用于针对金黄色葡萄球菌免疫的稳定组合物的制作方法

用于针对金黄色葡萄球菌免疫的稳定组合物的制作方法
【专利摘要】将稳定添加剂加入到免疫原性组合物中可有效地增强抗原稳定性。合适的稳定添加剂包括EDTA(乙二胺四乙酸)、蔗糖、精氨酸、蛋白酶抑制剂、甘油和/或柠檬酸盐。
【专利说明】用于针对金黄色葡萄球菌免疫的稳定组合物
[0001]本申请要求2011年12月23日提交的美国临时申请61/580.191的权益，它们所有的完整内容特此通过引用并入本文用于所有目的。
【技术领域】
[0002]本发明涉及包含源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抗原的免疫原性组合物和它们在免疫中的用途。
【背景技术】
[0003]金黄色葡萄球菌(S.aureus)是一种革兰氏阳性的球形细菌，且是血流、下呼吸道、皮肤和软组织感染的主要原因。它造成从轻微皮肤感染至危及生命的疾病的许多疾病，并且与金黄色葡萄球菌有关的美国每年死亡率超过任意其它传染性疾病(包括HIV/AIDS)
的死亡率。
[0004]目前没有批准的针对金黄色葡萄球菌的疫苗。与安慰剂组相比，基于得自细菌类型5和8的表面多糖的混合 物的疫苗StaphVAX?在2005年的III期临床试验中没有减少感染。参考文献I报道了关于得自Merck和Intercell的“V710”疫苗的数据，该疫苗是基于单一抗原IsdB，一种保守的隔离铁的细胞表面蛋白[2，3]。
[0005]参考文献4公开了不同的金黄色葡萄球菌抗原和它们的组合，包括“Combo-l”(EsxA、EsxB、突变体 Hla、Sta006 和 StaOll 的混合物)和“Combo_2”(EsxA、EsxB、IsdA, Sta006和StaOll的混合物)。在关于这些抗原的其它工作中，本发明的发明人已经观察到，金黄色葡萄球菌多肽抗原在简单缓冲溶液中可以是不稳定的。抗原的不稳定性是不希望的，因为:(I)它不允许疫苗在施用之前储存长时间段；(2)降解产物在施用时可能是有害的(例如抑制性的)；和(3)批与批之间的疫苗不一致性不会满足质量要求和管理批准要求。因此，本发明的一个目的是，稳定化免疫原性组合物中的金黄色葡萄球菌多肽抗原。

【发明内容】

[0006]发明人已经发现，向疫苗制剂中添加稳定添加剂可有效地增强抗原稳定性。一种合适的稳定添加剂是EDTA，因为这被证实可特别有效地稳定化抗原。发明人认为，EDTA可能在抑制氧化还原反应中起作用，具体地通过螯合在抗原的降解机制中涉及的金属离子，或通过抑制金属蛋白酶对抗原的降解。发明人还已经证实，低浓度的EDTA(例如低于IOOmM)在疫苗制剂中的存在对疫苗的热特性没有显著影响，且不会引起任何不希望的塑化效应，从而意味着含有EDTA的组合物可以被冻干以进一步增加储存稳定性。
[0007]因而，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含EsxA抗原、EsxB抗原和稳定添加剂。所述组合物可以呈水性形式，在该情况下，它理想地具有5-6.5的pH。所述组合物还可以包括佐剂例如铝盐。
[0008]使用EDTA和5-6.5的pH的组合会在稳定化金黄色葡萄球菌疫苗的抗原中提供协同效应。优选地，所述pH是约6。
[0009]可以将EsxA和EsxB抗原组合为如下面讨论的杂合多肽，例如含有在EsxA抗原的下游的EsxB抗原的EsxAB杂合体。所述EsxAB杂合多肽可以以单体或寡聚体形式存在。所述寡聚体可以是二聚体、三聚体或更多。
[0010]本发明还提供了二聚体形式的EsxAB杂合多肽。在有些条件下，EsxAB的单体和二聚体形式在溶液中达到平衡。所述二聚体形式通过2个单体分子的二聚化形成，所述二聚化通过每个EsxAB单体的独特半胱氨酸残基的硫醚基团实现。所述单体形式在免疫原性组合物中是优选的，因为它比二聚体形式更稳定，并且二聚体形式的产生(例如通过氧化反应)是不一致的，所以导致纯度变化。发明人已经观察到，EDTA会稳定化EsxAB单体形式并保持制剂的总体高选择性(即单体EsxAB相对于总EsxAB的高比例)。
[0011]本发明的免疫原性组合物还可以包含其它金黄色葡萄球菌抗原，具体地为Sta006、StaOll和Hla。这些抗原在参考文献4中进行了详细讨论。本发明的一种特别有用的组合物包括所有这5种抗原(即EsxA、EsxB, Sta006、StaOll和Hla，优选地含有Hla的无毒突变体形式)。在没有稳定添加剂存在下，Sta006、StaO 11和Hla与EsxAB的简单组合在水性条件下不是完全稳定的。发明人认为，EsxAB与Sta006和StaOll —起在缓冲溶液中执行氧化还原反应。添加EDTA和将组合物的pH调至约pH6，会将EsxAB维持在它的单体形式，并使对其它组分的干扰最小化。
[0012]在本发明的某些实施方案中，所述其它抗原可以是多肽和/或糖。例如，它们还可以有用地包括一种或多种金黄色葡萄球菌荚膜糖缀合物，例如针对血清型5和/或血清型8菌株。在其它实施方案中，所述组合物不包括其它葡萄球菌多肽抗原。在其它实施方案中，所述组合物不包括其它 葡萄球菌抗原。在另一个实施方案中，所述组合物不包括其它抗原。
[0013]本发明还提供了本发明的免疫原性组合物的冻干物(lyophilizate)。该冻干物可以用水性材料重构，以提供本发明的水性免疫原性组合物。因此，为了施用，用合适的液体稀释剂(例如缓冲液、盐水溶液、注射用水)重构冻干物。所述液体稀释剂可以包括佐剂例如铝盐或水包油乳剂佐剂。
[0014]本发明还提供了包含EDTA和至少一种抗原的冻干物。所述抗原优选地是多肽。
[0015]本发明还提供了 Sta006抗原的寡聚体以及包含这样的寡聚体的免疫原性组合物。所述寡聚体可以是二聚体、三聚体、四聚体或更高。寡聚体可以包含Ca++离子，且包含Sta006寡聚体的组合物可以包含5-500mM Ca++离子。
[0016]本发明还提供了 Sta006抗原和StaOll抗原的异源二聚体。该二聚体可以包含Ca++离子，且包含这样的二聚体的组合物可以包含5-500mM Ca++离子。
[0017]金黄色葡萄球菌抗原
[0018]EsxA
[0019]' EsxA'抗原被注解为'蛋白,。在 NCTC 8325 菌株中，EsxA 是 SA0UHSC_00257且具有氨基酸序列SEQ ID NO:10(G1:88194063)。
[0020]本发明的EsxA抗原可以引起识别SEQ ID NO:10的抗体(例如当施用给人时)，和/或可以包含这样的氨基酸序列，其:(a)与SEQ ID NO: 10具有50%或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更多)；和/或(b)包含SEQIDN0:10的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中,n'是7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90 或更多)。这些EsxA蛋白包括SEQ ID NO:10的变体。(b)的优选片段包含得自SEQ ID NO:10的表位。其它优选片段缺少SEQ IDNO:10的C-端的一个或多个氨基酸(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多)和/或SEQ ID NO:10的N-端的一个或多个氨基酸(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多)，同时保留SEQ IDNO: 10的至少一个表位。其它片段缺失一个或多个蛋白结构域。
[0021]EsxB
[0022]' EsxB'抗原被注解为'EsxB'。在 NCTC 8325 菌株中，EsxB 是 SA0UHSC_00265且具有氨基酸序列SEQ ID NO:11 (G1:88194070)。
[0023]本发明的EsxB抗原可以引起识别SEQ ID NO:11的抗体(例如当施用给人时)，和/或可以包含这样的氨基酸序列，其:(a)与SEQ ID NO: 11具有50%或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更多)；和/或(b)包含SEQ IDN0:11的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中,n'是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100 或更多)。这些EsxB蛋白包括SEQ IDNO: 11的变体。(b)的优选片段包含得自SEQ ID NO: 11的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO:11的C-端的一个或多个氨基酸(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多)和/或SEQ ID NO:11的N-端的一个或多个氨基酸(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多)，同时保留SEQ IDNO: 11的至少一个表位。其它片段缺失一个或多个蛋白结构域。
[0024]EsxAB
[0025]在组合物包括EsxA和EsxB抗原的情况下，这些可以呈现为单一多肽(即作为融合多肽)。因此，单一多肽可以引起识别SEQ ID NO:10和SEQ ID NO: 11的抗体(例如当施用给人时)。所述单一多肽可以包括:(i)第一多肽序列，其与SEQ ID N0:10具有50%或更多同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99.5%或更多)和/或包含如上面关于EsxA定义的SEQ ID NO:10的至少'n'个连续氨基酸的片段；和(ii)第二多肽序列，其与SEQIDN0:11具有50%或更多同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%、97%、98%、99%、99.5%或更多)和/或包含如上面关于EsxB定义的SEQ ID NO:11的至少'n'个连续氨基酸的片段。所述第一多肽序列和第二多肽序列在N-端至C-端可以是任意次序。SEQ ID NO:151( ‘EsxAB，)和152 ( ‘EsxBA，)是这样的多肽的例子，二者都具有六肽接头ASGGGS (SEQ ID NO:173)。另一种‘EsxAB，杂合体包含SEQ ID NO:241，可以给其提供N-端甲硫氨酸(例如SEQ ID NO:250)。
