一种检测和评价分子和药物生物学功能的方法及其用途
【专利摘要】本发明涉及抗体工程和抗感染医药领域，提供一种检测和评价分子和药物生物学功能的方法及其用途。尤其涉及一种检测(人)抗人乙型肝炎病毒抗体生物学功能的方法，该方法能有效的测定所述的分子和药物制剂或(人)抗人乙型肝炎病毒抗体的生物学功能的水平。该方法通过检测受试先导分子和药物在动物体内中和病原体关键分子的能力，以及受试先导分子和药物在动物体内打破免疫耐受重建免疫保护的能力，界定先导分子和药物的生物学活性。利用该方法可以快速检测抗体和其它抗感染药物清除病毒，控制病毒感染和致病的能力。本方法操作过程简单，结果重复性好，是对现有抗病毒药物功能性检测和评估方法的补充，该方法的建立为目前细胞和动物感染模型病毒的药物研发，提供了一种新的选择。
【专利说明】一种检测和评价分子和药物生物学功能的方法及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗体工程、和抗感染医药领域，涉及一种检测和评价分子和药物生物学功能的方法及其用途。具体涉及一种有效的检测和评价分子和药物在动物体内抗感染能力的方法，以及一组在体内可以实现以下一种或多种功能的分子:1)中和病原体关键分子；2)创建关键分子低度窗口期；3)打破免疫耐受，重建免疫调控。
【背景技术】
[0002]人乙型肝炎病毒(human hepatitis B virus, HBV)感染是全球性的公共卫生问题，根据世界卫生组织((World Health Organization,WHO)的统计,全球范围内有超过20亿人曾感染过HBV，其中，3.5亿正遭受慢性HBV感染之苦(WH0，2000)。我国为乙型肝炎的高发区。2006年全国病毒性肝炎血清流行病学调查数据显示，在全部人群中乙肝表面抗原(HBsAg)的阳性率为7.18%。据此估计我国约有9300万人为HBV携带者，其中，3000万例为慢性乙型肝炎患者。研究还显示，慢性的HBV感染与肝硬化和肝癌的发病率和死亡率密切相关。
[0003]现有技术公开了乙肝病毒是DNA病毒，具部分环状双链的DNA。其基因组长度约为
3.2kb，含有四个基本阅读 框架，分别是编码核心蛋白(核心抗原)和e蛋白(e抗原)的C基因；编码大、中和小表面蛋白(表面抗原)的S基因；编码聚合酶的P基因和编码X蛋白的X基因。人乙型肝炎病毒具有种群和组织特异性，只感染人类的肝细胞。
[0004]研究显示，乙肝病毒的感染始于病毒附着在肝细胞上，通过未知的机制，病毒外膜与细胞膜发生融合，病毒核衣壳被释放到细胞质中并解聚，病毒基因组转移到被感染细胞的细胞核内，在细胞修复酶的作用下形成闭合环状DNA (cccDNA)。随后,病毒以cccDNA为模板转录产生四种mRNA，分别是3.5kb的pgRNA、2.4kb的mRNA、2.1kb的mRNA和0.8kb的mRNA。2.4kb和2.1kb的mRNA指导表面蛋白的翻译；0.8kb的mRNA指导X蛋白的翻译；而
3.5kb的pgRNA除了指导核心蛋白和聚合酶的翻译外，还作为病毒的前基因组RNA，被新产生的核心蛋白和聚合酶包裹，形成新的核衣壳。在核衣壳中，病毒聚合酶以pgRNA为模板通过反转录合成新的DNA基因组。最终，完成DNA复制的核衣壳被表面蛋白包裹，形成成熟的病毒粒子，分泌出细胞，开始新的感染周期。
[0005]研究还显示，在HBV感染者的血清中可见三种不同形态的病毒颗粒，即大球型颗粒(又称为Dane颗粒)、小球形颗粒和管型颗粒。虽然这三种形式的颗粒都具有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，但是只有大球型颗粒内部含病毒的双链DNA分子，并具感染性。同时值得注意的是，小球形颗粒，也称亚病毒颗粒，一般在血液中可比Dane颗粒多出1000至1，000，000倍。部分病人自然感染状态下会出现保护性抗体。研究表明，乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的主要抗原为“a”决定簇。免疫显性“a”表位在所有病毒血清中存在。
