专利名称：产高光学纯度d-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物新亚种及其应用，具体地，涉及产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis)以及该亚种的四个菌株，即棒状乳杆菌陕西亚种SZD-2菌株(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis SZD-2)、棒状乳杆菌陕西亚种 SZD-5 菌株(Lactobacillus coryniformissubsp.shaanxiensis SZD-5)> 棒状乳杆菌陕西亚种 SZD-9 菌株(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis SZD-9)和棒状乳杆菌陕西亚种 SZD-10 菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensisSZD-10),和它们的应用。
背景技术：
乳酸是一种重要的可降解、无污染的化工原料，其在医药、食品、石油化工等领域有着广泛的用途，具有重要的经济价值。因此便捷、高效的乳酸合成或制备方法成为当前的重要研究方向，同时技术上的突破也具有较广阔的实用价值和前景。乳酸学名2-羟丙酸，因分子中含有一个不对称碳原子，形成右旋、左旋两种旋光异构体，将右旋乳酸简称D-乳酸、左旋乳酸简称L-乳酸。利用乳酸生产出的聚乳酸(PLA)，这种聚合物有良好的生物相容性和生物可降解性，其降解的最终产物是二氧化碳和水，对人体及环境无害。聚乳酸具有十分广阔的用途，如应用于医药方面的手术缝合线、药物控释制剂和骨折内固定材料等。同时聚乳酸作为生物塑料原料近年受到广泛关注。研究表明用纯L-乳酸制成的聚乳酸(PLLA)具有“质地脆硬、强度差、不易加 工”等缺点，且成本较高，应用受到较大的限制。如果将L-乳酸与D-乳酸按一定比例聚合后，可制成“具耐热性”的聚乳酸立构复合物(stereo complex, SC-PLA)，SC-PLA的强度及耐热性均可得到大幅度改善，应用领域大大拓宽。目前工业上生产或制备L-乳酸的技术相对较为成熟，而D-乳酸的制备较为复杂、且成本较高，D-乳酸的制备技术或方法成为影响乳酸相关产业发展的瓶颈，因此研究或发展一种低成本、高效、便捷的D-乳酸生产或制备技术成为该领域的重大课题，探寻高产率、高光学纯度的产D-乳酸的菌株成为极有意义及价值的研究方向。
发明内容
本发明所解决的技术问题是，现有技术中缺乏产高光学纯度D-乳酸的菌株。为了解决该技术问题，本发明提供一种能够产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)陕西亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis)。本发明提供了能够产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)陕西亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis)。该陕西亚种分离自陕西西安地区的民间传统酸菜。
本发明筛选的该棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)陕西亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis)具体涉及 4 个菌株，分别是产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种SZD-2菌株(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis SZD-2)，保藏编号为CGMCC N0.6891 ;产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种 SZD-5 菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-5),保藏编号为CGMCC N0.6892 ;产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种SZD-9菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-9),保藏编号为CGMCC N0.6893 ；产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种SZD-10菌株(Lactobacillus coryniformissubsp.shaanxiensis SZD-10)，保藏编号为 CGMCC N0.6894。本发明提供了一种D-乳酸单体，采用本发明的棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)陕西亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis)或如上菌株通过发酵而获得。