[0026]因此，一种有用的多肽包含这样的氨基酸序列:其(a)与SEQ ID NO:241具有80%或更多同一性(例如 80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99 %、99.5%或更多)；和/或(b)包含SEQ ID NO:241的氨基酸1-96的至少'n'个连续氨基酸的片段和SEQ ID NO:241的氨基酸103-205的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150,200,250或更多)。这些多肽(例如SEQ ID NO:250)可以引起抗体(例如当施用给人时)，所述抗体识别包含SEQ ID NO:10的野生型葡萄球菌蛋白和包含SEQ ID NO: 11的野生型葡萄球菌蛋白。因此，所述免疫应答会识别抗原EsxA和EsxB 二者。(b)的优选片段会提供得自SEQ ID NO:10的表位和得自SEQ ID NO: 11的表位。
[0027]Sta006
[0028]' Sta006 '抗原被注解为'铁络环肽结合蛋白'，并且还在文献[5]中被称作‘FhuD2’。在 NCTC 8325 菌株中，Sta006 是 SA0UHSC_02554 且具有氨基酸序列 SEQ ID NO:42 (G1:88196199)。在 Newman 菌株中，它是 nwmn_2185 (G1:151222397)。与本发明一起使用的Sta006可以引起识别SEQ IDNO:42的抗体(例如当施用给人时)，和/或可以包含这样的氨基酸序列，其:(a)与SEQ IDNO:42具有50%或更多同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99.5%或更多);和/或(b)包含SEQ IDNO:42的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些Sta006蛋白包括SEQ ID NO:42的变体。(b)的优选片段包含得自SEQ ID NO:42的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO:42的C-端的一个或多个氨基酸(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多)和/或SEQ ID NO:42的N-端的一个或多个氨基酸(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多)，同时保留SEQ ID NO:42的至少一个表位。SEQ ID NO:42的前17个N-端氨基酸可以有用地省略(以提供SEQ ID NO:246)。其它片段缺失一个或多个蛋白结构域。在参考文献6中报道了 Sta006的突变体形式。可以将Sta006抗原脂质化(lapidated)，例如用酰化的N-端半胱氨酸。一种有用的Sta006序列是SEQ ID NO:248，其具有在N-端的Met-Ala-Ser-序列。Sta006可以作为单体或寡聚体(例如二聚体)存在,Ca++离子有利于寡聚化。本发明可以使用Sta006的单体和/或寡聚体。Sta006可以是含有StaOll的同源二聚体或异源二聚体。
[0029]StaOll
[0030]/ StaOll'抗原被注解为'脂蛋白'。在NCTC 8325菌株中，StaOll是SA0UHSC_00052 且具有氨基酸序列 SEQ ID NO:47(G1:88193872)。
[0031]与本发明一起使用的StaOll抗原可以引起识别SEQ ID NO:47的抗体(例如当施用给人时)，和/或可以包含这样的氨基酸序列，其:(a)与SEQ ID NO:47具有50%或更多同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%、98%、99%、99.5%或更多)；和/或(b)包含SEQ IDNO:47的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些StaOll蛋白包括SEQ ID NO:47的变体。(b)的优选片段包含得自SEQ ID NO:47的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO:47的C-端的一个或多个氨基酸(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多)和/或SEQ ID NO:47的N-端的一个或多个氨基酸(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多)，同时保留SEQ ID NO:47的至少一个表位。SEQ ID NO:47的前23个N-端氨基酸可以有用地省略(以提供SEQ ID NO:247)。其它片段缺失一个或多个蛋白结构域。可以将StaOll抗原脂质化(lapidated)，例如用酰化的N-端半胱氨酸。一种有用的StaOlI序列是SEQ ID NO:249，其具有N-端甲硫氨酸。SEQIDNO:47的变体形式(其可以用作或用于制备StaOll抗原)包括、但不限于SEQ ID NO:213、214和215，其具有不同的Ile/Val/Leu置换。StaOll可以作为单体或寡聚体存在，Ca++离子有利于寡聚化。本发明可以使用StaOll的单体和/或寡聚体。
[0032]Hla
[0033]' Hla'抗原是'α-溶血素前体'，也被称为'α毒素'或简称为'溶血素,。在NCTC8325菌株中，Hla是SA0UHSC_01121且具有氨基酸序列SEQ ID NO:14(G1:88194865)。Hla是由大多数金黄色葡萄球菌菌株产生的重要毒力决定簇，具有孔形成和溶血活性。抗-Hla抗体在动物模型中可以中和毒素的有害作用，且Hla可特别有用地保护免于肺炎。
[0034]与本发明一起使用的Hla抗原可以引起识别SEQ ID NO:14的抗体(例如当施用给人时)，和/或可以包含这样的氨基酸序列，其:(a)与SEQ ID NO: 14具有50 %或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更多)；和/或(b)包含SEQ IDN0:14的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些Hla蛋白包括SEQ ID NO:14的变体。(b)的优选片段包含得自SEQ ID NO:14的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO:14的C-端的一个或多个氨基酸(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多)和/或SEQ IDNO:14的N-端的一个或多个氨基酸(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多)，同时保留SEQ ID NO:14的至少一个表位。SEQ ID NO:14的前26 个N-端氨基酸可以有用地省略(例如以提供SEQ ID NO:231)。还可以使用在C-端的截短，例如仅剩下50个氨基酸(SEQ ID NO:14的残基27-76) [7]。其它片段缺失一个或多个蛋白结构域。
[0035]通过化学灭活(例如使用甲醛、戊二醛或其它交联剂)，在本发明的组合物中可以避免Hla的毒性。但是，相反，优选的是，使用Hla的突变体形式，其除去了它的有毒活性，同时保留它的免疫原性。这样的脱毒突变体已经是本领域已知的。一种有用的Hla抗原具有在SEQ ID NO: 14的残基61处的突变，该残基是成熟抗原的残基35 (即省略前26个N-端氨基酸以后=SEQ ID NO:231的残基35)。因此，残基61可以不是组氨酸，且可以相反地是例如IIe、Val，或优选Leu。还可以使用在该位置的His-Arg突变。例如，SEQ IDNO:150是成熟的突变体Hla-H35L序列(即具有H35L突变的SEQ ID NO:231)，且一种有用的Hla抗原包含SEQ ID NO:150。另一种有用的突变用短序列替代长环，例如用四聚体诸如PSGS替代 SEQ ID NO: 14 的残基 136-174 处的 39 聚体(SEQ ID NO:225)，如在 SEQ ID NO: 189 (其也包括H35L突变)和SEQ ID NO:216 (其不包括H35L突变)中。另一种有用的突变用例如亮氨酸替代残基YlOl (SEQ ID NO:242)。另一种有用的突变用例如亮氨酸替代残基D152 (SEQID NO:243)。另一种有用的突变体用例如亮氨酸替代残基H35和YlOl (SEQ ID NO:244)。另一种有用的突变体用例如亮氨酸替代残基H35和D152 (SEQ ID NO:245)。
[0036]其它有用的Hla抗原公开在参考文献8和9中。
[0037]SEQ ID NO: 160、161 和 194 是 SEQ ID NO:14 的 3 种有用的片段(分别是 ‘Hla27_76’、‘Hla關，和 ‘Hla27_79，)。SEQ ID NO: 158、159 和 195 是得自 SEQ ID NO:150 的对应片段。[0038]一种有用的Hla序列是SEQ IDNO:232，其被用在实施例中。它具有N-端Met，然后是得自表达载体的Ala-Ser 二肽，然后是SEQ ID NO:150(得自NCTC8325菌株)。它由SEQIDNO:233 编码。
[0039]杂合多肽
[0040]在本发明中使用的抗原可以作为各个单独的多肽存在于组合物中。但是，在使用超过一种抗原的情况下，它们不一定作为单独的多肽存在。相反，至少2种(例如2种、3种、4种、5种或更多种)抗原可以表达为单个多肽链(‘杂合’多肽)。杂合多肽会提供2个主要优点:首先，通过添加克服该问题的合适杂合配偶体，可以辅助本身不稳定或者表达较差的多肽；其次，简化了商业生产，因为为了生产在抗原性方面都有用的两种多肽仅需利用一次表达和纯化。
[0041]所述杂合多肽可以包含2个或更多个来自第一抗原集合的多肽序列。所述杂合多肽可以包含一个或多个来自第一抗原集合的多肽序列和一个或多个来自第二抗原集合的多肽序列。此外，所述杂合多肽可以包含2个或更多个来自上面列出的每种抗原的多肽序列，或者相同抗原的2种或更多种变体(在所述序列在菌株之间具有部分变异性的情况下)。
[0042]由得自2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种抗原的氨基酸序列组成的杂合体是有用的。具体地，由得自2种、3种、4种或5种抗原(诸如2种或3种抗原)的氨基酸序列组成的杂合体是优选的。
[0043]不同的杂合多 肽可以一起混合进单一制剂中。所述杂合多肽还可以与如上所述的缀合物或非金黄色葡萄球菌抗原组合。
[0044]杂合多肽可以由式NH2-A-{-X-L-}n-B-C00H表示，其中:X是如上所述的金黄色葡萄球菌抗原的氨基酸序列；L是任选的接头氨基酸序列；A是任选的N-端氨基酸序列；B是任选的C-端氨基酸序列；n是2或更大的整数(例如2、3、4、5、6等)。η经常是2或3。