[0006]现有技术的人抗乙肝病毒抗体(HBIG)系从乙型肝炎疫苗免疫健康人群中，采集高效价血浆或血清后，分离提取制备的免疫球蛋白制剂，在临床上被用于降低HBV的感染率。在中国和其它HBV高发地区，母婴传播是HBV的主要的感染途径之一。有临床研究显示，HBIG与重组HBV疫苗联合使用是目前阻断HBV母婴传递最有效的手段，其保护率达95%左右。乙肝表面抗原(HBsAg)阳性母亲所产新生儿出生后24h内使用乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白(HBIG)，已在《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》中被建议。器官移植后乙肝病毒感染是影响手术成功率的主要因素。高剂量的HBIG抑制肝脏移植后HBV再感染率的成功率达60%至85%。临床研究表明，围产期的母婴传播率与母体病毒载量高度相关，肝脏移植后HBV再感染的风险也与病毒载量直接相关。HBIG的使用可能降低病毒的载量。
[0007]由于HBIG的生产和临床应用分别存在着血源稀缺和未知血源性传播疾病感染等隐忧，重组型人抗乙肝单抗(mAb)已受到了医药产业界的关注。值得注意的是，虽然治疗性单抗药物(mAbs)在过去的20年里已悄然成为推动生物医药产业发展的主力，但是单抗技术在感染性疾病领域的应用相对滞后，目前只有一个抗-呼吸道合胞病毒的单抗药物用于临床。Shlomo Dagan等人在2001年报导了两个抗HBV人单抗的联合用药的一期临床试验结果后，有关抗HBV单抗的研究进展缓慢，其中的一个重要原因，就是缺乏评估重组人抗乙肝单抗(mAb)中和病毒能力的评估系统。
[0008]与HIV和HCV不同，HBV至今未建立可靠的细胞感染模型和动物保护模型。多年以来，人原代肝细胞是研究HBV病毒感染性唯一的一种细胞。但是，实践中，人原代肝细胞很难培养，不能在体外繁殖并且需要特殊的生长因子来维持其原代的分化状态。即使在培养过程中加入二甲基亚砜(DMSO)和聚乙二醇(PEG)，也只能有限的改善HBV病毒的感染力，以及感染细胞扩增病毒的能力，加之来源困难等其它问题，人原代肝细胞很难被应用到以细胞为基础的体外中和实验中。
[0009]还有研究报道了人肝癌细胞系细胞(如，!fepG2)在培养中加入二甲基亚砜(DMSO)和5-aza_2'-脱氧胞啶后能探测到病毒抗原的存在，可是，该结果的重复性差；有研究从原发性肝癌和慢性HCV共感染的患者中分离出的IfepaRG细胞在感染前先通过二甲基亚砜(DMSO)和皮质醇(hydrocortisone)的前处理达到了成功感染HBV的目的,但该细胞系不稳定且处理过程繁琐，而且，成功建立HBV感染的人细胞系只能产生病毒颗粒，不能用于体外病毒中和实验。
[0010]树駒的原代肝细胞被发现具有感染人HBV的能力，并且感染后能探测到乙肝表面抗原和乙肝e抗原的分泌。有实验室正用树駒的原代肝细胞作为多肽和抗体制剂的评估，但是，只有原代分离的树駒肝细胞具有感染和复制病毒能力；因此，该系统时效性短，来源复杂，可重复率低，限制了它应用到体外中和病毒实验中。
[0011]利用抗体工程技术可以设计、构建、表达和生产具有高度特异性的抗病毒单克隆抗体，如何检测和判定单抗的抗感染能力，去伪存真，是将单抗成功导入临床应用的关键。虽然细胞感染模型和动物保护模型已成功应用于部分病毒，如Hiv和HCV等的研究，但是，受体外细胞感染系统培养和感染条件及动物模型的异种性等因素的限制，细胞感染模型和动物保护模型的实际应用效率和价值尚待观察。此外，一些具高度种属，组织和细胞特异性的病毒感染，如HBV感染，以及 一些新发和突发性的感染病毒，至今还没有相应的细胞感染和动物保护模型。因此，医疗和制药界急需一个快速，高效和通用的检测系统，作为现有方法和手段的补充。