本发明还提供了一种 聚乳酸制品，采用本发明的棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)陕西亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis)或如上菌株发酵产生的D-乳酸单体聚合制成。本发明还涉及本发明的棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)陕西亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis)或如上菌株在制备D-乳酸单体中的应用。本发明还涉及本发明的棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)陕西亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis)或如上菌株在制备含有D-乳酸单体聚合成的聚乳酸的制品中的应用。所述聚乳酸制品是手术缝合线、药物控释制剂或骨折内固定材料。所述聚乳酸制品还可以是生物塑料制品。本发明的陕西亚种或菌株具体通过如下方法分离得到:取陕西西安地区民间传统酸菜原液；用灭菌接种环取原液，在血平板上三区划线接种，35°C培养48小时后观察菌落生长状况；用灭菌接种环从平板上选取菌落形态不同的菌落，分别采用三区划线法接种于不同的血平板，35°C培养48小时，观察每个平板菌落形态是否一致，重复以上操作直至每个平板上菌落形态一致，最终分离到4株产高光学纯度D-乳酸的菌株，即SZD-2、SZD-5、SZD-9、SZD-1O。分离筛选得到的4株菌均为革兰氏阳性短杆菌，无芽孢，兼性厌氧，在pH4.5生长，接触酶及氧化酶阴性，产乳酸，不产吲哚和硫化氢，不液化明胶，根据《伯杰细菌鉴定手册》(1984年，第八版，科学出版社)和《伯杰氏系统细菌学手册》(2009年，第二版.第三卷.斯普林格出版社)(Bergey ' smanual of systematic bacteriology.2009,2nded.Vol.3.Springer, p.)，可鉴定其属于乳杆菌属(Lactobacillus)。根据《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》(1999年，中国轻工业出版社)、《伯杰细菌鉴定手册》(1984年，第八版，科学出版社)和《伯杰氏系统细菌学手册》(2009年，第二版.第三卷.斯普林格出版社)(Bergey' s manual ofsystematic bacteriology.2009,2nd ed.Vol.3.Springer, p.),分离筛选得到的4株菌对碳水化合物发酵的性质符合乳杆菌属棒状乳杆菌。另外，这4株菌的16S rDNA基因序列与乳杆菌属棒状乳杆菌已知的两个亚种(棒状乳杆菌棒状亚种和棒状乳杆菌扭曲亚种)相应序列的相似率均达99%以上。因此，可将其确定为乳杆菌属棒状乳杆菌种(Lactobacillus coryniformis)。目前棒状乳杆菌分为棒状亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis)和扭曲亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.torquens),从生化特性区分二者主要依据所产乳酸旋光性、部分碳水化合物的发酵试验及石蕊牛奶试验等。综合分离筛选得到的4株菌的产乳酸旋光性、对碳水化合物的发酵及石蕊牛奶试验结果，该4株菌与两个已知亚种均不完全相符。另外，该4株菌的4个种内基因序列差异较大的蛋白编码基因序列和棒状乳杆菌的两个已知亚种均不完全相符。综合分离筛选得到的4株菌的形态学特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果以及4种蛋白编码基因同源性鉴定结果，将该4株菌鉴定为乳杆菌属棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)的新亚种，即陕西亚种。本发明提供的乳杆菌属棒状乳杆菌陕西亚种的各个菌株所产D-乳酸的光学纯度均高达100%，用其可以制备各种需要D-乳酸作为原料的聚乳酸制品，例如应用于医药方面的手术缝合线，药物控释制剂和骨折内固定材料或者生物塑料原料或具有耐热性的高强度SC-PLA制品。
本发明菌株的保藏信息棒状乳杆菌陕西亚种SZD-2 菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-2,本文中简称为“SZD-2”)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);保藏地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码=100101 ;保藏日期:2012年11月28日;保藏编号CGMCC N0.6891。棒状乳杆菌陕西亚种SZD-5 菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-5,本文中简称为“SZD-5”)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);保藏地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码=100101 ;保藏日期:2012年11月28日;保藏编号CGMCC N0.6892。