[0045]如果-X-部分具有野生型形式的前导肽序列，那么其可在杂合蛋白中包含或者缺失。在某些实施方案中，除了位于杂合蛋白N-端处的-X-部分的前导肽以外，前导肽可缺失，即保留X1的前导肽，但缺失X2...Xn的前导肽。这相当于删除所有前导肽并使用X1的前导肽作为部分-A-。
[0046]就{-X-L-}的各η示例而言，接头氨基酸序列-L-可存在或不存在。例如，当 η = 2 时，杂合体可以是 NH2-X1-L1-X2-L2-COOH' NH2-X1-X2-COOH、NH2-X1-L1-X2-COOH,NH2-X1-X2-L2-COOH等。接头氨基酸序列-L-通常较短(例如20个或更少的氨基酸，即20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、I个)。例子包含促进克隆的短肽序列、聚甘氨酸接头(即包含Glyn,其中η = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)和组氨酸标签(即Hisn，其中η = 3、4、5、6、7、8、
9、10或更多)。本领域技术人员会明白其它合适的接头氨基酸序列。一种有用的接头是GSGGGG (SEQ ID NO:171)或 GSGSGGGG (SEQ ID NO:172)，其中 Gly-Ser 二肽从 BamHI 限制位点形成(或它们中的两个，以形成SEQ ID NO:230四肽)，因而有助于克隆和操作，且(Gly)4四肽(SEQ ID NO:227)是典型的聚-甘氨酸接头。其它合适的接头(具体地用作最终的Ln)是 ASGGGS (SEQ ID NO: 173，例如由 SEQ ID NO:174 编码)或 Leu-Glu 二肽。
[0047]-A-是任选的N-端氨基酸序列。其通常较短(例如40个或更少的氨基酸，即40个、39个、38个、37个、36个、35个、34个、33个、32个、31个、30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、I个)。例子包括指导蛋白运输
的前导序列、或促进克隆或纯化的短肽序列(例如组氨酸标签，即Hisn，其中η = 3、4、5、6、
7、8、9、10或更多)。本领域技术人员会明白其它合适的N-端氨基酸序列。如果X1缺少其自身的N-端甲硫氨酸，-A-优选是提供N-端甲硫氨酸的寡肽(例如，具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)，例如Met-Ala-Ser或单个Met残基。
[0048]-B-是任选的C-端氨基酸序列。其通常较短(例如40个或更少的氨基酸，即39个、38个、37个、36个、35个、34个、33个、 32个、31个、30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、I个)。例子包括指导蛋白质运输的序
列、促进克隆或纯化的短肽序列(例如包含组氨酸标签，即Hisn，其中η = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多，诸如SEQ IDNO:226)、或增强蛋白质稳定性的序列。本领域技术人员会明白其它合适的C-端氨基酸序列。
[0049]本发明的一种杂合多肽可以包括EsxA和EsxB抗原。这些在N-端至C-端可以是任意次序。SEQ ID NO:151( ‘EsxAB’ ；由 SEQ ID NO:169 编码)和 152 ( ‘EsxBA’ )是这样的杂合体的例子，二者具有六肽接头ASGGGS (SEQ ID NO:173)。另一种‘EsxAB’杂合体包含SEQ ID NO:241，可以给其提供N-端甲硫氨酸(例如SEQ ID NO:250)。
[0050]本发明的另一种杂合多肽可以包括Hla和Sta006抗原。这些在N-端至C-端可以是任意次序。SEQ ID NO:222(‘HlaH35L-Sta006’)是这样的杂合体的一个例子，其中Hla的H35L突变体经由六肽接头ASGGGS (SEQ ID NO:173)连接至Sta006。
[0051 ] 本发明的另一种杂合多肽可以包括Hla和EsxA和EsxB抗原。这些在N-端至C-端可以是任意次序。SEQ ID NO:220( ‘HlaH35L_EsxAB’)是这样的三元杂合体的一个例子，其中Hla的H35L突变体经由接头ASGGGS (SEQ IDNO:173)连接至EsxAB。所述EsxAB已经包括相同的接头，所以SEQ ID NO:220包括这些接头中的2个。包括Hla和EsxA和EsxB抗原的杂合多肽的另一个例子是SEQ ID NO:237(在实施例中使用的‘HlaH35L-EsxAB’)，其中Hla的H35L突变体经由接头APTARG(SEQ ID NO:239)连接至EsxA以替代它的N-端，然后经由接头ASGGGS (SEQ ID NO:173)连接至EsxB以替代它的N-端。可以给该杂合体提供合适的N-端序列诸如SEQ ID NO:240。
[0052]本发明的另一种杂合多肽可以包括Sta006和EsxA和EsxB抗原。这些在N-端至C-端可以是任意次序。SEQ ID NO:223(‘Sta006-EsxAB’)是这样的三元杂合体的一个例子，其中Sta006经由接头ASGGGS (SEQ ID NO:173)连接至EsxAB。所述EsxAB已经包括相同的接头，所以SEQ ID NO:223包括这些接头中的2个。包括Sta006和EsxA和EsxB抗原的杂合多肽的另一个例子是SEQ ID NO:238(在实施例中使用的‘Sta006_EsxAB’)，其中Sta006经由接头APTARG(SEQ IDNO:239)连接至EsxA以替代它的N-端，然后经由接头ASGGGS(SEQIDNO:173)连接至EsxB以替代它的N-端。可以给该杂合体提供合适的N-端序列诸如SEQID NO:240o
[0053]有用地，这些杂合多肽可以引起抗体(例如当施用给人时)，所述抗体识别在杂合体中代表的每种野生型葡萄球菌蛋白(例如在序列表中所示)，例如其识别野生型EsxA和野生型EsxB，或者其识别野生型Hla和野生型Sta006，或者其识别野生型Hla和野生型EsxA和野生型EsxB,或者其识别野生型Sta006和野生型EsxA和野生型EsxB。
[0054]与本发明一起使用的多肽
[0055]与本发明一起使用的多肽可以呈不同的形式(例如天然形式、融合体形式、糖基化形式、未糖基化形式、脂质化形式、非脂质化形式、磷酸化形式、非磷酸化形式、肉豆蘧酰基化的、非肉豆蘧酰基化的、单体形式、多聚体形式、微粒形式、变性形式等)。
[0056]与本发明一起使用的多肽可以通过多种方式(例如重组表达、从细胞培养物纯化、化学合成等)来制备。重组表达的蛋白是优选的，特别对于杂合多肽而言。
[0057]与本发明一起使用的多肽优选地以纯化的或基本上纯化的形式提供，即基本上不含有其它多肽(例如不含有天然存在的多肽)，具体地不含有其它葡萄球菌或宿主细胞多肽，且通常是至少约50%纯的(按重量计)，且经常是至少约90%纯的，即小于约50%、更优选地小于约10% (例如5%)的组合物由其它表达的多肽构成。因而，所述组合物中的抗原与表达所述分子的完整生物体分离。
[0058]与本发明一起使用的多肽优选地是葡萄球菌多肽。
[0059]术语“多肽”表示任意长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链的或支链的，它可以包含经修饰的氨基酸，且它可以被非氨基酸中断。该术语也包括已经天然地或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任意其它操作或修饰，诸如用标记组分组合。也包括，例如，含有氨基酸的一种或更多种类似物(包括、例如，非天然氨基酸等)、以及本领域已知的其它修饰的多肽。多肽可以作为单链或有关的链存在。
[0060]本发明提供了包含序列-P-Q-或-Q-P-的多肽，其中:-P-是如上定义的氨基酸序列，且-Q-不是如上定义的序列，即本发明提供了融合蛋白。在-P-的N-端密码子不是ATG、但是该密码子不存在于多肽的N-端的情况下，它将被翻译为该密码子的标准氨基酸，而不是翻译为Met。但是，在该密码子是在多肽的N-端的情况下，它将被翻译为Met。-Q-部分的例子包括、但不限于:组氨酸标签(即Hisn，其中η = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多)、麦芽糖-结合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。
[0061]尽管本发明的多肽的表达可以发生在葡萄球菌中，本发明经常使用异源宿主进行表达(重组表达)。所述异源宿主可以是原核的(例如细菌)或真核的。它可以是大肠杆菌(E.coli)，但是其它合适的宿主包括:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、乳糖奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟球菌(Neisseriacinerea)、分枝杆菌属(Mycobacteria)(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis))、酵母等。与编码本发明多肽的野生型金黄色葡萄球菌基因相比，有益的是，改变密码子以优化这样的宿主中的表达效率，而不影响编码的氨基酸。
[0062]菌株和变体
[0063]本文描述的抗原的示例性氨基酸和核苷酸序列可以使用它们的GI编号在得自NCTC 8325和/或Newman金黄色葡萄球菌菌株的公开序列数据库中容易地找到，例如，但是本发明不限于得自NCTC 8325和Newman菌株的序列。几种其它的金黄色葡萄球菌菌株的基因组序列是可得到的，包括 MRSA 菌株 N315 和 Mu50[10]、MW2、N315、C0L、MRSA252、MSSA476、RF122、USA300(非常有毒力的)、JH1和JH9的那些。可以使用标准的检索和比对技术在这些(或其它)另外基因组序列中的任一个中鉴别得自Newman或NCTC 8325菌株的任何特定序列的同系物。此外，可以使用可得自Newman和NCTC 8325菌株的序列来设计引物用于扩增得自其它菌株的同源序列。因此，本发明不限于这2种菌株，而是包括得自其它金黄色葡萄球菌菌株的这样的变体和同系物以及非天然的变体。一般而言，特定SEQ ID NO的合适变体包括它的等位基因变体、它的多晶型形式、它的同系物、它的直系同源物、它的旁系同源物、它的突变体等。