[0012]HBV被动免疫和HBIG主动免疫都可以有效的控制HBV的感染率，提示虽然HBV病毒感染的靶细胞为肝细胞，血液是机体抗衡HBV感染的主要屏障。此外，业界清楚，无论是细胞感染模型、动物保护模型还是临床感染，病毒的感染率都与病毒的载量相关。鉴于上述情况，有研究者假设，受试分子或药物在血液中调控病毒载量的能力，与其抗感染能力相关，并在此基础上，利用沉降性病毒复合物技术，建立抗感染检测系统；另有研究者利用沉降性抗原抗体复合物技术，设计和生产了具有免疫再生能力的治疗性疫苗，并应用于持续性乙型肝炎的基础研究和临床治疗，该技术已获得国内外专利。
[0013]受病原体宿主特异性的限制，以及病原体跨种实验安全性问题的考量，抗感染分子和抗感染制剂体内评价系统的研究在80年代前进展缓慢。这一状况，在转基因小鼠技术建立后得到改善。Chisari等和Babinet等于1985年在科学杂志上分别发表了有关HBV转基因小鼠的研究论文，1995年Guidotti和Chisari等建立了载有Dl.3的HBV的转基因鼠。目前，在中国报导建立的HBV转基因鼠有BALB/C遗传背景HBV全基因转基因小鼠；C57BL/6遗传背景HBV全基因转基因小鼠；HLA-A2/HBV人源化双转基因小鼠:具有人MHC I类分子抗原递呈功能的HBV转基因小鼠模型；Rag-1-/HBV双转基因小鼠模型。值得一提的是，由于转基因小鼠基因整合位点和表达的差异性，HBV转基因小鼠在分子评价和药物开发中的应用明显滞后。本发明利用载有部分病原体基因，并稳定表达病原体感染及致病关键分子的转基因小鼠，拟建立一种检测和评价分子和药物体内抗感染活性的新方法。
【发明内容】
[0014]本发明的目的是提供一种检测和评价分子和药物生物学功能的方法及其用途。尤其涉及一种检测(人)抗人乙型肝炎病毒抗体生物学功能的方法，该方法能有效的测定所述的分子和药物制剂或(人)抗人乙型肝炎病毒抗体的生物学功能的水平。
[0015]本发明的另一个目的是提供上述检测方法在筛选抗HBV感染的化合物、蛋白或者核酸以及免疫调节制剂中的用途，以及涉及一组在体内可以实现以下一种或多种功能的分子:1)中和病原体关键分子；2)创建关键分子低度窗口期；3)打破免疫耐受，重建免疫调控。
[0016]更具体的，本发明解决的问题是建立一个快速有效的检测系统，以界定抗HBV多抗，抗HBV单抗，抗病毒分子和制剂，以及具免疫调控能力的药物和制剂的抗感染能力。
[0017]本发明利用表达(不同长度的)乙肝表面抗原的转基因小鼠，将分子和制剂用不同的方法导入转基因小鼠体内进行干预，建立了一种检测和评估先导分子抗感染能力的新方法，尤其在动物体内检测和评估先导分子抗感染能力。该方法通过检测受试先导分子和药物在动物体内中和病原体关键分子的能力，以及受试先导分子和药物在动物体内打破免疫耐受重建免疫保护的能力，界定先导分子和药物的生物学活性。利用该方法可以快速检测抗体和其它抗感染药物清除病毒，控制病毒感染和致病的能力。本方法操作过程简单，结果重复性好，是对现有抗病毒药物功能性检测和评估方法的补充，该方法的建立为目前尚无有效的细胞和动物感染模型病毒的药物研发，提供了一种新的选择。
[0018]本发明提供一种检测和评价分子和药物生物学功能的方法，其包括检测和评价所述分子和药物抗病毒感染活性，通过检测受试分子在血清中诱导产生沉降性病原体复合物的能力，检测受试分子和药物的中和病原体的能力和打破免疫耐受的能力和重建免疫保护和控制的能力；其包括步骤:
[0019] (I)建立并利用表达病原体关键大分子的模型；[0020](2)将受试分子或药物对模型进行干预；
[0021](3)检测受试分子，药物，目标分子，以及受试模型对目标分子的免疫反应。
[0022]本发明中，所述的病原体关键大分子是人乙肝病毒的表面抗原。
