专利名称：一种氧氟脂质微泡及其制备方法
技术领域：
本发明属医药领域,具体涉及一种氧氟脂质微泡(Microbubble,MB)及其作为补氧治疗剂。
背景技术：
新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-1schemie encephalopathy, HIE)是指各种围产期窒息导致胎儿或新生儿脑的缺氧缺血性损伤，是新生儿死亡和儿童期伤残的主要原因，发病率约为活产儿的(I 8) / 1000，其中10% 20%在新生儿期死亡，存活者中25% -30%可能留有某种类型的远期神经发育后遗症。治疗新生儿缺氧或其它缺氧性疾病，目前采取给氧治疗的方式有多种:方法一，常规吸氧，也是最普遍常用的。对轻、中型缺氧的患儿，采用鼻导管浅插法给氧，氧流量的大小、浓度、压力，可间接影响血氧饱和度，当氧流量大、浓度高、压力大、在一定条件下，血氧饱和度可明显升高，但过高的氧流量，可造成肺损伤，甚至氧中毒。方法二，高压氧治疗。高压氧(hyperbaric oxygen, HBO)疗法是目前有关HIE治疗的研究热点之一,该疗法是在高压环境下使用氧气治疗疾病，在国内外应用较广泛，但其在应用时间、适应证、压力选择及疗程等方面还存在分歧，尤其会引发很多并发症:减压病、神经性氧中毒、肺组织纤维化、晶状体后纤维化组织增生等，故而在一定程度上限制了其应用。方法三，静脉输入高氧液。光量子氧透射液体疗法是其中的一种，其是以5% 10%葡萄糖或生理盐水作为载体，经特定波长、特定强度的紫外线照射、充氧、磁极化后输入人体静脉血管内的一种特殊方法。它将量子能量、臭氧携入人体内，并被血液中各种细胞吸收，从而产生一系列光化学物理效应，以增加血氧饱和度，提高红细胞携氧和氧分压，降低二氧化碳压，从而改善组织缺氧缺血状态，提高组织摄氧能力。光量子疗法对人体多种疾病均有一定的治疗效果。因此，在H IE临床治疗方面更有价值的是研究一种更有效更直接的静脉氧传递方式，即微泡造影剂作为氧载体传送氧气到达缺氧脑组织。这种方式可保证氧气不需要经过呼吸系统交换而可以直接进入血液，可以更快地补给氧气，改善大脑缺氧状态，可望成为一种新的治疗方式。近几年来，超声微泡造影剂已成为国内外研究的热点。微泡造影剂目前被认为是最好的人体微管内的造影材料，在医学临床检测中得到了越来越多的应用。除了作为超声诊断药剂之外，更多的研究发现微泡造影剂是一种高效的载体，且超声辐照能使其定向爆破，将所载之基因或药物释放在靶组织内，在促进血栓溶解、基因转染及药物体内运输定点释放方面已取得一定的成效。微泡载氧的研究目前尚处于起步阶段,而国外学者Bisazza A等(Int J Pharm.2009，378(1-2):215-217)公开了一种壳聚糖外壳的氧气微泡，其气体核为单纯氧气，平均粒径2 Mffl，体外实验证实其可作为工具运载氧气到缺氧组织，具有渗透性、无毒性、无溶血性、扩散能力好，是一种安全、有效的载体，可运送氧气到缺氧组织。微泡的尺寸符合安全注射进入毛细血管网的要求，外壳能够将氧气释放出来。在2 MHz超声辐照下氧气释放加速，共聚焦激光扫描电镜及免疫荧光图像显示此种纳米造影剂能散播到细胞质区域内。现研究表明，微泡联合超声辐照能可逆开放血脑屏障(BBB)，并未引起急性神经细胞的损伤，通过脑微血管运送微泡将治疗化合物到大脑组织，再经超声诱导微泡破裂在大动物模型中渗透传递药物。这种诱导BBB开放的方法是可逆的，能作为一种安全的非侵入性的方法经BBB完成药物或基因的传递。微泡造影剂发展过程中曾仅以氧气为核心，这样看似载氧量极高，其实因氧气的分子量小，易受动脉压力影响，微球里的气体很快扩散，球壁塌陷而迅速失去声反射性，并且不能随血流分布至全身，所以限制了其使用范围。而氟碳气体作为大分子惰性气体，表现出了较小的弥散度，其在微球中不易穿过球壁而扩散，能耐受33 330.5Pa以上的动脉压力，它在血管内停留的时间足以满足实际应用所需要的最大值。其中全氟化碳的独特特性包括疏水性、疏脂性、极惰性、衍生性，可预报性、氟原子的电子结构和空间需求等，其低水溶性是其在体内长时间存在的关键，全氟化碳具有氧气的高溶解特性，如果能将氧气和氟碳气体结合一起作为气体核，具有既可以维持微泡的稳定性和体内的长循环存在，也可以传递氧气到靶组织的优势。脂质微泡的优良载药性能和靶向性能，脂质微泡在载药、载基因及靶向显像方面已相当成熟，脑组织内显像效果好，联合一定能量的超声辐照能够可逆地开放血脑屏障。