[0064]因而，例如，与本文中的SEQ ID NO相比，与本发明一起使用的多肽可以包括一个或更多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)氨基酸置换，诸如保守置换(即用另一个具有有关侧链的氨基酸置换一个氨基酸)。遗传编码的氨基酸通常分成4个家族:(I)酸性的，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性的，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性的，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同地归类为芳族氨基酸。一般而言，在这些家族内的单个氨基酸的置换对生物活性不具有重大影响。相对于SEQ ID NO序列，所述多肽还可以包括一个或更多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)单个氨基酸缺失。相对于SEQ ID NO序列，所述多肽还可以包括一个或更多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)插入(例如1、2、3、4或5个氨基酸中的每一种)。
[0065]类似地，与本发明一起使用的多肽可以包含这样的氨基酸序列，其:
[0066]与在序列表中公开的序列相同(即100%同一性)；
[0067]与在序列表中公开的序列具有序列同一性(例如80%、85%、90%、91%、92%、93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99.5%或更多)；
[0068]与(a)或(b)的序列相比，具有I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个
或10个(或更多个)单个氨基酸改变(缺失、插入、置换)，所述改变可以是在分开的位置，或者可以是连续的；和
[0069]当用逐对比对算法与得自序列表的特定序列比对时，从N-端向C-端的X个氨基酸的每个移动窗口(使得对于延伸到P个氨基酸的比对(其中P > X)，存在P-X+1个这样的窗口 )具有至少X.y个相同的比对氨基酸，其中:Χ选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200 ;y 选自 0.50,0.60,0.70,0.75,0.80,0.85,0.90,0.91,0.92,0.93、0.94,0.95,0.96,0.97,0.98,0.99 ;并且如果x.y不是整数，则四舍五入至最接近的整数。优选的逐对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[11],其中使用默认参数(如缺口开放罚分=10.0，缺口延伸罚分=0.5，使用EBL0SUM62评分矩阵)。用EMBOSS包中的needle工具会方便地实施这种算法[12]。
[0070]在使用杂合多肽的情况下，所述杂合体内的各个抗原(即各个-X-部分)可以来自一种或多种菌株。例如，在η = 2的情况下，X2可以来自与X1相同的菌株，或来自不同菌株。在η = 3的情况下,所述菌株可以是(DX1 = X2 = X3(Ii)Xi = X2 ^ X3(Iii)X1 ^ X2 =X3 (iv) X1 古 X2 古 X3 或(V)X1 = X3 古 X2 等。
[0071]在组(C)内，缺失或置换可以是在N-端和/或C-端，或者可以在两个末端之间。因此，截短是缺失的一个例子。截短可以包括在N-端和/或C-端处缺失多达40个(或更多个)氨基酸。N-端截短可以除去前导肽例如以促进在异源宿主中的重组表达。C-端截短可以除去锚序列例如以促进在异源宿主中的重组表达。
[0072]—般而言，当抗原包含与得自序列表的完整金黄色葡萄球菌序列不同的序列时(例如当它包含与其具有< 100%序列同一性的序列表时，或者当它包含其片段时)，在每种单独情况下优选的是，所述抗原可以引起识别各种完整金黄色葡萄球菌序列的抗体。
[0073]与糖的组合
[0074]本发明的免疫原性组合物还可以包含糖抗原(例如已知的糖抗原包括金黄色葡萄球菌的表多糖(其为一种聚-N-乙酰基葡糖胺(PNAG))和金黄色葡萄球菌的荚膜糖(其可以例如来自类型5、类型8或类型336))。在某些实施方案中，组合物不包括金黄色葡萄球菌糖抗原。
[0075]与非葡萄球菌抗原的组合
[0076]本发明的免疫原性组合物还可以包含非葡萄球菌抗原，尤其是得自与医院感染有关的细菌的抗原。例如，所述免疫原性组合物还可以包含一种或多种选自以下的抗原:难辨梭菌(Clostridiumdifficile);铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa);白假丝酵母(Candida albicans);和肠外致病性大肠杆菌。用于与本发明的葡萄球菌抗原组合的其它合适抗原列出在参考文献13的第33-46页上。
[0077]优选组合物
[0078]本发明的一种优选组合物包括以下所有4种:(i)单一多肽，其包括EsxA抗原和 EsxB 抗原，例如包 含 SEQ ID NO:250 ；(ii)Sta006 抗原，例如包含 SEQ ID NO:248 ；(iii)StaOll抗原，例如包含SEQ IDNO:249 ;和(iv)Hla的H35L突变体形式，例如包含SEQ IDNO:232。当使用式(K)的TLR7激动剂时，该组合物是特别有用的。
[0079]尽管SEQ IDNO:250、248、249和232是组合中的有用氨基酸序列，本发明不限于这些精确序列。因此,这些序列中的I个、2个、3个或所有4个可以独立地被至多5个单独氨基酸变化(即I个、2个、3个、4个或5个单独氨基酸置换、缺失和/或插入)修饰，前提条件是，经修饰的序列可以引起仍然结合由未修饰的序列组成的多肽的抗体。
[0080]本发明的一种有用的组合物包括以下的所有4种:(i)第一多肽，其具有氨基酸序列SEQ IDNO:250 ；(ii)第二多肽，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:248 ； (iii)第三多肽，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:249 ;和(iv)第四多肽，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:232。在某些实施方案中，所述组合物可以包括一种或多种其它多肽；在其它实施方案中，所述组合物中的仅有多肽是这4种指定的多肽。SEQ ID NO: 250、248、249和232是组合中的有用氨基酸序列，但是本发明不限于这些精确的序列。因此，这4个序列中的I个、2个、3个或所有4个可以独立地被I个、2个、3个、4个或5个单独氨基酸变化(即I个、2个、3个、4个或5个单独氨基酸置换、缺失和/或插入)修饰，前提条件是，经修饰的序列可以引起仍然结合由未修饰的序列组成的多肽的抗体。在一个优选的实施方案中，所述组合物因此包括这4种指定的多肽，其中SEQ ID NO:250、248、249和232中的I个、2个、3个或所有4个独立地被I个单独氨基酸置换、缺失和/或插入修饰。
[0081]所述4种多肽可以以基本上相等的质量(即它们中的每一种的质量是在所有多肽的平均质量的±5%内)存在。因此，它们可以以a: b: c: d的质量比存在，其中a-d中的每一个是在0.95-1.05之间。[0082]稳定添加剂
[0083]在本发明的某些实施方案中，免疫原性组合物包括稳定添加剂。这样的添加剂包括、但不限于:二价金属阳离子(例如EDTA、乙二胺四乙酸)、糖(例如二糖诸如蔗糖或海藻糖)、糖醇(例如甘露醇)、游离氨基酸(例如精氨酸)、缓冲盐(例如磷酸盐、柠檬酸盐)、多元醇(例如甘油、甘露醇)或蛋白酶抑制剂的螯合剂。
[0084]EDTA是一种优选的添加剂。本发明的免疫原性组合物中的EDTA的终浓度可以是约l-50mM、约1-1OmM或约l_5mM，优选约2.5mM，更优选约5.0mM。
[0085]缓冲剂是另一种有用的添加剂，以便控制组合物的pH。在重构冻干的物质以后，这可以是特别重要的。本发明的组合物可以包括一种或多种缓冲剂。典型缓冲剂包括:磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸盐缓冲剂。磷酸盐缓冲剂是优选的。通常包括在5-20mM范围内的缓冲液。本发明的水性组合物优选地具有5-6.5 (例如5.8-6.2或5.9-6.1)的pH,或6的pH。
[0086]糖或糖醇(或其混合物例如甘露醇/蔗糖混合物)也是有用的，特别当使用冻干法时。合适的材料包括、但不限于:甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖等。蔗糖的使用是特别优选的。这样的材料可以以约1% (按重量/体积计)或约3%至约6% (按重量/体积计)或多达约10%或约12.5% (按重量/体积计)、优选约5% (按重量/体积计)的浓度存在。
[0087]冻干法 [0088]储存本发明的免疫原性组合物的一种方式是以冻干形式。可以在加入或不加入金属螯合剂(例如EDTA)的情况下使用该方法。发明人还已经证实，EDTA对疫苗的热特性没有显著影响，且不会引起任何不希望的塑化效应，从而意味着可以冻干含有EDTA的组合物以进一步增加储存稳定性。
[0089]因而，通常，本发明还提供了一种冻干物，其包含二价金属阳离子螯合剂(例如EDTA)和至少一种抗原(例如至少一种多肽抗原)。
[0090]本发明还提供了本发明的水性免疫原性组合物的冻干物。这通过冻干本发明的水性组合物来制备。然后可以用水性材料重构它以提供本发明的水性免疫原性组合物。存在于冻干的材料内的材料将保留在冻干物中，且因而也在重构以后存在，例如缓冲盐、冷冻保护剂(例如蔗糖和/或甘露醇)、螯合剂等。如果与在冻干法之前相比用更小体积的材料来重构所述材料，那么这些材料将以更浓缩的形式存在。重构的冻干物优选地含有冷冻保护剂(例如蔗糖和/或甘露醇)，其浓度为多达约2.5% (按重量/体积计)，优选约1%至约2% (按重量/体积计)。在冷冻干燥之后和重构之前存在于组合物中的EDTA的量理想地是至少0.75mM,且优选至少2.5mM。预见到50mM的最大值。
[0091]可用于重构冻干物的液体材料包括、但不限于:盐溶液，诸如生理盐水；缓冲液，诸如PBS ;水，诸如注射用水。它们有用地具有4.5-7.5(例如6.8-7.2)的pH。重构的冻干物优选地具有5-6.5 (例如5.8-6.2或5.9-6.1)的pH，或6的pH。用于重构的液体材料可以包括佐剂例如铝盐佐剂。佐剂的水性悬浮液(任选地包括缓冲剂，诸如组氨酸缓冲剂)可用于同时重构和吸附冻干的多肽。在其它实施方案中，所述液体材料是不含佐剂的。通常，所述冻干物不包括不溶性的金属盐佐剂。