[0023]本发明所述的方法可用于检测受试分子和药物对受试模型的特异性免疫耐受以及免疫重建的调控。
[0024]本发明的方法可用于筛选或者界定具有抗感染的小分子化合物、蛋白或者核酸。
[0025]本发明的方法可用于筛选或者界定抗HBV的多克隆抗体或者单克隆抗体。
[0026]本发明中，还提供了一组抗感染活性分子，其特征在于，能够中和病原体感染关键大分子。
[0027]本发明中，还提供了一组抗感染活性分子，其特征在于，能够中和病原体感染关键大分子，并建立一关键分子的低度窗口期，打破免疫耐受，重建免疫调控。
[0028]更具体的，本发明的检测和评价分子和药物生物学功能的方法依次包括下列步骤:
[0029](I).挑选7-8周适龄雌性小鼠，小鼠框下静脉丛采血，血样37摄氏度静置I小时后，10000转/分离心30分钟后取血清。应用雅培1-2000全自动化学发光免疫分析仪检测乙肝表面抗原(双抗体两步夹心法，试剂盒)和乙肝表面抗体(双抗原两步夹心法，试剂盒);
[0030](2).选取检测值在12_25IU/ml范围内的小鼠，进行实验。
[0031](3).分组处理:根据血清乙肝表面抗原检测的结果，将小鼠分为三组，保证各组表面抗原平均水平相当，差异无统计学意义。第一组是制剂溶剂对照组，三到三十只，每只腹腔注射0.5ml溶剂；第二组是已知具抗感染活性的药物，三到三十只，每只腹腔注射
0.5ml ;第三组是受试分子或制剂，三到三十只，每只腹腔注射0.5ml。
[0032]4).监测指标:从给药第二天开始监测小鼠血清中乙肝表面抗原和乙肝表面抗体的水平.[0033]5).视实验对抗原低度窗口期的需要，上述第三和第四步，可在三-四天后重复一至数次。在低度窗口期后，血清抗原的监测时间间隔可以延长一至数天。
[0034]6).实验结束前处理小鼠，取小鼠肝脏同一部位做组织切片，剩余部分液氮冻存，小鼠组织切片采用HE染色，并进行病理分析。
[0035]利用上述检测和评价的方法可以筛选并界定具抗感染能力的受测分子(受试分子)；所述的受测分子是抗HBV的多克隆抗体HBIG或者单克隆抗体。
[0036]利用本发明的方法检测了 HBIG，和人抗HBV单抗CFl或FCl)，中和转基因小鼠血清中HbSAg的能力，结果显示，在同一个国际单位(1-100IU)，HBIG和人抗HBV单抗BCl钧有中和血清中HbSAg的能力和形成低度窗口期的能力，部分转基因小鼠经人抗HBV单抗BC处理后，可在血清中重建免疫保护。
[0037]已知转基因鼠可用于抗感染药物的评价和研究，转基因鼠技术及药物评估技术是本领域技术人员所熟知的，与已知的评价方法相比较，本发明利用抗体技术在血清中成功的中和了已表达的转基因蛋白，并创建了一个可以解除免疫耐受，重建免疫保护的窗口期，有临床实用性。
[0038]本发明利用沉降性病毒复合物技术，建立了一种检测和评价分子和药物生物学功能的方法。利用该方法可以快速检测抗体和其它抗感染药物在体内清除病毒和控制病毒感染的能力。本方法操作过程简单，结果重复性好，对现有抗病毒药物功能性检测和评估方法提供了有意义的补充，该方法的建立为目前尚无有效的细胞和动物感染模型病毒(如HBV)的药物研发，提供了一种新的选择。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1是HbSAg在转基因小鼠内的稳定表达。
[0040]图2是抗HBV单抗与HBIG在HbSAg转基因动物体内中和HbSAg的能力。
[0041]图3是抗HBV单抗和HBIG在HbSAg转基因动物体内可诱导HBSAg底度窗口期(不用将反弹的点放入)。
[0042]图4是抗HBV单抗在HbSAg转基因动物中可打破免疫耐受重建免疫调控。
【具体实施方式】
