专利名称：大叶糙苏提取物、提取方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种大叶糙苏提取物、提取方法及其在制备抗氧化类药物和保肝护肝类药物方面的应用，属于医药技术领域。
背景技术：
肝炎是常见的严重危害人类健康的肝脏疾病之一，我国作为肝病的高发区，已感染肝炎病毒的人数约I亿多，但是大部分都存在不同程度的肝损伤，部分人正在向慢性肝炎、肝硬化、肝癌演 变，阻断或延缓其恶化已成为治疗肝病的艰巨任务。目前肝病治疗的总对策包括保护、改善肝功能，逆转肝组织学变化，阻断慢性肝炎向肝硬化发展，从而制止“肝病三步曲”的恶性演变。急性肝损伤是急诊常见疾病之一，可分为暴力性、病理性、化学性和情志型肝损伤，其中病理性肝损伤和化学性肝损伤最为常见，主要表现为肝细胞坏死或凋亡、肝细胞变性、肝细胞脂肪变性、淤胆性损害、炎性反应等。临床上造成急性肝损伤的主要原因有病毒感染、药物毒性、酒精、农药或除草剂、工业化学物、食物中毒、熬夜过度、其他疾病如急性胰腺炎、心功能不全、糖尿病、肿瘤等。现代医学并无治疗肝损伤的特异性药物，多采用休息、调节饮食、补充维生素以及通过服用抗病毒药(如干扰素和拉米夫定)、免疫调节剂(如胸腺肤)和改善功能药(如联苯双酯)等对症治疗，虽然对症治疗的各类药物在临床上各有一定疗效并已经得到验证，但由于具有严格的适应症和严重的毒副作用，因此临床应用受到了一定程度的限制。随着中医药事业和中西医结合研究的不断发展，应用中草药及其制剂治疗肝脏疾病在我国越来越受到重视。目前，各种肝脏疾病的发病机制的研究与治疗药物的筛选，在很大程度上都依赖与人类肝脏疾病病理机制相似的实验动物模型的建立和应用。制造实验性肝损伤动物模型的方法很多，如化学性肝损伤(四氯化碳、氨基半乳糖诱导肝损伤等)、药物性肝损伤(扑热息痛诱导肝损伤)、免疫性肝损伤(卡介苗和脂多糖诱导肝损伤、刀豆蛋白A诱导肝损伤)和酒精性肝损伤。其中四氯化碳诱导的急性肝损伤动物模型是最经典的实验性肝损伤模型。氧化应激不仅是肝功能障碍的一部分，也是所有肝损伤的病理生理基础。肝细胞内一旦有反应性氧化产物ROS (reactive oxygen species, R0S)的过量产生和抗氧化机制低下，就容易导致氧化应激状态，发生细胞膜脂质过氧化、细胞器功能异常、线粒体内Ca2+超载、炎性反应等，甚至出现核的氧化，进一步发展会导致癌变。中药及其有效成分可以通过抑制细胞因子过表达、抗自由基损伤、减少致炎和凋亡相关介质的产生、促进肝脏血液循环和肝细胞的再生、调节免疫、抗病毒等方面保护肝细胞，防止肝损伤。其中，从中草药中筛选具有抗氧化应激，抑制脂质过氧化的保肝药物也是目前研究的热点。如芦荟苷、红景天甙、芒果苷、葛根总黄酮、柳茶、甘草提取物、扛板归、橄榄总黄酮、山芝麻、六月青多糖、金丝桃苷等能不同程度降低谷丙转氨酶、谷草转氨酶和丙二醛水平，升高SOD或GSH-PX活性等途径，增强肝脏抗氧化酶活性，抑制脂质过氧化反应，从而对急性肝损伤起到保护作用。
大叶糙苏(Phlomis maximowiczii)为唇形科糙苏属植物,产于吉林,辽宁及河北，生于林缘或河岸，果可榨油，含油量为20-34%，根为民间草药，味苦、辛、性凉，能清热消肿，其根或全草均可入药，能清热消肿，祛风，主治疮疖、无名肿毒，具有治疗感冒、补肝肾、续筋骨、止血安胎、散寒、生肌等功效，当地居民将它作为一种无毒副作用的草药使用。目前除顾海鹏等对大叶糙苏的脂溶性成分进行研究外，未见其他对大叶糙苏化学成分和药理活性的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种大叶糙苏提取物。为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是一种大叶糙苏提取物，包括石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物；提取方法步骤如下(I)取大叶糙苏全草，洗净、阴干，粉碎后用甲醇浸泡提取，回收甲醇，得总浸膏备用；(2)将步骤(I)的总浸膏分散乙醇水溶液中，加入石油醚萃取，将石油醚萃取液回收石油醚得石油醚提取物；(3)在步骤(2)石油醚萃取后的溶液中加入乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液回收乙酸乙酯得乙酸乙酯提取物；(4)在步骤(3)乙酸乙酯萃取后的溶液中加入正丁醇，将正丁醇萃取液回收正丁醇得正丁醇提取物。