[0092]本发明还提供了包含EDTA和至少一种抗原的冻干物。[0093]免疫原性组合物和药物
[0094]本发明的免疫原性组合物可以用作疫苗。根据本发明的疫苗可以是预防性的(即用于预防感染)或治疗性的(即用于治疗感染)，但是通常是预防性的。
[0095]组合物因而可以是药学上可接受的。它们经常包括除了抗原以外的组分，例如它们通常包括一种或更多种药用载体和/或赋形剂。这样的组分的彻底讨论可在参考文献39中得到。
[0096]通常将组合物以水性形式施用给哺乳动物。但是，在施用之前，所述组合物可以已经处于非水性形式。例如，尽管一些免疫原性组合物以水性形式制备，然后也以水性形式填充和分布和施用，将其它免疫原性组合物在制备过程中冻干并在使用时重构成水性形式。因此，可以干燥本发明的组合物，诸如冻干的制剂。
[0097]在本发明的组合物包括超过一种多肽的情况下，每种不同多肽的质量可以相同或不同。理想地，它们以基本上相等的质量(即它们中的每一种的质量是在所有多肽的平均质量的±5%内)存在。在2种抗原作为杂合多肽存在的实施方案中，所述杂合体被作为用于该目的的单一多肽。可以影响在多价制剂内包含的多肽的量的因素包括:足以引起免疫应答的多肽的量，和会造成聚集(与它自身或与其它多肽)或影响其它多肽的稳定性的量。在免疫原性组合物 中的多肽的典型质量是1-100 μ g。
[0098]所述组合物可以包含防腐剂诸如硫柳汞或2-苯氧乙醇。但是，优选的是，所述免疫原性组合物应当基本上不含有(即小于5 μ g/ml)汞材料，例如不含硫柳汞。不含汞的组合物是更优选的。不含防腐剂的组合物是特别优选的。
[0099]为了改善热稳定性，组合物可以包含温度保护剂。下面提供了这样的试剂的其它细节。为了控制张度，优选的是，包含生理盐如钠盐。氯化钠(NaCl)是优选的，其可以以
l-20mg/ml存在，例如约10±2mg/ml NaCl。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱
水磷酸二钠、氯化镁、氯化钙等。
[0100]组合物通常具有200m0sm/kg至400m0sm/kg的渗透压,优选240-360m0sm/kg,且更优选地落入290-310m0sm/kg的范围内。
[0101]组合物可以包含一种或多种缓冲剂。典型缓冲剂包括:磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是含有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。通常包括在5-20mM范围内的缓冲剂。所述缓冲剂优选是IOmM磷酸钾。
[0102]所述组合物的pH优选地是约5至约6.5,更优选约5.5至约6,最优选约6。
[0103]所述组合物优选地为无菌的。所述组合物优选地为无热原的，例如每剂量含有
<IEU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量< 0.1EU0所述组合物优选地不含谷蛋白。
[0104]所述组合物可以包含用于单次免疫的物质，或者可以包含用于多次免疫的物质(即‘多剂量’试剂盒)。多剂量配置优选地包含防腐剂。作为在多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或补充方案)，可以将所述组合物包含容器中，所述容器具有用于取出物质的无菌接头。
[0105]通常以约0.5ml的剂量体积施用人疫苗，但是可以将一半剂量(即约0.25ml)施
用给儿童。
[0106]本发明的免疫原性组合物还可以包含一种或多种免疫调节剂。优选地，一种或多种免疫调节剂包括一种或多种佐剂。所述佐剂可以包括在下面进一步讨论的THl佐剂和/或TH2佐剂。因此，所述免疫原性组合物还可以包含佐剂，诸如铝盐佐剂(例如，一种或多种抗原可以吸附在铝盐上)。更一般而言，在本发明的组合物中可以使用的佐剂包括、但不限于在参考文献4中已经列出的那些。这些包括含有矿物的佐剂和水包油乳剂。
[0107]含有矿物的佐剂
[0108]含有矿物的佐剂包括矿物盐诸如铝盐和钙盐(或其混合物)。优选地，所述组合物含有铝盐佐剂。铝盐包括氢氧化物、磷酸盐等，所述盐呈任意适合的形式(例如凝胶、晶体、无定形物等)。钙盐包括磷酸钙(例如在参考文献14中公开的“CAP”颗粒)。吸附至这些盐是优选的(例如可以吸附所有抗原)。还可以将含有矿物的组合物配制为金属盐的颗粒
[15]。
[0109]可以使用被称作氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规的，但是仅仅为了方便而使用，任一个都不是存在的实际化学化合物的精确描述(例如参见参考文献16的第9章)。本发明可以使用通常被用作佐剂的“氢氧化物”或“磷酸盐”佐剂中的任一种。被称作“氢氧化铝”的佐剂通常是羟基氧化铝盐，其经常至少部分地结晶。被称作“磷酸铝”的佐剂通常是羟基磷酸铝，其经常也含有少量硫酸盐(即羟基磷酸铝硫酸盐)。它们可以通过沉淀得到，且在沉淀过程中的反应条件和浓度会影响磷酸盐对盐中的羟基的置换的程度。
[0110]纤维形态(例如如在透射电子显微照片中所见)是氢氧化铝佐剂所常见的。氢氧化铝佐剂的Pl通常约11，即佐剂本身在生理pH时具有表面正电荷。已经报道，在PH7.4时，氢氧化招佐剂的吸附能力在1.8-2.6mg蛋白/mgAl+++之间。
[0111]磷酸铝佐剂通常具有在0.3-1.2之间、优选在0.8-1.2之间、更优选0.95+0.1的P04/A1摩尔比。磷酸铝通常是无定形的，特别是对于羟基磷酸盐而言。典型的佐剂是具有在0.84-0.92之间的P04/A1摩尔比、含0.6mg Al3Vml的无定形羟基磷酸铝。磷酸铝通常是微粒(例如，在透射电子显微照片中所见的平板样形态)。所述颗粒在吸附任何抗原后的典型直径是在0.1-10 μ m(例如约0.1-5 μ m)范围内。已经报道，在pH7.4时，磷酸铝佐剂的吸附能力在0.7-1.5mg蛋白/mg Al+++之间。
[0112]磷酸铝的零电荷点(PZC)与磷酸根对羟基的置换程度成反比，并且该置换程度可以随通过沉淀来制备该盐所用的反应条件和反应物浓度而变化。通过改变溶液中的游离磷酸根离子的浓度(磷酸根越多=PZC酸性越高)，或通过添加诸如组氨酸缓冲液等缓冲液(使得PZC更具碱性)，也会改变PZC。根据本发明使用的磷酸铝通常具有在4.0-7.0之间、更优选在5-6.5之间、例如约5.7的PZC0
[0113]用于制备本发明组合物的铝盐混悬液可以但不一定含有缓冲剂(例如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲剂)。所述混悬液优选地是无菌的和无热原的。混悬液可以包括游离的水性磷酸根离子，例如浓度在1.0-20mM之间、优选在5-15mM之间、更优选约10mM。所述混悬液也可以包含氯化钠。
[0114]优选的铝盐佐剂是氢氧化铝佐剂。
[0115]本发明可以使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在该情况下，可以存在比氢氧化铝更多的磷酸铝，例如至少2: I (例如≥5: 1、≥6: 1、≥7: 1、≥8: 1、≥9: I等)
的重量比。
[0116]用于施用给患者的组合物中的Al+++的浓度优选地小于10mg/ml,例如≥5mg/ml、
<4mg/ml、< 3mg/ml、< 2mg/ml、< lmg/ml 等。一种优选的范围是 0.3-lmg/ml。0.85mg/剂的最大值是优选的。
[0117]矿物盐可以有用地具有吸附在它上面的TLR激动剂，诸如TLR7激动剂，(例如参见参考文献17)。
[0118]油和水乳剂
[0119]适合用作本发明中的佐剂的油乳剂组合物包括水包油乳剂诸如MF59(参考文献16的第10章；也参见参考文献18)和AS03。还可以使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。
[0120]不同的水包油乳剂佐剂是已知的，它们通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是可生物降解的(可代谢的)和生物相容的。乳剂中的油微滴通常具有小于5 μ m的直径，并理想地具有亚微米直径，这些小尺寸用微流态化仪实现，以提供稳定的乳剂。具有小于220nm的尺寸的微滴是优选的，因为可以对它们进行过滤灭菌。
[0121]所述乳剂可以包含油诸如得自动物(例如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种子和谷物。最常购得的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的例子。可以使用希蒙得木油，其例如得自霍霍巴豆。种子油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，玉米油是最易购得的，但是也可使用其它谷物如小麦、燕麦、黑麦、大米、画眉草(teff)、黑小麦等的油。通过水解、分离和酯化合适的从坚果和种子油起始的物质，可以制备在种子油中天然不存在的甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯。哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可用于实施本发明。从动物来源获得纯油所需的分离、纯化、皂化和其它方法的规程是本领域众所周知的。大多数鱼含有可容易地回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝 油和鲸油(诸如鲸蜡)是在本文中可以使用的几种鱼油的例子。可以用5-碳异戊二烯单元通过生物化学方法合成许多支链油，所述支链油通常被称作萜类化合物。鲨鱼肝油含有被称作角鲨烯的支链不饱和萜类化合物2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四己烯，其在本文中是特别优选的。角鲨烷是角鲨烯的饱和类似物，其也是优选的油。包含角鲨烯和角鲨烷的鱼油可以从商业来源容易购得，或可以通过本领域已知的方法获得。其它优选的油是生育酚(见下文)。可以使用油的混合物。
