黄酮的含量测定
(1)对照品溶液的制备精密称取芦丁标准品5.Omg于50mL容量瓶中，以70%乙醇溶解，定容得浓度为O. lmg/mL的芦丁对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备精密称取蔓性千斤拔总黄酮提取物20mg于25mL容量瓶中，力口入70%乙醇溶解，定容，摇匀即得；
(3)标准曲线的绘制精密吸取标准液0、l、2、3、4、5mL，分别置IOmL容量瓶中，各加70%乙醇溶液使成7mL，精密加入5%亚硝酸钠O. 3mL,摇匀，放置6min，精密加入10%硝酸铝溶液O. 3mL,摇匀，放置lOmin，加入lmol/L氢氧化钠溶液2mL，分别用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置lOmin，置比色皿中，在510nm处测吸光度，测3次取平均值，绘制标准曲线，得回归方程A=8. 5038C-0. 0054，R=O. 9997 ；
(4)提取物中总黄酮含量的测定精密吸取供试品溶液lmL，置IOmL容量瓶中，加60%乙醇溶液使成7mL，精密加入5%亚硝酸钠O. 3mL,摇匀，放置6min，精密加入10%硝酸铝溶液
O.3mL,摇匀，放置lOmin，加入lmol/L氢氧化钠溶液2mL，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置lOmin，置比色皿中，在510nm处测吸光度，测3次取平均值，根据芦丁标准曲线计算提取物中总黄酮含量。3.千斤拔总黄酮的纯化
(I)树脂的预处理及装柱取新购的AB-8大孔树脂，以95%乙醇浸泡24h后装柱(2. 5cmX 20cm)，装柱过程应该让树脂缓缓沉下，柱床紧实且无气泡，95%乙醇冲洗树脂柱，至流出液与蒸馏水1:1混合不再出现浑浊为止，继续以蒸馏水冲洗树脂柱，至无醇味为止；(2)上样用恒流泵将浓度为O.42mg/mL O. 89mg/mL的千斤拔总黄酮提取液进行上柱，控制流速为lmL/min ；
(3)收集以5mL为单位体积分步收集流出液，精密吸取ImL流出液，测定吸光度；
(4)饱和吸附量计算当流出液浓度达到上样液浓度1/10时，即为上样终点。将流出液合并，通过测定流出液吸光度，计算出流出液浓度，饱和吸附量=[(上样液浓度X上样液体积)-(流出液体积X流出液浓度)];
(5)洗脱用5倍柱床体积(50mL)的70%乙醇溶液洗脱，以5mL为单位体积分步收集洗脱液，控制流速为lmL/min，用薄层色谱法确定洗脱终点；
(6)含量测定用Al(NO3)3-NaNO3-NaOH显色法测定洗脱液中千斤拔总黄酮的浓度；
(7)总黄酮纯度计算洗脱液合并，减压回收溶剂，浓缩物真空干燥，称重。总黄酮纯度=[(总黄酮浓度(mg/mL) X洗脱液体积(mL))/干燥物重量(mg)]；·
(8)树脂除了吸附目标化合物外，还会吸附杂质，而这些杂质会污染树脂，所以每次使用后，树脂必须再生，每次层析后，将树脂倒出，用95%乙醇冲洗数次，待颜色较浅后加5%Na0H溶液冲洗，待颜色较浅后改用蒸馏水洗至中性，继续用5%HC1溶液冲洗，待颜色较浅后改用蒸馏水洗至中性，树脂即可再次使用。本发明的药物用途可通过下面药效学实验进一步验证，千斤拔总黄酮提取物中总黄酮含量大于50%,以下简称为DLP。实验例I DLP对闻脂I旲型小鼠血脂的影响实验。一、实验材料
1.动物Wistar大鼠，120只，雌雄各半，体重180-210g。购自吉林大学基础医学院动物实验中心，动物合格证号SCXK-(吉)-2007-0003 ；
2.药品与试剂千斤拔总黄酮提取物(总黄酮含量62%,性状浅棕色粉末,气微,味微涩，微苦。批号20100601)，吉林化工学院药学系提供；血脂康胶囊，北京北大维信生物科技有限公司生产，产品批号20100206 ;非诺贝特，法国利博福尼制药公司生产，批号1026396 ;胆固醇，规格生化试剂，天津市光复精细化工研究所，批号100516 ;胆酸钠，规格生化试剂，北京化学试剂公司，批号20100525 ;猪油，由吉林化工学院药学系教研室提供；血清总胆固醇(TC)含量测定试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司，批号100501 ；甘油三酯(TG)含量测定试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司，批号101831 ；