CN200810217176公开了一种超声造影剂，由合成磷脂或其聚二乙醇衍生物10-90%和糖脂成分10-90%主要组成复合脂膜，脂膜内充有全氟碳气体，该造影剂稳定，耐压性好，载药量大。CN200310122421.2公开了一种以磷脂成分为成膜材料的超声造影剂组合物，该组合物由磷脂成分1%-10%/起泡剂5%-15%聚合物70-90%0稳定剂0.5%_10%和氟碳气体组成。CN200448002975.2公开了一种冻干基质的脂质造影剂，由磷脂稳定的充气微泡的液体水溶性混悬液，制备一种水溶性介质/磷脂和水不溶性有机溶剂组成的乳剂，冻干，然后在充气微泡的水溶性混悬液中重建而成。本发明人在脂质微泡基础上，通过将超声、化学等技术相结合，在微泡核中溶入氧气，构建出一种新型的、稳定的氧氟脂质微泡，其在超声仪可视监控下，被超声辐照破坏，将氧气释放在缺氧脑组织，以实现直接、定点且高效供氧、满足神经细胞的需氧要求，达到保护神经细胞，避免由于缺氧未及时纠正而导致细胞不可逆转损伤的目的。本发明的脂质微泡以载氧治疗为目的研究国内外尚无相关报道，这种将超声造影剂技术与生物化学治疗技术相结合的新兴技术，具有良好的应用开发前景，可为临床HIE患儿的早期纠正缺氧治疗提供一个新思路和新手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高效载氧、性能稳定、粒径均匀的氧氟脂质微泡，该氧氟脂质微泡，由微泡、和存于微泡内的氧气和全氟化碳气体组成，其中，微泡主要由合成磷脂、天然磷脂或氢化磷脂和它们的聚乙二醇衍生物构成，氧气与全氟化碳的体积比为4:1 8:1。在一实施方案中， 本发明的氧氟脂质微泡，由微泡、和存于微泡内的氧气和全氟化碳气体组成，其中，微泡主要由合成磷脂及其聚乙二醇衍生物构成，氧气与全氟化碳的体积比为4:1 8:1，其中合成磷脂与其(合成磷脂的)聚乙二醇衍生物的重量比为1:9 — 9:1，优选为5:2。在上述实施方案中，本发明的氧氟脂质微泡，所述合成磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油一种或几种，优选二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC);所述合成磷脂为聚乙二醇衍生物为聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000- 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇5000- 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、甲氧基聚乙二醇5000- 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺的一种，优选甲氧基聚乙二醇5000- 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-MPEG5000)，所述氧气与全氟化碳的体积比优选为5:1，所述全氟化碳选自全氟乙烷、全氟丙烷和全氟丁烷中的一种或几种，优选全氟丙烷。在上述实施方案中，本发明的氧氟脂质微泡，脂质微泡的平均粒径为0.5
4.0 μ m,优选平均粒径为0.9 2.0 μ m。在一具体实施方案中，本发明的氧氟脂质微泡，由微泡、和存于微泡内的氧气和全氟化碳气体组成，其中，微泡主要由二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和甲氧基聚乙二醇5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-MPEG5000)构成，其重量比为1:9 一 9:1，优选为5:2，氧气与全氟化碳的体积比为4:1-8:1，优选5:1，所述全氟化碳选自全氟乙烷、全氟丙烷和全氟丁烷中的一种或几种，优选全氟丙烷。在一优选实施方案中，本发明的氧氟脂质微泡，由微泡、和存于微泡内的氧气和全氟丙烷气体组成，其中，微泡主要由二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和甲氧基聚乙二醇5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-MPEG5000)构成，其重量比为5:2，氧气与全氟丙烷的体积比为5:1。在上述具体和优选实施方案中，本发明的氧氟脂质微泡，脂质微泡的平均粒径为0.5 4.0 μ m,优选平均 粒径为0.9 2.0 μ m。本发明还提供了一种氧氟脂质微泡的制备方法，包括以下步骤:
a)在合成磷脂、天然磷脂或氢化磷脂和它们的聚乙二醇衍生物中加入甘油和PBS，加热溶解，得到溶液；
b )在步骤a的溶液中排除空气，加压通入含有氧气和全氟碳的混合气体，其中，氧气与全氟化碳的体积比为4:1-8:1;
c )利用超声或机械振荡步骤b的溶液，形成得到白色乳液状脂质微泡混悬液，获得氧氟脂质微泡。上述本发明的方法，所述合成磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺或二棕榈酰磷脂酰甘油，优选二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，所述合成磷脂为聚乙二醇衍生物为聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000- 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇5000- 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、或甲氧基聚乙二醇5000- 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺，优选甲氧基聚乙二醇5000- 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-MPEG5000)，所述氧气与全氟化碳的体积比为5:1，所述全氟化碳选自全氟乙烷、全氟丙烷和全氟丁烷中的一种或几种，优选全氟丙烷。在一具体实施方案中，本发明的氧氟脂质微泡的制备方法，包括以下步骤:a)在二硬脂酰磷脂酰胆碱和甲氧基聚乙二醇5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(重量比5:2)中加入甘油和PBS，加热溶解，得到溶液；
b )在步骤a的溶液中排除空气，加压通入含有氧气和全氟丙烷的混合气体，其中，氧气与全氟丙烷的体积比为5:1;
c )利用超声或机械振荡步骤b的溶液，形成得到白色乳液状脂质微泡混悬液，获得氧氟脂质微泡。本发明的氧氟脂质微泡性能稳定、粒径均匀，能用于超声增强显影，同时高效、稳定载氧，克服单气体氧易损失的缺点。本发明的氧氟脂质微泡联合超声辐照对缺氧神经细胞提供了供氧治疗效果，为新生儿缺氧缺血性脑病在早期及时、安全、高效供氧，改良预后提供了一个新手段。同时，本发明的氧氟脂质微泡中氧气成分具有两种功效:一作为显像成分即用作超声造影剂，二作为“治疗药物”，为 缺氧细胞靶向供氧，即作补氧治疗剂，一举两得。
图1、微泡光镜图(X 400 )
图2、氧氟脂质微泡粒径分布图 图3、氧氟脂质微泡对缺氧神经细胞毒性百分比 图4、氧氟脂质微泡对细胞HIF-1 a蛋白表达百分比 图5、兔肝显影的时间强度曲线图
具体实施例方式实施例1氧氟脂质微泡的制备
O精密称量器称取50mgDSPC及20mgDPPE-MPEG5000于胶囊瓶中，加入50 μ I甘油及450 μ IPBS ；2)在55°C恒温水浴箱中加热30min，使DSPC及DPPE-MPEG5000完全溶解在溶液中；3)用封口膜将胶囊瓶密封；4)用注射器分别抽取3体积的氧气及I体积的全氟丙烷，利用三通管在负压条件下将氧气及全氟丙烷混合；5)利用三通管，在负压条件下用混合气体置换胶囊瓶中的空气，达到饱和状态；6)利用银汞胶囊调和器机械震荡后，即得到白色乳液状脂质微泡混悬液，即得氧氟脂质微泡，放于4°C冰箱保存。2)实施例2 氧氟脂质微泡的制备
I)精密称量器称取50mgDSPC及20mgDPPE-MPEG5000于胶囊瓶中，加入50 μ I甘油及450 μ IPBS ；2)在55°C恒温水浴箱中加热30min，使DSPC及DPPE-MPEG5000完全溶解在溶液中；3)用封口膜将胶囊瓶密封；4)用注射器分别抽取4体积的氧气及I体积的全氟丙烷，利用三通管在负压条件下将氧气及全氟丙烷混合；5)利用三通管，在负压条件下用混合气体置换胶囊瓶中的空气，达到饱和状态；6)利用银汞胶囊调和器机械震荡后，即得到白色乳液状脂质微泡混悬液，即得氧氟脂质微泡，放于4°C冰箱保存。实施例3氧氟脂质微泡的制备