[0122]可以根据表面活性剂的“HLB”(亲水/亲油平衡)将其分类。本发明的优选表面活性剂具有至少10、优选至少15和更优选至少16的HLB。本发明可用的表面活性剂包括、但不限于:聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常被称作吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ;环氧乙烷(E0)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，在D0WFAX?商业名称下销售，诸如直链Ε0/Ρ0嵌段共聚物；辛苯昔醇，其在重复的乙氧基(氧基-1，2-乙烷二基)基团的数目方面可以变化，其中特别感兴趣的是辛苯昔醇-9 (Triton X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂诸如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬基苯酚乙氧基化物，诸如Tergit0lTMNp系列；从月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇衍生出的聚氧乙烯脂肪醚(被称作Brij表面活性剂)，诸如三甘醇单月桂基醚(Brij30);和脱水山梨糖醇酯(通常被称作SPAN)，诸如脱水山梨糖醇三油酸酯(Span85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。非离子型表面活性剂是优选的。用于包含在乳剂中的优选表面活性剂是吐温80 (聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、Span85 (脱水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和Triton X-100。
[0123]可以使用表面活性剂的混合物，例如吐温80/Span85混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯≤吐温80)和辛苯昔醇诸如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇≤TritonX-1OO)的组合也是合适的。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚9+聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛苯昔醇。
[0124]表面活性剂的优选量≤重量％ )是:0.01-1 %、尤其是约0.1 %的聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯≤诸如吐温80) ;0.001-0.1 %、尤其是0.005-0.02%的辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇≤诸如Triton X-100或Triton系列中的其它去污剂)；0.1-20%、优选0.1-10%,且尤其是0.1-1%或约0.5%的聚氧乙烯醚≤诸如月桂醇聚醚9)。
[0125]优选的乳剂佐剂具有≤I μ m ≤例如≤750nm、≤ 500nm、≤ 400nm、≤ 300nm、≤250nm、≤220nm、≤200nm或更小)的平均微滴尺寸。这些微滴尺寸可以方便地通过诸如微流态化等技术来实现。
[0126]可与本发明一起使用的具体水包油乳剂佐剂包括、但不限于:
[0127]?角鲨烯、聚山梨酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯的亚微米乳剂。这3种组分可以以10:1:1的体积比或39: 47: 47的重量比存在。所述乳剂的组成≤按体积计)可以是约5%角鲨烯、约0.5%聚山梨酯80和约0.5%脱水山梨糖醇三油酸酯。以重量方式，这些比例变成4.3%角鲨烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%脱水山梨糖醇三油酸酯。该佐剂被称作‘MF59’ [19- 21]，如在参考文献22的第10章和参考文献23的第12章中更详细地描述的。MF59乳剂有利地包括柠檬酸根尚子例如IOmM柠檬酸钠缓冲液。
[0128]?角鲨烯、生育酚和聚山梨酯80的乳剂。所述乳剂可以包括磷酸盐缓冲盐水。它还可以包括Span85≤例如1% )和/或卵磷脂。这些乳剂可以具有2-10%角鲨烯、2-10%生育酚和0.3-3%聚山梨酯80，且角鲨烯:生育酚的重量比优选地< 1，因为这会提供更稳定的乳剂。角鲨烯和聚山梨酯80可以以约5: 2的体积比或约11: 5的重量比存在。因此，3种组分≤角鲨烯、生育酚、聚山梨酯80)可以以1068: 1186: 485或约55: 61: 25的重量比存在。一种这样的乳剂≤‘AS03’)可以如下制备:将吐温80溶解在PBS中以得到2%溶液，然后将90ml该溶液与5g DL- α -生育酚和5ml角鲨烯的混合物混合，然后将该混合物微流态化。得到的乳剂可以具有亚微米油微滴，例如具有100-250nm、优选约180nm的平均直径。所述乳剂还可以包括3-脱-O-酰化的单磷酰脂质A ≤3d-MPL)。该类型的另一种有用的乳剂可以包含:每人剂量，0.5-10mg角鲨烯、0.5-llmg生育酚和0.l_4mg聚山梨酯80 [24]，例如以上面讨论的比例。
[0129]?角鲨烯、生育酚和Triton去污剂≤例如Triton X-100)的乳剂。乳剂还可以包括3d-MPL≤见下文)。该乳剂可以含有磷酸缓冲液。
[0130]?包含聚山梨酯≤例如聚山梨酯80)、Triton去污剂≤例如Triton X-100)和生育酚≤例如α-生育酚琥珀酸酯)的乳剂。所述乳剂可以包括质量比为约75: 11: 10≤例如750 μ g/ml聚山梨酯80、110 μ g/ml Triton X-100和100 μ g/ml α -生育酹琥拍酸酯)的这3种组分，且这些浓度应当包括得自抗原的这些组分的任意组合。所述乳剂还可以包括角鲨烯。所述乳剂还可以包括3d-MPL≤见下文)。水相可以含有磷酸盐缓冲液。
[0131]?角鲨烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401的乳剂≤“普流尼克?L121”)。所述乳剂可以在磷酸盐缓冲盐水≤PH7.4)中配制。该乳剂是胞壁酰二肽的一种有用的递送媒介物，且已经与苏氨酰基-MDP —起用在“SAF-1”佐剂中[25] ≤0.05-1% Thr_MDP、5%角鲨烷、2.5%普流尼克L121和0.2%聚山梨酯80)。它还可以在没有Thr-MDP的情况下使用，如在“AF”佐剂中[26] (5%角鲨烷、1.25%普流尼克L121和0.2%聚山梨酯80)。微流态化是优选的。
[0132]?包含角鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水非离子型表面活性剂(例如聚氧乙烯(12)鲸蜡硬脂基醚)和疏水非离子型表面活性剂(例如脱水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，诸如脱水山梨糖醇单油酸酯或‘SpanSO”)的乳剂。所述乳剂优选地是热可逆的，和/或具有至少90% (按体积计)的小于200nm尺寸的油微滴[27]。所述乳剂还可以包括以下的一种或多种:多羟糖醇；冷冻保护剂(例如糖，诸如十二烷基麦芽糖苷和/或蔗糖)；和/或烷基多糖苷。所述乳剂可以包括TLR4激动剂[28]。可以冻干这样的乳剂。
[0133]?角鲨烯、泊洛沙姆105和Abil-Care的乳剂[29]。含佐剂疫苗中的这些组分的终浓度(重量)是:5%角鲨烯、4%泊洛沙姆105 (普流尼克多元醇)和2%Abil-Care85 (Bis-PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16 聚二甲基硅氧烷；辛酸 / 癸酸甘油三酯)。
[0134]?具有0.5-50%的油、0.1-10%的磷脂和0.05-5%的非离子型表面活性剂的乳齐?。如在参考文献30中所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。亚微米微滴尺寸是有利的。
[0135]?不可代谢油(诸如轻矿物油)和至少一种表面活性剂(诸如卵磷脂、吐温80或Span80)的亚微米水包油乳剂。可以包括添加剂，诸如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂性缀合物(诸如GP1-0100，描述于参考文献31中，通过将脂族胺经由葡糖醛酸的羧基添加至脱酰基皂苷上而产生)、二甲基双十八烷基溴化铵和/或N，N- 二十八烷基-N，N- 二(2-羟基乙基)丙烷二胺。 [0136]?其中使皂苷(例如QuilA或QS21)和甾醇(例如胆固醇)结合为螺旋胶束的乳剂[32]。
[0137]?包含矿物油、非离子的亲脂的乙氧基化的脂肪醇和非离子的亲水表面活性剂(例如乙氧基化的脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳剂[33]。
[0138]?包含矿物油、非离子的亲水的乙氧基化的脂肪醇和非离子的亲脂表面活性剂的乳剂(例如乙氧基化的脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)[33]。
[0139]在某些实施方案中，可以在递送时将乳剂与抗原即时混合，因此，佐剂和抗原通常分开存放在包装或分发的组合物中，准备好在使用时最终配制。在其它实施方案中，在制备过程中将乳剂与抗原混合，因而以含佐剂的液体形式包装组合物。抗原通常以水性形式存在，从而最后通过混合两种液体来制备组合物。用于混合的两种液体的体积比可以变化(例如，在5:1和1: 5之间)，但是通常是约1:1。在具体乳剂的上述描述给出组分浓度的情况下，这些浓度通常是关于未稀释的组合物，因而在与抗原溶液混合以后的浓度会降低。
[0140]在组合物包含生育酚的情况下，可以使用α、β、Υ、δ、ε或ξ生育酚中的任一种，但是α-生育酚是优选的。生育酚可以呈几种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，诸如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。可以使用D-α-生育酚和DL-α-生育酚。用于老年患者(例如，60岁或更大)的组合物有利地包括生育酚，因为已经报道，维生素E对该患者组的免疫应答具有正面影响[34]。它们还具有抗氧化性能，该性能可以帮助稳定乳剂[35]。一种优选的α-生育酚是DL-α-生育酚，该生育酚的优选盐是琥珀酸盐。
[0141]氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂的应用是特别优选的，且抗原通常吸附于这些盐。
[0142]本发明的组合物可以引起细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答。该免疫应答优选地诱导持久的(例如中和)抗体和在暴露于金黄色葡萄球菌以后可以快速地做出应答的细胞介导的免疫。