棒状乳杆菌陕西亚种SZD-9 菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-9,本文中简称为“SZD-9”)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);保藏地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码=100101 ;保藏日期:2012年11月28日;保藏编号CGMCC N0.6893。棒状乳杆菌陕西亚种SZD-10 菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-10,本文中简称为“SZD-10”),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);保藏地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101 ;保藏日期:2012年11月28日；保藏编号CGMCC N0.6894。
图1:A至D分别是实施例1中的SZD-2、SZD-5、SZD-9、SZD-10菌株的菌落外观形态图；图2:A至D分别是实施例1中的SZD-2、SZD-5、SZD-9、SZD-10菌株革兰氏染色结果的显微镜照片图(X1000放大倍数)；图3:A至D分别是实施例1中的SZD-2、SZD-5、SZD-9、SZD-10菌株芽孢染色结果的显微镜照片图(X1000放大倍数)。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。本发明实施例中所用到的仪器型号参数说明如下:显微镜:生物显微镜olympus-cx31_32C02。培养箱:HWS-350智能恒温恒湿箱，宁波海曙赛福实验仪器厂。浊度计:浊度计DL-ZDl，珠海迪尔生物工程有限公司。离心机:白洋B80型自动平衡离心机，白洋离心机厂。恒温器:其林贝尔干式恒温器GL-150，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司。离心机:TG16_WS台式高速离心机，长沙卢湘仪离心机仪器有限公司。PCR仪:Bio-Rad iCycler PCR仪，上海爱丁堡生物科技发展有限公司。电泳仪:EPS_100核酸电泳仪，上海圣科仪器设备有限公司。凝胶成像分析系统:Gel Logic 100凝胶成像分析系统，美国柯达公司。高效液相色谱仪:Waters高效液相色谱仪2695，美国沃特世公司；waterS紫外检测器2489,美国沃特世公司；色谱柱:型号为Chirex 3126 (D)-penicillami的手性柱，内径
4.6mm，长度250mm，美国菲罗门公司；L_乳酸(色谱纯，98%纯度)，美国西格玛-奥德里奇公司出品；D-乳酸(色谱纯，93%纯度)美国西格玛-奥德里奇公司出品。本发明实施例中所用到的试剂说明如下:血平板(英国OXOID哥伦比亚血琼脂平板BR9CM，赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司出售):每升含蛋白胨10g，牛肉浸出粉10g，氯化钠5g，琼脂15g，脱纤维羊血80ml，pH 7.4+0.2。MRS肉汤培养基基础(北京奥博星生物技术有限责任公司出售):每升含葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母粉4g，柠檬酸三铵2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰 0.05g，吐温 801ml，pH 值 6.2±0.1。MRS液体培养基:MRS肉汤培养基基础48g+蒸馏水1000ml，121°C灭菌15分钟。MRS固体培养基:MRS肉汤培养基基础48g+琼脂(北京奥博星生物技术有限责任公司出售)15g+蒸馏水1000ml，121°C灭菌15分钟。MRS半固体培养基:MRS肉汤培养基基础48g+琼脂(北京奥博星生物技术有限责任公司出售)5g+蒸馏水1000ml，121°C灭菌15分钟。保藏菌种用培养基:MRS肉汤培养基基础48g+碳酸钙(天津市光复科技发展有限公司出售)IOg+蒸馏水IOOOmL, 121°C灭菌15分钟。吲哚试验培养基(天津市金章科技发展有限公司出售):蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸懼水1000ml。硝酸盐还原试验培养基(天津市金章科技发展有限公司出售):蛋白胨10g，硝酸钾2g,蒸懼水1000ml。明胶液化试验培养基(天津市金章科技发展有限公司出售):牛肉浸膏3g，蛋白胨5g,明胶120g,蒸懼水IOOOmlo柠檬酸盐利用试验培养基(天津市金章科技发展有限公司出售):硫酸镁0.2g，磷酸二氢铵lg，磷酸氢二钾lg，柠檬酸钠5g、琼脂20g，0.2%溴麝香草酚蓝溶液40ml，蒸馏水IOOOml0硫化氢试验培养基(天津市金章科技发展有限公司出售):蛋白胨20g，牛肉粉3g,氯化钠IOg,酵母粉3g,乳糖IOg,葡萄糖Ig,朽1檬酸铁铵0.5g、硫代硫酸钠0.5g,蒸懼水IOOOml。精氨酸双水解试验培养基(天津市金章科技发展有限公司出售):蛋白胨5g，肉浸膏5g，葡萄糖0.5g，吡多醛5mg，L-精氨酸10g，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.625ml,甲酚红液