同时，本发明还提供一种大叶糙苏提取物的提取方法，具体步骤如下(I)取大叶糙苏全草，洗净、阴干，粉碎后用甲醇浸泡提取，回收甲醇，得总浸膏备用；(2)将步骤(I)的总浸膏分散乙醇水溶液中，加入石油醚萃取，将石油醚萃取液回收石油醚得石油醚提取物；(3)在步骤 (2)石油醚萃取后的溶液中加入乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液回收乙酸乙酯得乙酸乙酯提取物；(4)在步骤(3)乙酸乙酯萃取后的溶液中加入正丁醇，将正丁醇萃取液回收正丁醇得正丁醇提取物。优选的，所述步骤(I)中甲醇的浸泡次数为3次，浸泡时间为3天。本发明还提供一种大叶糙苏提取物在制备抗氧化类保健食品或药物方面的应用。进一步的，大叶糙苏提取物中乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在制备保肝护肝食品或药物方面的应用。更进一步的，大叶糙苏提取物中乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在制备抗急性肝损伤类保健食品或药物方面的应用。更进一步的，大叶糙苏提取物中乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在制备降低急性肝损伤中血清GPT活力的保健食品或药物方面的应用。更进一步的，大叶糙苏提取物中乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在制备降低急性肝损伤中血清GOT活力的保健食品或药物方面的应用。更进一步的，大叶糙苏提取物中乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在制备升高急性肝损伤中肝脏SOD活力的保健食品或药物方面的应用。更进一步的，大叶糙苏提取物中乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在制备降低急性肝损伤中肝脏MDA水平的保健食品或药物方面的应用。
本发明的有益效果本发明大叶糙苏提取物包括石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物，取大叶糙苏全草先以甲醇提取后再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取得到，该提取方法简单易行。本发明对提取得到的大叶糙苏提取物进行了体外抗氧化活性试验和CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的试验，结果表明大叶糙苏提取物中正丁醇提取物的抗氧化活性最强，乙酸乙酯提取物次之，石油醚提取物最弱，同时在小鼠急性肝损伤试验中正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物均能通过增强血清中GPT活力和GOT活力，起到保肝护肝的作用，同时通过升高肝脏中SOD活力、降低MDA含量水平来增强急性肝损伤小鼠机体的抗氧化机能，抑制脂质过氧化，保护机体免受自由基的进一步伤害，发挥保肝护肝功效。本发明大叶糙苏提取物可以用于制备抗氧化类保健食品和药物，进一步的，可在制备抗氧化类保肝护肝食品和药物方面发挥功效。
图1为大叶糙苏提取物对DPPH自由基的清除率；图2为大叶糙苏提取物对ABTS自由基的清除率。