[0143]所述免疫应答可以是THl免疫应答和TH2免疫应答中的一种或两种。优选地，免疫应答提供增强的THl应答和增强的TH2应答中的一种或两种。
[0144]增强的免疫应答可以是全身免疫应答和粘膜免疫应答中的一种或两种。优选地，所述免疫应答提供增强的全身免疫应答和增强的粘膜免疫应答中的一种或两种。优选地，粘膜免疫应答为TH2免疫应答。优选地，粘膜免疫应答包括IgA生成的增加。
[0145]金黄色葡萄球菌感染可以影响身体的不同区域，所以可以将本发明的组合物制备成不同的形式。例如，可以将所述组合物制备为液体溶液或混悬液形式的注射剂。也可以制备适合在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式(例如冻干的组合物或喷雾冷冻干燥的组合物)。可以制备所述组合物用于局部给药，例如作为软膏剂、乳膏剂或粉末。可以制备所述组合物用于口服给药，例如作为片剂或胶囊剂、作为喷雾剂或作为糖浆剂(任选地经过调味)。可以制备所述组合物用于采用细粉或喷雾进行肺给药，例如作为吸入剂。可以将所述组合物制备为栓剂或子宫托。可以制备所述组合物用于鼻、耳或眼给药，例如作为滴剂。所述组合物可以呈试剂盒形式，设计成在即将施用给患者之前重构合并的组合物。这样的试剂盒可以包含一种或多种液体形式的抗原以及一种或多种冻干的抗原。
[0146]当在使用前即时制备组合物(例如，以冻干形式提供组分)并以试剂盒形式提供时，该试剂盒可以包含两个管形瓶，或者它可以包含一个已填充的注射器和一个瓶，所述注射器的内容物用于在注射前再次激活所述瓶的内容物。
[0147]用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫学上有效量的抗原以及需要的任意其它组分。“免疫学上有效 量”是指，在单次剂量中或作为一系列剂量的一部分施用给个体的对治疗或预防而言有效的量。该量随以下因素而变化:待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类群(例如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、疫苗的制剂、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素。预见到，所述量将落入通过常规试验可以确定的相对宽范围内。如果在组合物中包含超过一种抗原，那么两种抗原可以以彼此相同的剂量或以不同的剂量存在。
[0148]如上所述，组合物可以包含温度保护剂，且该组分可能在含佐剂的组合物(特别是含有矿物质佐剂诸如铝盐的那些)中是特别有用的。如在参考文献36中所述，可以将液体温度保护剂加入水性疫苗组合物中以降低其冰点，例如将冰点降低至0°C以下。因此，可以将组合物储存在0°C以下但在其冰点以上以便抑制热分解。温度保护剂还允许冷冻组合物，同时保护矿物盐佐剂免于在冷冻和融化后凝聚或沉降，并且还可以在高温(例如40°C以上)保护组合物。可以混合起始水性疫苗和液体温度保护剂，使得该液体温度保护剂形成最终混合物的1-80体积％。合适的温度保护剂应该是人施用安全的、易混溶的/可溶于水的，并且不应损害组合物的其它组分(例如抗原和佐剂)。例子包括甘油、丙二醇和/或聚乙二醇(PEG)。合适PEG可以具有200-20，OOODa的平均分子量。在一个优选的实施方案中，聚乙二醇可以具有约300Da( ‘PEG-300’)的平均分子量。
[0149]治疗方法和疫苗施用
[0150]本发明还提供了一种用于在哺乳动物中引起免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤:给哺乳动物施用本发明的组合物。所述免疫应答优选地是保护性的，且优选地涉及抗体和/或细胞介导的免疫。所述方法可以引起加强应答。
[0151]本发明还提供了 EsxA抗原、EsxB抗原和稳定添加剂在药物制备中的用途，所述药物用于在哺乳动物中引起免疫应答。所述用途也可能包含Sta006抗原、StaO 11抗原和/或Hla抗原。它还可能包含佐剂的应用。
[0152]本发明还提供了 EsxAB抗原和稳定添加剂在药物制备中的用途，所述药物用于在哺乳动物中引起免疫应答。所述用途也可能包含Sta006抗原、StaOll抗原和/或Hla抗原。它还可能包含佐剂的应用。
[0153]本发明还提供了 EDTA和抗原在冻干药物的制备中的用途，所述药物用于在重构后在哺乳动物中引起免疫应答。
[0154]通过用这些应用和方法在哺乳动物中引起免疫应答，可以保护哺乳动物免于金黄色葡萄球菌感染，包括医院感染。更具体地，可以保护哺乳动物免于皮肤感染、肺炎、脑膜炎、骨髓炎心内膜炎、中毒性休克综合征和/或败血病。
[0155]本发明还提供了包含第一组分和第二组分的试剂盒，其中第一组分和第二组分都不是如上所述的本发明组合物，但是其中可以组合所述第一组分和第二组分以提供如上所述的本发明组合物。所述试剂盒可以进一步包括含有以下一种或多种的第三组分:说明书、注射器或其它递送装置、佐剂或药学上可接受的配制溶液。
[0156]本发明还提供了一种预填充了本发明的免疫原性组合物的递送装置。所述哺乳动物优选地是人。在所述疫苗用于预防用途的情况下，人优选地是儿童(例如幼儿或婴儿)或青少年；在所述疫苗用于治疗用途的情况下，人优选地是青少年或成年人。还可以将意图用于儿童的疫苗施用给 成年人，例如以评估安全性、剂量、免疫原性等。根据本发明可以有用地免疫的其它哺乳动物是牛、狗、马和猪。
[0157]检查治疗性处理的效力的一种方式包括，在施用本发明的组合物以后，监测金黄色葡萄球菌感染。一种检查预防性处理的效力的方法包括，在施用本发明的组合物以后，监测针对所述组合物中抗原的全身免疫应答(诸如监测IgGl和IgG2a产生水平)和/或粘膜免疫应答(诸如监测IgA产生水平)。通常，在免疫接种之后但是在攻击之前确定抗原特异性的血清抗体应答，而在免疫接种之后和在攻击之后确定抗原特异性的粘膜抗体应答。
[0158]评估本发明组合物的免疫原性的另一种方法是重组地表达蛋白，用于通过免疫印迹和/或微阵列筛查患者血清或粘膜分泌物。蛋白质和患者样品之间的阳性反应指示，该患者已经对目标蛋白产生免疫应答。该方法也可以用于鉴定免疫显性的抗原和/或抗原中的表位。
[0159]通过用免疫原性组合物攻击金黄色葡萄球菌感染的动物模型(例如，豚鼠或小鼠)，也可以在体内确定免疫原性组合物的效力。具体地，存在3个用于研究金黄色葡萄球菌传染性疾病的有用动物模型，即:(i)鼠脓肿模型[37]、(ii)鼠致命性感染模型[37]和
(iii)鼠肺炎模型[38]。所述脓肿模型研究静脉内攻击以后小鼠肾中的脓肿。所述致命性感染模型研究在通过静脉内或腹膜内途径用通常致死剂量的金黄色葡萄球菌感染以后存活的小鼠的数目。所述肺炎模型也研究存活率，但是使用鼻内感染。一种有用的免疫原性组合物可以在这些模型中的一种或多种中是有效的。例如，对于一些临床情形，可能合乎需要的是，保护免于肺炎，而不需要预防血液传播或促进调理作用；在其它情形中，主要愿望可以是预防血液传播。不同的抗原和不同的抗原组合可以促进有效的免疫原性组合物的不同方面。
[0160]本发明的组合物通常直接施用给患者。通过胃肠外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或注射至组织的间质间隙)，或通过粘膜，诸如通过直肠、口服(例如片剂、喷雾剂)、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼、耳、肺或其它粘膜施用，可以实现直接递送。
[0161]本发明可以用于引起全身免疫和/或粘膜免疫，优选地用于引起增强的全身免疫和/或粘膜免疫。
[0162]优选地，增强的全身免疫和/或粘膜免疫表现为增强的THl和/或TH2免疫应答。优选地，所述增强的免疫应答包括IgGl和/或IgG2a和/或IgA的产生的增加。
[0163]可以通过单剂量方案或多剂量方案进行给药。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可以通过相同或不同的途径施用多个剂量，例如胃肠外激发和粘膜加强，粘膜激发和胃肠外加强等。通常间隔至少I周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)施用多剂量。
[0164]根据本发明制备的疫苗可以用于治疗儿童和成年人。因此，人患者可以是小于I岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受疫苗的优选患者是老年人(例如≥50岁，^ 60岁，优选≥65岁)、年轻人(如< 5岁)、住院患者、健康护理工作者、武装部队和军事人员、孕妇、慢性病患者或免疫缺陷患者。但是，所述疫苗不仅适用于这些群体，可以用于更广泛的群体。
[0165]可以将通过本发明生产的疫苗与其它疫苗基本上同时(例如在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或就诊期间)施用给患者，例如与流行性感冒疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、 风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、联合的B型流感嗜血杆菌疫苗、灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌的联合疫苗(诸如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞体病毒疫苗等基本上同时施用。适合用于共同施用的其它非葡萄球菌疫苗可以包括在参考文献13的第33-46页上列出的一种或多种抗原。
[0166]概述
[0167]除非另有说明，否则本发明的实践将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法，这些方法在本领域技术范围内。这样的技术在文献中进行了充分解释。参见，例如，参考文献39-、、、、、、46等。
[0168]上面使用了 “GI”编号法。GI编号或“Genlnfo标识符”是连贯地分配给由NCBI处理过的每个序列记录(当将序列添加到它的数据库中时)的一系列数字。GI编号与序列记录的登录号不具有相似性。当更新序列时(例如为了校正，或添加更多的注解或信息)，那么它接受新的GI编号。因此，与给定的GI编号有关的序列从不变化。
[0169]在本发明涉及“表位”的情况下，该表位可以是B-细胞表位和/或T-细胞表位。可以凭经验鉴定这样的表位(例如使用PEPSCAN[47、48]或类似的方法)，或可以进行预测(例如使用Jameson-Wolf抗原指数[49]、基于矩阵的方案[50]、ΜΑΡΙΤ0ΡΕ [51]、T表位[52、53]、神经网络[54]、OptiMer 和 EpiMer [55,56]、ADEPT[57]、T 位点[58]、亲水性[59]、抗原指数[60]或在参考文献61-、、、65等中公开的方法)。表位是抗原的被抗体或T细胞受体的抗原结合位点识别并结合的部分，也可以被称作“抗原决定簇”。
