胆固醇-泊洛沙姆-胆固醇三嵌段共聚物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及胆固醇-泊洛沙姆-胆固醇三嵌段共聚物及其制备方法和应用。该三嵌段共聚物是以泊洛沙姆为基本骨架，在其两端通过碳酸酯键连接胆固醇得到。其制备方法为：取泊洛沙姆置于密闭容器中，氮气条件下加入碱性催化剂和缚酸剂，缓慢滴加含胆固醇氯甲酯的二氯甲烷溶液。冰水浴中搅拌混合5-30min后置于室温反应，时间为1-72h，反应结束后减压除去溶剂，得粗产物；向粗产物中加入适量蒸馏水，以二氯甲烷萃取三次，再依次用冰水、饱和氯化钠和100mM盐酸清洗3次，经冰乙醚沉淀得白色蜡状物；对所得白色蜡状物经冰乙醚反复沉淀精制即得。该三嵌段共聚物具有临界胶束浓度低、载药量大、稀释稳定性好、合成工艺简单、成本低廉、应用范围广等优点。
【专利说明】胆固醇-泊洛沙姆-胆固醇三嵌段共聚物及其制备方法和应用
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于药物制剂领域，具体涉及到一类泊洛沙姆衍生物的制备方法及其在药物传递系统中的应用。
[0003]
【背景技术】
[0004]泊洛沙姆(Poloxamer)是一种经FDA批准的多功能药用辅料，商品名为普郎尼克(Pluronic),由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0)三嵌段构成,是一种两亲性的嵌段共聚物。随着亲水EO链和疏水PO链数目的不同，具有不同的亲水亲油平衡值(HLB)、临界胶束浓度(CMC)和油水分配系数(P)。由于泊洛沙姆具有无毒性、无抗原性、无刺激性、无致敏性、不溶血性、化学性质稳定等特点，其在医药领域已有很长的研究历史。
[0005]泊洛沙姆通常用作乳化剂、增溶剂、药物稳定剂、固体分散体载体、软膏剂及栓剂基质、透皮吸收促进剂等 ，可以增加难溶性药物溶解度，提高药物稳定性，控制药物释放，提高药物的生物利用度。以其为载体材料的研究涵盖了胶束、囊泡、乳剂、纳米粒等液体微粒制剂及其冻干品，也涵盖了固体分散体、颗粒剂、胶囊剂、片剂、栓剂和凝胶剂等固体和半固体制剂。
[0006]由于泊洛沙姆具有亲水的PEO长链，使其作为载体材料时具有立体稳定性作用，能够有效阻止含药微粒被巨噬细胞吞噬，从而延长制剂在体内的循环时间。Jackson等制备了四种聚合物微球，并用泊洛沙姆407 (F127)处理，结果发现，F127能够有效阻止进入体内的微球被血浆蛋白吸附和免疫球蛋白(IgG)调理，使微球免于被白细胞或单核细胞吞噬，进而降低由此引起的炎症反应。(Jackson, J.K., et al., Neutrophil activat1n byplasma opsonized polymeric microspheres:1nhibitory effect of Pluronic F127.B1materials, 2000.21(14): p.1483-1491)。
[0007]近年来人们还发现，泊洛沙姆不仅可以作为微储库用于药物的靶向递送，以其制备的胶束给药系统还具有逆转肿瘤多药耐药(Multidrug resistance, MDR)的作用。(Kabanov, A.V., E.V.Batrakova, and V.Y.Alakhovj Pluronic@ block copolymersfor overcoming drug resistance in cancer.Advanced drug delivery reviews,2002.54(5): p.759-779) (Zhao, L，et al., Curcumin loaded mixed micellescomposed of Pluronic P123 and F68: Preparat1n, optimizat1n and in vitrocharacterizat1n.Colloids and Surfaces B: B1interfaces, 2012.97:p.101-108)(Alakhova, D.Y., et al., Differential metabolic responses to pluronic in MDRand non-MDR cells: a novel pathway for chemosensitizat1n of drug resistantcancers.Journal of Controlled Release, 2010.142(1): p.89-100)目前，Alakhov研究小组开发的载阿霉素的泊洛沙姆混合胶束制剂(SP1049C)已经进入了 II期临床试验阶段，其处方为0.25 % Pluronic L61和2 % Pluronic F127，对于耐药肿瘤的治疗，效果十分显著“Alakhov，V., et al., Block copolymer-based formulat1n of doxorubicin.From cell screen to clinical trials.Colloids and Surfaces B: B1interfaces,1999.16(1): p.113-134) (Danson，S., et al., Phase I dose escalat1n andpharmacokinetic study of pluronic polymer-bound doxorubicin (SP1049C) inpatients with advanced cancer.British journal of cancer, 2004.90(11): p.2085-2091) (Valle, J.W., et al.，A phase 2 study of SP1049C，doxorubicin inP-glycoprotein-targeting pluronics, in patients with advanced adenocarcinoma ofthe esophagus and gastroesophageal junct1n.1nvestigat1nal new drugs, 2011.29(5): p.1029-1037)。