[0043]下面结合具 体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述:例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989) ； ((DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984);《蛋白质纯化:原理和实践》第2版(Springer-Verlag,N.Y.),以及《实验免疫学手册》1-1V卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。
[0044]实施例1:抗HBV单抗与HBIG在动物体内中和HbSAg的能力
[0045]利用本发明建立的检测方法，分别检测抗HBV单抗与HBIG在动物体内中和HbSAg的能力。HBIG为由中生集团生产的人抗乙肝病毒球蛋白。人源化抗乙肝病毒单克隆抗体由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供。
[0046]具体检测步骤是:
[0047](I)选用稳定表达 HbSAg 的，7-8 周龄的雌性 C57BL/6J-Tg (AlblHBV) 44Bri/Jf4J小鼠进行实验。
[0048](2)分组后，腹腔注射0.5毫升实验样品。
[0049](3)在特定时间点小鼠框下静脉丛采血，血样室温静置I小时后，以10，000转/分的速度离心30分钟后取血清。
[0050](4)应用雅培1-2000全自动化学发光免疫分析仪检测乙肝表面抗原(双抗体两步夹心法，试剂盒)和乙肝表面抗体(双抗原两步夹心法，试剂盒)；
[0051](5)视实验对抗原低度窗口期的需要，上述第三和第四步，可在三-四天后重复一至数次。在低度窗口期后，血清抗原的监测时间间隔可以延长一至数天。
[0052](6)实验结束前猝死小鼠，取小鼠肝脏同一部位做组织切片，剩余部分液氮冻存。小鼠组织切片采用HE染色，并进行病理分析。
[0053](7)对有抗体反弹的小鼠进行种属分析。
[0054]结果显示，实验小鼠在实验时段内，血清HbSAg水平稳定(如图1和表1所示)。已广泛应用于乙肝病毒感染以及治疗性疫苗的人抗HBV多抗HBIV，在注射后可迅速中和实验动物中的HbSAg，结果具统计学意义；人抗HBV单抗CFl (⑶C&FUDAN)与HBIG具有相同的生物学功能，两者间无显著性差异(如图2所示)，HBV单抗与HBIG具生物等效性；接受HBIG以及抗HBV单抗处理后，可在小鼠的血清中，形成一低度HbSAg的窗口期(如图3所示)，窗口期的长短受注射抗体的浓度和次数调控；
[0055]表1实验小鼠血清HbSAg水平稳定
【权利要求】
1.一种检测和评价分子和药物生物学功能的方法，其特征在于，利用表达病原体关键大分子的模型，检测受试分子和药物的中和病原体的能力和打破免疫耐受的能力和重建免疫保护和控制的能力；其包括步骤: (1)建立并利用表达病原体关键大分子的模型； (2)将受试分子或药物对模型进行干预； (3)检测受试分子，药物，目标分子，以及受试模型对目标分子的免疫反应。
2.按权利要求1的方法，其特征在于，所述的病原体关键大分子是人乙肝病毒的表面抗原。
3.权利要求1所述的方法在用于检测受试分子和药物对受试模型的特异性免疫耐受以及免疫重建的调控中的用途。
4.权利要求1所述的方法在用于筛选或者界定具有抗感染的小分子化合物、蛋白或者核酸中的用途。
5.权利要求1所述的方法在用于筛选或者界定抗HBV的多克隆抗体或者单克隆抗体中的用途。
6.一组抗感染活性分子，其特征在于，能够中和病原体感染关键大分子。
7.—组抗感染活性分子，其特征在于，能够中和病原体感染关键大分子，并建立一关键分子的低度窗口期，打破免疫耐受，重建免疫调控。
【文档编号】A61K39/42GK103977425SQ201310051361
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2013年2月8日 优先权日:2013年2月8日
【发明者】陈力, 闻玉梅, 李蒙 申请人:复旦大学