[0170]在抗原“结构域”缺失的情况下，这可能涉及信号肽、细胞质结构域、跨膜结构域、细胞外结构域等的缺失。
[0171]术语“包含”包括“包括”以及“由...组成”，例如，“包含”X的组合物可以排它地由X组成，或者可以包含其它物质，例如X+Y。
[0172]与数值X相关的术语“约”是任选的，且是指例如x+10%。
[0173]对两个氨基酸序列之间的序列同一性百分比的提及表示，当进行比对时，所比较的两个序列中相同的氨基酸的百分比。使用本领域已知的软件程序，例如在参考文献66的7.7.18部分中描述的那些，可以进行该比对并确定同源性或序列同一性百分Ito通过Smith-Waterman同源性检索算法确定优选比对,所述算法使用仿射缺口检索，其中缺口开放罚分为12，缺口延伸罚分为2，BLOSUM矩阵为62。在参考文献67中公开了Smith-Waterman同源性检索算法。
【专利附图】

【附图说明】
[0174]图1显示了在没有EDTA存在下在25°C温育至多72小时的(A)单价(EsxAB)、(B)三价(Sta006、StaOll 和 HlaH35L)和(C)四价(EsxAB、Sta006、StaOll 和 HlaH35L)冻干前制剂在pH6的毛细管电泳图谱。峰:EsxAB单体(15min)、StaOll单体(17min)、HlaH35L (18min)、EsxAB 二聚体(19min)、StaOll 二聚体(21min)、Sta006 二聚体(21.5min)。
[0175]图2显示了在0.75mM EDTA中的冻干前制剂的示差扫描量热法图谱(玻璃化转变温度(Tg)在-33.39°C )。 [0176]图3显示了在5mM EDTA中的冻干前制剂的示差扫描量热法图谱(玻璃化转变温度(Tg)在-32.86°C ) ο
[0177]图4显示了在2-8 °C温育至多72小时的、在0.75mM EDTA中的四价(EsxAB、Sta006、StaOll和HlaH35L)冻干前制剂的尺寸排阻色谱法图谱。峰:Sta006+Sta011+EsxAB (I lmin), HlaH35L (12.5min)、EDTA (14min)。
[0178]图5显示了在25 °C温育至多72小时的、在0.75mM EDTA中的四价(EsxAB、Sta006、StaOll和HlaH35L)冻干前制剂的尺寸排阻色谱法图谱。峰:Sta006+Sta011+EsxAB (I lmin), HlaH35L (12.5min)、EDTA (14min)。
[0179]图6显示了在2-8 °C温育至多72小时的、在5mM EDTA中的四价(EsxAB、Sta006、StaOll和HlaH35L)冻干前制剂的尺寸排阻色谱法图谱。峰:Sta006+Sta011+EsxAB (I lmin), HlaH35L (12.5min)、EDTA (14min)。
[0180]图7显示了在25 °C温育至多72小时的、在5mM EDTA中的四价(EsxAB、Sta006、StaOll和HlaH35L)冻干前制剂的尺寸排阻色谱法图谱。峰:Sta006+Sta011+EsxAB (I lmin), HlaH35L (12.5min)、EDTA (14min)。
[0181 ] 图8显不了在t = O (A)、24小时以后⑶、48小时以后(C)和72小时以后(D)，在2-8°C和25°C温育的、在5mM EDTA中的单价和四价冻干前制剂的天然蛋白凝胶。泳道 1:Sta006 ;泳道 2 =StaOll ;泳道 3:HlaH35 ;泳道 4 =EsxAB ;泳道 5:EsxAB、Sta006、StaOll 和 HlaH35L。分子量=EsxAB 单体(22.8kDa)、StaOll 单体(27kDa)、Sta006 单体(32kDa)、HlaH35L(33kDa)、EsxAB 二聚体(45.6kDa)、StaOll 二聚体(54kDa)、Sta006 二聚体(64kDa)、EsxAB 二聚体(91.2kDa)。MW 标志物。[0182]图9显示了在室温温育至多72小时的、在(A)pH7.2和(B)pH6的四价(EsxAB、Sta006、StaOll和HlaH35L)冻干前制剂的毛细管电泳图谱。峰:EsxAB单体(15min)、StaOll 单体(17min)、HlaH35L(18min)、EsxAB 二聚体(19min)、StaOll 二聚体(21min)、Sta006 二聚体(21.5min)。
[0183]图10显示了通过反相色谱法记录的、Sta006、Sta011和EsxAB对单体相对于二聚体的蛋白选择性随PH的变化。Sta006( ? )，StaOlK )，EsxAB ( ▲)。
[0184]图11显示了以下四价(EsxAB、Sta006、StaOll和HlaH35L)制剂的尺寸排阻色谱法图谱:(A)在室温温育24小时的、在pH6在5mM EDTA中的冻干前制剂和(B)在水溶液中重构的冻干制剂。
[0185]图12显示了在用重构的冻干的含佐剂的四价疫苗免疫接种以后，在小鼠中针对HlaH35L抗原的抗体滴度，所述疫苗已经在pH6.0或pH7.2制备成冻干前制剂。对照接受盐水+佐剂的相同疗程。
[0186]图13显示了在用重构的冻干的含佐剂的四价疫苗免疫接种以后，在小鼠中针对Sta006抗原的抗体滴度，所述疫苗已经在pH6.0或pH7.2制备成冻干前制剂。对照接受盐水+佐剂的相同疗程。
[0187]图14显示了在用重构的冻干的含佐剂的四价疫苗免疫接种以后，在小鼠中针对StaOll抗原的抗体滴度，所述疫苗已经在pH6.0或pH7.2制备成冻干前制剂。对照接受盐水+佐剂的相同疗程。
[0188]图15显示了在用重构的冻干的含佐剂的四价疫苗免疫接种以后，在小鼠中针对EsxAB抗原的抗体滴度，所述疫苗已经在pH6.0或pH7.2制备成冻干前制剂。对照接受盐水+佐剂的相同疗程。
[0189]图16显示了金黄色葡萄球菌攻击以后免疫的小鼠的存活率。
【具体实施方式】
[0190]材料和方法
[0191]用TA Instruments Q2000进行示差扫描量热法(DSC)分析。将10 μ L试验溶液加载进密封的TO铝盘中，在-80°c平衡，然后在不同的扫描速率(10-2(TC/分钟)加热至(TC。
[0192]通过注射100 μ L冻干前制剂,用Waters Alliance2695仪器进行尺寸排阻高压液相色谱法(SE-HPLC)分析。用柱Phenomenex Biosep SEC-S-3000在0.8mL/分钟等度条件(0.1M磷酸钠+0.1M氯化钠，pH7)下进行分离。在214nm记录图谱。
[0193]通过注射50 μ L冻干前制剂，用Waters Alliance2695仪器进行反相色谱法(RP)分析。用柱ACE3C4-300进行分离。流速:lmL/分钟，TFA/乙腈梯度。
[0194]用Beckman Coulter PA800仪器、SDS-MW应用程序进行毛细管电泳分析。通过将90 μ L冻干前制剂与10 μ LTRIS-SDS缓冲液混合，制备样品。
[0195]在由5个架子组成的Virtis Genesis EL25中执行冻干运行。将0.3mL溶液装入2cc I型玻璃瓶中，并盖上有机硅化的丁基橡胶(butylic)塞。
[0196]抗原纯度:EsxAB纯度=(单体+ 二聚体)/总蛋白。
[0197]抗原选择性:EsxAB选择性％ = %单体/% (单体+ 二聚体)。[0198]EsxAB 稳定性
[0199]为了研究EsxAB杂合多肽(SEQ ID NO:250)的单体和二聚体形式的稳定性，筛选了不同的稳定添加剂，包括5/10% w/V的蔗糖、50/150mM的精氨酸、20mM的EDTA、蛋白酶抑制剂混合物、10%的甘油和50mM的柠檬酸盐。在IOmM磷酸钾缓冲液(pH6.0)中分析所有这些。还在pH5.8和5.5试验缓冲液pH。试验的储存条件是室温(RT)、2_8°C和冷冻/融化循环。
[0200]在所有实验中，观察到部分二聚化和由此引起的纯度损失。
[0201]仅20mM EDTA稳定化单体形式，由此保持总纯度超过80%。表1显示了从在室温和在2-8°C进行的实验的RP-HPLC分析得到的数据，所述实验含有pH6.0的缓冲液和O或20mM EDTA。
[0202]表1:在室温和2_8°C关于纯化的EsxAB单体或二聚体的稳定性数据
[0203]
【权利要求】
1.包含EsxA抗原、EsxB抗原和稳定添加剂的免疫原性组合物，其中所述组合物的pH是在5-6.5之间。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物还包含Sta006抗原、StaOll抗原和/或Hla抗原。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述EsxA抗原和所述EsxB抗原连接以形成杂合多肽。
4.一种免疫原性组合物，其包含⑴包含EsxA抗原和EsxB抗原的融合蛋白和(ii)稳定添加剂。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述稳定添加剂是EDTA。
6.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含佐剂(例如氢氧化铝佐剂)和/或糖(例如蔗糖)。
7.冻干形式的根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物。
8.水性形式的根据权利要求1-6中的任一项所述的免疫原性组合物。
9.一种用于制备根据权利要求8所述的组合物的方法，所述方法通过用水性材料重构根据权利要求7所述的组合物进行。
10.一种冻干物，其包含EDTA和一种或多种多肽。
11.同源二聚体形式的Sta006多肽。
12.异源二聚体形式的Sta006和StaOll多肽。
13.同源二聚体形式的EsxAB杂合多肽。
14.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求11-13中的任一项所述的二聚体。
15.一种用于在哺乳动物中引起免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤:给所述哺乳动物施用有效量的根据任意前述权利要求所述的多肽或组合物。
【文档编号】A61K39/085GK104023744SQ201280063615
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2011年12月23日
【发明者】M·肯托尼, L·塔里, A·考斯洛维, M·索特朱 申请人:诺华股份有限公司