I)精密称量器称取50mgDSPC及20mgDPPE-MPEG5000于胶囊瓶中，加入50 μ I甘油及450 μ IPBS ；2)在55°C恒温水浴箱中加热30min，使DSPC及DPPE-MPEG5000完全溶解在溶液中；3)用封口膜将胶囊瓶密封；4)用注射器分别抽取5体积的氧气及I体积的全氟丙烷，利用三通管在负压条件下将氧气及全氟丙烷混合；5)利用三通管，在负压条件下用混合气体置换胶囊瓶中的空气，达到饱和状态；6)利用银汞胶囊调和器机械震荡后，即得到白色乳液状脂质微泡混悬液，即得氧氟脂质微泡(MB(5:1))，放于4°C冰箱保存。实施例4-7 氧氟脂质微泡的制备
权利要求
1.一种氧氟脂质微泡，由微泡、和存于微泡内的氧气和全氟化碳气体组成，其中，微泡主要由合成磷脂、氢化磷脂或天然磷脂和它们的聚乙二醇衍生物构成，氧气与全氟化碳气体的体积比为4:1-8:1。
2.如权利要求1所述的微泡，合成磷脂与合成磷脂聚乙二醇衍生物的重量比为1:9 -9:1，优选为5:2。
3.如权利要求1或2所述的微泡，所述合成磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油的一种或几种，所述合成磷脂的聚乙二醇衍生物为聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000- 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇5000- 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、甲氧基聚乙二醇5000- 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺的一种。
4.如权利要求1所述的微泡，所述氧气与全氟化碳的体积比为5:1。
5.如权利要求1或4所述的微泡，所述全氟化碳选自全氟乙烷、全氟丙烷和全氟丁烷中的一种或几种。
6.如权利要求5所述的微泡，所述全氟化碳为全氟丙烷。
7.如权利要求1所述的微泡，脂质微泡的平均粒径为0.5 4.0 μ m，优选平均粒径为0.9 2.0 μ mD
8.一种氧氟脂质微泡的制备方法，包括以下步骤: a在合成磷脂、天然磷脂或氢化磷脂和它们的聚乙二醇衍生物中加入甘油和PBS，加热溶解，得到溶液； b 步骤a的溶液排除 空气，并加压通入含有氧气和全氟化碳的混合气体，其中，氧气与全氟化碳的体积比为4:1-8:1; c利用超声或机械振荡步骤b的溶液，形成得到白色乳液状脂质微泡混悬液，获得氧氟脂质微泡。
9.如权利要求8所述的方法，所述合成磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油的一种或几种，优选二硬脂酰磷脂酰胆碱，所述合成磷脂为聚乙二醇衍生物为聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、甲氧基聚乙二醇5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺的一种，优选甲氧基聚乙二醇5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺。
10.如权利要求8所述的方法，所述氧气与全氟化碳的体积比为5:1。
全文摘要
本发明公开了一种氧氟脂质微泡补氧治疗剂，由微泡、和存在于微泡内的氧气和至少一种全氟化碳组成，气体核以氧气为主，全氟化碳为辅，其中，微泡主要由磷脂及其聚乙二醇衍生物构成。该氧氟脂质微泡补氧治疗剂在人体内可以通过静脉输送并靶向缺氧组织在超声辐照下控制释放氧气，治疗缺氧性疾病，同时作为造影剂用于超声增强显影，因此，该微泡既是显影剂，更是补氧治疗剂。
文档编号A61K49/22GK103212094SQ201310154479
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月28日 优先权日2013年4月28日
发明者杨春江, 唐毅, 肖欢, 王荞, 李攀, 王冬, 高洋 申请人:重庆医科大学附属儿童医院