2.5ml,蒸懼水 1000ml。淀粉水解培养基基础(杭州百思特生物技术有限公司出售):蛋白胨5g，牛肉粉5g,淀粉3g,琼脂15g,氯化钠5g。淀粉水解试验固体培养基:淀粉水解培养基基础33g，MRS肉汤培养基基础12g，蒸馏水1000ml，121°C灭菌15分钟。石蕊牛奶生化管(青岛日水生物技术有限公司出售):脱脂奶粉100g，石蕊0.75g,蒸懼水 1000ml。API50CHL培养基(法国 生物梅里埃公司出售):多胨10g，酵母膏5g，柠檬酸铵2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g,硫酸镁0.2g,硫酸猛0.05g,吐温80 ImL,溴甲酹酯0.17g,蒸懼水 IOOOmloAPI50CH碳水化合物鉴定试剂条(法国生物梅里埃公司出售)，含阴性对照及以下49种碳水化合物:D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-山梨糖、L-鼠李糖、甘露醇、山梨醇、N-乙酰葡萄糖胺、熊果苷、七叶灵、水杨苷、D-麦芽糖、D-蔗糖、葡萄糖酸钾、甘露醇、赤藻糖醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、D-侧金盏花醇1、甲基-β D吡喃木糖苷、卫茅醇、肌醇、甲基_aD吡喃甘露糖苷、甲基_aD吡喃葡萄糖苷、苦杏仁苷、D-纤维二糖、D-乳糖、D-蜜二糖、D-海藻糖、菊粉、D-松三糖、D-棉子糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-龙胆二糖、D- 土伦糖、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-阿拉伯醇、L-阿拉伯醇、2-酮基葡萄糖酸钾及5-酮基葡萄糖酸钾。Chelex-100树脂:BioRad公司(美国伯乐公司)Biowest Regular Agarose G-10 (西班牙琼脂糖 G-10):Gene C0.LTD (美国基因有限公司)。LA Taq(长片段保真 Taq DNA 聚合物酶):TaKaRaBiotectnology (Dalian)C0.LTD (宝生物工程(大连)有限公司)。Ex Taq (高保真 Taq DNA 聚合物酶):TaKaRa Biotectnology (Dalian) C0.LTD (宝生物工程(大连)有限公司)。10XLA PCR Buffer II (Mg2+Plus) (10 倍长片段保真 Taq 酶 PCR 缓冲液 II (加入Mg2+)):TaKaRa Biotectnology (Dalian)C0.LTD(宝生物工程(大连)有限公司)。IOXEx Taq Buffer (Mg2+Plus) (10 倍高保真 Taq 酶 PCR 缓冲液(加入 Mg2+)):TaKaRa Biotectnology (Dalian) C0.LTD (宝生物工程(大连)有限公司)。dNTP Mixture (dNTP 混合物):TaKaRa Biotectnology (Dalian) C0.LTD (宝生物工程(大连)有限公司)。6XLoading Buffer(6 倍上样缓冲液):TaKaRa Biotectnology(Dalian)C0.LTD (宝生物工程(大连)有限公司)。DL2,000DNA Marker (DL2,000DNA 标记):TaKaRaBiotectnology (Dalian)C0.LTD (宝生物工程(大连)有限公司)。细菌16S rDNA 通用引物(F: 5 ’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3 ’，R:5’ ACGGCTACCTTGTTACGACTT3’ ):由生工生物工程(上海)有限公司合成。HSP60基因、pheS基因、rpoA基因及tuf基因的相应PCR引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。实施例1乳杆菌属棒状乳杆菌陕西亚种中各个菌株的鉴定(I)本发明的菌株的分离筛选过程随机取12份陕西西安地区民间传统酸菜原液；用灭菌接种环取原液，在血平板上三区划线接种，35 °C培养48小时后观察菌落生长状况；用灭菌接种环从平板上选取菌落形态不同的菌落，分别采用三区划线法接种于不同的血平板，35°C培养48小时，观察每个平板菌落形态是否一致，重复以上操作直至每个平板上菌落形态一致，最终分离到4株产高光学纯度D-乳酸的菌株，即棒状乳杆菌陕西亚种SZD-2菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensisSZD-2)、棒状乳杆菌陕西亚种 SZD-5菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-5)、棒状乳杆菌陕西亚种SZD-9 菌株(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis SZD-9)、棒状乳杆菌陕西亚种 SZD-10 菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-10)。