具体实施例方式下面结合实施例对 本发明作详细说明，但不构成对本发明的任何限制。实施例1本实施例中一种大叶糙苏提取物包括石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物；提取方法步骤如下(I)取大叶糙苏全草，洗净、阴干，粉碎后用甲醇浸泡、提取，回收甲醇，得总浸膏备用；(2)将步骤(I)的总浸膏分散乙醇水溶液中，加入石油醚萃取，将石油醚萃取液回收石油醚得石油醚提取物；(3)在步骤(2)石油醚萃取后的溶液中加入乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液回收乙酸乙酯得乙酸乙酯提取物；(4)在步骤(3)乙酸乙酯萃取后的溶液中加入正丁醇，将正丁醇萃取液回收正丁醇得正丁醇提取物。具体提取步骤为(I)取大叶糙苏全草lOOOg，洗净，阴干，粉碎，每次加入2000mL甲醇浸泡，浸泡2
次，每次浸泡4天，减压合并浸提液，回收甲醇，得总浸膏备用；(2)将步骤(I)的总浸膏分散于15%的乙醇水溶液中，每次加入IOOOmL石油醚进行萃取，萃取2次，合并石油醚萃取层，真空条件下在旋转蒸发仪中蒸干回收石油醚，即得石油醚提取物；(3)在步骤(2)石油醚萃取后的溶液中加入乙酸乙酯，每次加入IOOOmL,萃取2次，合并乙酸乙酯萃取层，真空条件下在旋转蒸发仪中蒸干回收乙酸乙酯，即得乙酸乙酯提取物；(4)在步骤(3)乙酸乙酯萃取后的溶液中加入正丁醇，每次加入IOOOmL,萃取2次，合并正丁醇萃取层，真空条件下在旋转蒸发仪中蒸干回收正丁醇，即得正丁醇提取物。实施例2本实施例中一种大叶糙苏提取物包括石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物；提取方法步骤如下(I)取大叶糙苏全草，洗净、阴干，粉碎后用甲醇浸泡、提取，回收甲醇，得总浸膏备用；(2)将步骤(I)的总浸膏分散乙醇水溶液中，加入石油醚萃取，将石油醚萃取液回收石油醚得石油醚提取物；(3)在步骤(2)石油醚萃取后的溶液中加入乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液回收乙酸乙酯得乙酸乙酯提取物；(4)在步骤(3)乙酸乙酯萃取后的溶液中加入正丁醇，将正丁醇萃取液回收正丁醇得正丁醇提取物。具体提取步骤为(I)取大叶糙苏全草lOOOg，洗净，阴干，粉碎，每次加入2000mL甲醇浸泡，浸泡4
次，每次浸泡2天，减压合并浸提液，回收甲醇，得总浸膏备用；(2)将步骤(I)的总浸膏分散于10%的乙醇水溶液中，每次加入IOOOmL石油醚进行萃取，萃取3次，合并石油醚萃取层，真空条件下在旋转蒸发仪中蒸干回收石油醚，即得石油醚提取物；(3)在步骤(2)石油醚萃取后的溶液中加入乙酸乙酯，每次加入IOOOmL,萃取3次，合并乙酸乙酯萃取层，真空条件下在旋转蒸发仪中蒸干回收乙酸乙酯，即得乙酸乙酯提取物；(4)在步骤(3)乙酸乙酯萃取后的溶液中加入正丁醇，每次加入IOOOmL,萃取3次，合并正丁醇萃取层，真空条件下在旋转蒸发仪中蒸干回收正丁醇，即得正丁醇提取物。实施例3本实施例中一种大叶糙苏提取物包括石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物；提取方法步骤如下(I)取大叶糙苏全草，洗净、阴干，粉碎后用甲醇浸泡、提取，回收甲醇，得总浸膏备用；(2)将步骤(I)的总浸膏分散乙醇水溶液中，加入石油醚萃取，将石油醚萃取液回收石油醚得石油醚提取物；(3)在步骤(2)石油醚萃取后的溶液中加入乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液回收乙酸乙酯得乙酸乙酯提取物；(4)在步骤(3)乙酸乙酯萃取后的溶液中加入正丁醇，将`正丁醇萃取液回收正丁醇得正丁醇提取物。具体提取步骤为(I)取大叶糙苏全草lOOOg，洗净，阴干，粉碎，每次加入IOOOmL甲醇浸泡，浸泡3