3.仪器iMark-680酶标仪，美国BIO-RAD伯乐公司产品。二、实验方法
1.高脂饲料配制方法在88.7%的基础饲料中加10%猪油、1%胆固醇和O. 3%胆酸钠。将猪油加温溶化，加入胆固醇和胆酸钠，搅拌均匀后倒入饲料中，拌匀，加适量温水拌匀，平铺在方盘中，厚度约I. 5cm，用壁纸刀划成2cmX 3cm大小的小块，放置80°C恒温干燥箱中烘干;
2.配药方法分别根据各组给药剂量、动物体重、给药天数计算出所需要量，精密称定，先加少量蒸馏水，研磨均匀，再加蒸馏水至所需浓度即可；
3.对照组的设立动物购入后适应环境3天，按体重随机分为正常对照组；高脂模型组；阳性对照药血脂康胶囊组(240mg/kg);阳性对照药非诺贝特组(40mg/kg);千斤拔总黄酮提取物高剂量组(400mg/kg)、中剂量组(200mg/kg)和低剂量组(100mg/kg)共8组,每组12只，雌雄各半；
4.动物饲养及取样实验过程中，正常对照组动物饲以常规饲料，其他各组动物均饲以闻脂词料。实验动物每天上午灌胃给药I次，灌胃体积均为20mL/kg。正常对照组及闻脂模型组动物灌胃蒸馏水，给药组分别给予相应的药物溶液。连续给药2周，最后I次给药当晚，动物禁食不禁水16小时，次日眼球取血O. 5ml，离心(3000r/min)分离血清；采用酶比色法测定血清总胆固醇(TC)含量、采用酶比色法测定血清甘油三酯(TG)含量。指标数据以均数加减标准差(x±s)表示，统计学处理方法采用组间t-检验。三、实验结果
小鼠在连续饲以高脂饲料造模2周后，模型组动物的血清TC、TG含量均较正常对照组明显升高，TC含量正常对照组为3. 14±0. 46mmol/L，模型组为6. 55±0. 85mmol/L(P<0. 01)； TG含量正常对照组为O. 68±0. 24mmol/L，模型组为O. 85±0. 26mmol/L (P〈0. 05)，表明高血脂症动物模型成立；给药两周后，DLP高剂量组动物血清TC和TG含量均低于高脂模型组(P〈0. 01),表明千斤拔总黄酮可明显降低高脂模型小鼠血清TC和TG含量。表I千斤拔总黄酮提取物(DLP)对实验性高脂血症小鼠血脂含量的影响
权利要求
1.在一种千斤拔总黄酮提取物，其特征在于由下述方法制备得到 (1)取千斤拔药材20g，粉碎，用60%-85%乙醇作为溶剂加热回流提取3次，每次分别为3h、2h、Ih,合并提取液，过滤，浓缩，真空干燥即得千斤拔总黄酮粗提物； (2)取千斤拔药材20g，粉碎，用60%-85%乙醇浸泡l_6h，常压下，以功率200-900W进行微波辅助提取3次，每次分别为30min，20min, IOmin,提取液过滤，浓缩，真空干燥即得千斤拔总黄酮粗提物； (3)取千斤拔药材20g，粉碎，用60%-85%乙醇浸泡2-4h，常压下，以频率为200-700W，进行超声辅助提取3次，每次分别为50min，30min，lOmin，提取液过滤，浓缩，真空干燥即得千斤拔总黄酮粗提物； (4)将(1)、(2)或(3)得到的千斤拔总黄酮粗提物精密称量，溶解，经AB-8大孔树脂纯化，收集洗脱液，回收乙醇得浸膏，真空干燥至恒重即得本发明的千斤拔总黄酮提取物，其中总黄酮含量>50%。
2.如权利要求I所述的千斤拔总黄酮提取物的制备方法，其特征在于乙醇可用甲醇代替。
3.如权利要求I所述的千斤拔总黄酮提取物的制备方法，其特征在于大孔树脂可用聚酰胺树脂代替。
4.如权利要求I所述的千斤拔总黄酮提取物在制备降血脂、降血栓药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种千斤拔总黄酮提取物及其提取方法和其医药用途，属于中药的有效药用部位中的提取物及其提取方法和其药物用途。将中药千斤拔干燥粉碎后用40-85％乙醇回流提取、微波辅助提取或超声波辅助提取，过滤、浓缩、干燥得千斤拔总黄酮粗提物，经AB-8大孔树脂分离纯化，收集洗脱液，回收溶剂即得用于中药新药研究的千斤拔总黄酮提取物，采用紫外分光光度法测定其中总黄酮含量大于50%。本发明提取纯化的千斤拔总黄酮提取物具有治疗高血脂、血栓等疾病的作用。
文档编号A61K36/48GK102940667SQ201210533249
公开日2013年2月27日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者陈帅, 王慧竹, 王晓林, 薛健飞, 刘立业, 年晓莉 申请人:吉林化工学院, 陈帅