⑵4个菌株的产乳酸旋光性实验实验方法:采用高效液相色谱法测定D-乳酸、L-乳酸的含量。色谱条件:流动相:2mmol/L CuSO4溶液(溶剂为5%的异丙醇溶液)，使用前经0.45 μ m滤膜过滤；流动相流速为0.7ml/min ;柱温30°C ;紫外检测器，检测波长为254am ；分析步骤:按上述色谱条件准备好色谱仪和流动相；将试验菌株新鲜培养物接种于MRS液体培养基，35°C培养48小时。将发酵液在8000r/min下离心15分钟，上清液再通过0.45 μ m滤膜过滤，取Iml滤液进行10倍稀释，然后超声脱气，即为待测液；将待测液样品放入样品瓶中，进样量20μ 1，进样时间30分钟。使用标准曲线法，根据已建立的标准曲线积分计算出待测液样品中D-乳酸及L-乳酸的含量。实验结果:见表I表I产乳酸旋光性实验结果
权利要求
1.一种产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种(Lactobacilluscoryniformissubsp.shaanxiensis)。
2.一种产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种SZD-2菌株(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis SZD-2)，其保藏编号为 CGMCC N0.6891。
3.一种产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种SZD-5菌株(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis SZD-5),其保藏编号为 CGMCC N0.6892。
4.一种产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种SZD-9菌株(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxien sis SZD-9),其保藏编号为 CGMCC N0.6893。
5.一种产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种SZD-1O菌株(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis SZD-10)，其保藏编号为 CGMCC N0.6894。
6.一种D-乳酸单体，采用权利要求1所述的棒状乳杆菌陕西亚种通过发酵而获得。
7.一种D-乳酸单体，采用权利要求2-5任一项所述的菌株通过发酵而获得。
8.一种聚乳酸制品，采用权利要求1所述的棒状乳杆菌陕西亚种通过发酵而获得的D-乳酸单体聚合制成。
9.一种聚乳酸制品，采用权利要求2-5任一项所述的菌株通过发酵而获得的D-乳酸单体聚合制成。
10.权利要求1所述的棒状乳杆菌陕西亚种在制备D-乳酸单体中的应用。
11.权利要求2-5任一项所述的菌株在制备D-乳酸单体中的应用。
12.权利要求1所述的棒状乳杆菌陕西亚种在制备含有D-乳酸单体聚合成的聚乳酸的制品中的应用。
13.权利要求2-5任一项所述的菌株在制备含有D-乳酸单体聚合成的聚乳酸的制品中的应用。
14.如权利要求10-13任一项所述的应用，所述制品为手术缝合线、药物控释制剂或骨折内固定材料。
15.如权利要求10-13任一项所述的应用，所述制品为生物塑料制品。
全文摘要
本发明提供了产高光学纯度D-乳酸的棒状乳杆菌陕西亚种(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis)以及该亚种所涉及的4个菌株，即棒状乳杆菌陕西亚种SZD-2菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-2)、棒状乳杆菌陕西亚种SZD-5菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensisSZD-5)、棒状乳杆菌陕西亚种SZD-9菌株(Lactobacillus coryniformis subsp.shaanxiensis SZD-9)和棒状乳杆菌陕西亚种SZD-10菌株(Lactobacilluscoryniformis subsp.shaanxiensis SZD-10)。本发明还涉及采用本发明的棒状乳杆菌陕西亚种或所述菌株发酵产生的D-乳酸单体以及由D-乳酸单体聚合成的聚乳酸制品，还涉及本发明的棒状乳杆菌陕西亚种或所述菌株在制备D-乳酸单体以及在制备含有D-乳酸单体聚合成的聚乳酸的制品中的应用。
文档编号A61L17/12GK103114053SQ20121058142
公开日2013年5月22日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者张健鹏, 姚纲, 郑清月, 张薇 申请人:张健鹏