次，每次浸泡3天，减压合并浸提液，回收甲醇，得总浸膏备用；(2)将步骤(I)的总浸膏分散于5%的乙醇水溶液中，每次加入IOOOmL石油醚进行萃取，萃取4次，合并石油醚萃取层，真空条件下在旋转蒸发仪中蒸干回收石油醚，即得石油醚提取物；(3)在步骤(2)石油醚萃取后的溶液中加入乙酸乙酯，每次加入IOOOmL,萃取4次，合并乙酸乙酯萃取层，真空条件下在旋转蒸发仪中蒸干回收乙酸乙酯，即得乙酸乙酯提取物；(4)在步骤(3)乙酸乙酯萃取后的溶液中加入正丁醇，每次加入IOOOmL,萃取4次，合并正丁醇萃取层，真空条件下在旋转蒸发仪中蒸干回收正丁醇，即得正丁醇提取物。试验例I大叶糙苏提取物的体外抗氧化活性试验试验材料与方法材料实施例2制备得到的大叶糙苏提取物，以BHT为阳性对照，以不加入大叶糙苏提取物为空白对照。试剂DPPH (日本东京化成工业株式会社)，ABTS (美国Fluka公司)，TPTZ (比利时Acros organics 公司)，Trolox (美国 Aldrich 公司)，二丁基轻基甲苯(BHT,比利时 Acrosorganics公司)，甲醇(AR级)。仪器UV-2000型紫外可见分光光度计(尤尼可上海仪器有限公司)，电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，CS-Hl型混合器(北京博励阳科技公司)，各种移液器及枪头等。方法(1)DPPH (二苯代苦味酰基自由基)法，先将样品用甲醇配制成一系列浓度，取0.1mL样品加入3. 5mL浓度为0. 06mmol/L DPPH甲醇溶液,混勻，30min后测定其在515nm处的吸光度；同法，以甲醇代替样品测定空白对照的吸光度。每份样品平行操作3次，取平均值，再利用下面的公式计算DPPH自由基清除率DPPH清除率(％) = [ (A空白-A样品)/A空白]X 100然后用0rigin6. 0软件绘制浓度-清除率关系图，计算样品清除DPPH自由基的半数抑制率IC5tl值。原理为DPPH 是一种很稳定的以氮为中心的自由基，其孤对电子在515nm附近有强吸收。当样品中有供氢能力的抗氧化剂存在时，DPPH自由基孤对电子被配对，吸收消失或减弱，吸光度变小，其变小的程度与自由基被清除的程度呈定量关系。(2) ABTS (2,2/ -连氨_(3_乙基苯并噻唑啉_6_磺酸)法，先将样品用甲醇配制成一系列浓度，取0. 15mL样品加入2.85mL ABTS自由基工作液，混匀，IOmin后测定其在734nm处的吸光度；同法以甲醇代替样品测定空白对照的吸光度。每份样品平行操作3次，取平均值，再利用下面的公式计算ABTS自由基清除率ABTS清除率(%) = [ (A空白-A样品)/A空白]X 100然后用0rigin6. 0软件绘制浓度-清除率关系图，计算样品清除ABTS自由基的半数抑制率IC50值。原理为ABTS是一种水溶性的自由基引发剂，经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自 由基ABTS +，当向其中加入的被测物质含有抗氧化物，该物质会与ABTS +发生反应而使反应体系颜色褪去，ABTS+在734nm处有最大吸收，此处采用K2S2O8与ABTS直接反应生成稳定的ABTS +来测定样品的抗氧化能力的。(3) FRAP (铁离子还原能力)法，先将样品用甲醇配制成初始浓度为2mg/mL的溶液，取0. 2mL样品加入3. 8mL新鲜配制的TPTZ工作液，混匀，37°C反应30min后测定其在593nm处吸光度，每份样品平行操作3次，取平均值。若所测定样品吸光度值超过线性范围，则需要进一步稀释样品。将Trolox用甲醇配置成浓度范围在25 400 iimol/L的一系列浓度，与样品同法测定，绘制浓度-吸光度标准曲线，作为样品处理的依据。原理在低pH值的溶液中，Fe3+-三卩比唳三哑嗪(tripyridyl-triazine, TPTZ)可被抗氧化剂还原为Fe2+形式，呈现出明显的蓝色，并在593nm处有最大吸收，根据吸光度的大小计算出抗氧化活性的强弱，结果可以以Fe2+当量或相对于标准抗氧化剂的能力来表示，此处采用Trolox来表示样品的抗氧化活性。大叶糙苏提取物的体外抗氧化活性试验结果见下表I及图1、2。表I大叶糙苏提取物的抗氧化活性
权利要求
1.一种大叶糙苏提取物，其特征在于包括石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物；提取方法步骤如下(I)取大叶糙苏全草，洗净、阴干，粉碎后用甲醇浸泡提取，回收甲醇，得总浸膏备用；(2)将步骤(I)的总浸膏分散乙醇水溶液中，加入石油醚萃取，将石油醚萃取液回收石油醚得石油醚提取物；(3)在步骤(2)石油醚萃取后的溶液中加入乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液回收乙酸乙酯得乙酸乙酯提取物；(4)在步骤(3)乙酸乙酯萃取后的溶液中加入正丁醇，将正丁醇萃取液回收正丁醇得正丁醇提取物。
2.一种如权利要求1所述的大叶糙苏提取物的提取方法，其特征在于具体步骤如下(1)取大叶糙苏全草，洗净、阴干，粉碎后用甲醇浸泡提取，回收甲醇，得总浸膏备用；(2)将步骤(I)的总浸膏分散乙醇水溶液中，加入石油醚萃取，回收石油醚得石油醚提取物；(3)在步骤(2)石油醚萃取后的溶液中加入乙酸乙酯进行萃取，回收乙酸乙酯得乙酸乙酯提取物；(4)在步骤(3)乙酸乙酯萃取后的溶液中加入正丁醇，回收正丁醇得正丁醇提取物。
3.根据权利要求2所述的大叶糙苏提取物的提取方法，其特征在于步骤(I)中甲醇的浸泡次数为3次,浸泡时间为3天。
4.一种如权利要求1所述的大叶糙苏提取物的应用，其特征在于所述的大叶糙苏提取物在制备抗氧化类保健食品或药物方面的应用。
5.根据权利要求1所述的大叶糙苏提取物的应用，其特征在于所述的大叶糙苏提取物中乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在制备保肝护肝食品或药物方面的应用。
6.根据权利要求5所述的大叶糙苏提取物的应用，其特征在于所述的大叶糙苏提取物中乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在制备抗急性肝损伤类保健食品或药物方面的应用。
7.根据权利要求6所述的大叶糙苏提取物的应用，其特征在于所述的大叶糙苏提取物中乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在制备降低急性肝损伤中血清GPT活力的保健食品或药物方面的应用。
8.根据权利要求6所述的大叶糙苏提取物的应用，其特征在于所述的大叶糙苏提取物中乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在制备降低急性肝损伤中血清GOT活力的保健食品或药物方面的应用。
9.根据权利要求6所述的大叶糙苏提取物的应用，其特征在于所述的大叶糙苏提取物中乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在制备升高急性肝损伤中肝脏SOD活力的保健食品或药物方面的应用。
10.根据权利要求6所述的大叶糙苏提取物的应用，其特征在于所述的大叶糙苏提取物中乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在制备降低急性肝损伤中肝脏MDA水平的保健食品或药物方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种大叶糙苏提取物、提取方法及其在制备抗氧化类药物和保肝护肝类药物方面的应用，属于医药技术领域。大叶糙苏提取物包括石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物；提取方法包括如下步骤(1)取大叶糙苏全草，洗净、阴干，粉碎后用甲醇浸泡、提取，回收甲醇，得总浸膏备用；(2)将总浸膏分散乙醇水溶液中，加入石油醚萃取，回收石油醚得石油醚提取物；(3)在石油醚萃取后的溶液中加入乙酸乙酯进行萃取，回收乙酸乙酯得乙酸乙酯提取物；(4)在乙酸乙酯萃取后的溶液中加入正丁醇，回收正丁醇得正丁醇提取物。本发明大叶糙苏提取物具有抗氧化活性和保肝护肝功效，可用于制备抗氧化类以及保肝护肝保健食品或药物。
文档编号A61K36/53GK103040932SQ20121058095
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者康文艺, 顾海鹏, 尹震花 申请人:河南大学