[0008]研究还表明，泊洛沙姆在药物穿越血脑屏障(BBB)的过程中也起着重要作用，它可通过抑制P-gp、耗竭细胞内ATP、降低膜微观粘度等不同作用机制使药物靶向入脑，提高药物在脑内的生物利用度，为药物脑部靶向提供了新的思路和策略。Kabanov等以牛脑血管内皮细胞(BBMEC)为体外BBB模型，考察了 Pluronic P85对Ρ-gp外排作用及BBMEC膜微观粘度的影响。结果表明，P85单体可以显著降低膜微观黏度,使P-gp外排减少。(Kabanov,A.V., E.V.Batrakova, and D.ff.Miller, Pluronic? block copolymers as modulatorsof drug efflux transporter activity in the blood - brain barrier.Advanceddrug delivery reviews, 2003.55(1): p.151-164) (Batrakova, E.V., et al.,Mechanism of pluronic effect on P-glycoprotein efflux system in blood—brainbarrier: contribut1ns of energy deplet1n and membrane fluidizat1n.Journalof Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2001.299(2): p.483-493)。
[0009]不仅如此，人们还惊喜的发现泊洛沙姆嵌段共聚物在新型基因治疗方面也具有巨大潜力。研究表明，质粒DNA注入骨骼肌后能够产生基因表达，但在绝大多数情况下，如果采用裸DNA所获得的表达水平低，持续时间短。一项以L61和F127的混合胶束(SP1017)为载体的DNA转染研究结果显示，SP1017比裸DNA转染效率高5_20倍，更重要的是获得最大基因表达所需的聚合物浓度(0.01%)极低，比动物给药安全限度至少低500倍。(Lemieux，P., et al., A combinat1n of poloxamers increases gene express1n of plasmidDNA in skeletal muscle.Gene therapy, 2000.7(11): p.986)。
[0010]虽然泊洛沙姆的研究成果令人们欣喜，但是也应意识到并不是所有型号的泊洛沙姆都具有上述特性。根据HLB和PO链长度的不同可将泊洛沙姆分为4类:(I) HLB 20-29的亲水性泊洛沙姆，如F68，F108, F127等；(II) HLB < 20 PO链30-60的泊洛沙姆，如P85, P105, L61 等；(III) HLB < 20，卩0链< 30 的泊洛沙姆，如 L35, L43, L64 ； (IV) HLB< 20，？0链> 60的泊洛沙姆，如P123和L121等。Batrakova等研究泊洛沙姆结构与P-gp抑制作用的关系时发现，II类泊洛沙姆对P-gp外排的抑制作用最大，III类和IV类次之。I类由于亲水性强，细胞内化作用弱，几乎没有抑制作用。(Batrakova, E.V.，etal., Optimal structure requirements for pluronic block copolymers in modifyingP-glycoprotein drug efflux transporter activity in bovine brain microvesselendothelial cells.Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,2003.304(2): p.845-854)而美国FDA批准的五种药用泊洛沙姆中(F68，F127，F87，F108，P124)，除P124外均属于第I类，这给泊洛沙姆在耐药方面的应用带来了限制。同时I类泊洛沙姆由于HLB值过大，亲水性较强，临界胶束浓度较高，对疏水性药物的增溶和载药也不是非常理想。
[0011]为了降低泊洛沙姆的临界胶束浓度，提高载药能力，人们采用多种方法对其进行改造。首先可以采用相似疏水嵌段的聚合物制备混合胶束，这从某种意义上弥补了单一胶束载药量低、稳定性差和不耐稀释等缺点。已进入II期临床试验的SP1049C就是采用L61 和 F127 制备的混合胶束。(Valle, J.ff., et al., A phase 2 study of SP1049C,doxorubicin in P-glycoprotein-targeting pluronics, in patients with advancedadenocarcinoma of the esophagus and gastroesophageal junct1n.1nvestigat1nalnew drugs, 2011.29(5): p.1029-1037)张伟等以F127和P123制备的紫杉醇混合胶束不仅具有良好的稳定性，还保持了泊洛沙姆逆转肿瘤多药耐药的作用。(Zhang，W.，etal., Enhanced antitumor efficacy by Paclitaxel-1oaded Pluronic P123/F127 mixedmicelles against non-small cell lung cancer based on passive tumor targetingand modulat1n of drug resistance.European Journal of Pharmaceutics andB1pharmaceutics, 2010.75(3): p.341-353)其次可以将泊洛沙姆与药物偶联。周建平的专利(申请号:201010534833.8，在审)中提到将泊洛沙姆与羧酸类药物偶联后既增加了药物的溶解度，又提高了胶束的稳定性。Slepnev等研究还表明，将泊洛沙姆与肽类/蛋白类药物共价结合后，能够使其有效的靶向机体的特异性部位或受体。(Slepnev，V.,Modificat1n of proteins for transport of b1logically active compounds withinthe cell.1992, Dissertat1n, Mosco w State University.X
[0012]目前研究较多的是以泊洛沙姆为基本骨架，对其进行结构修饰。如以PLA、聚癸二酸酐、亚麻酸及硬脂酸等对F127进行结构修饰,提高其载药能力。(X1ng, X.，K.Tamj and L Ganj Release kinetics of hydrophobic and hydrophilic model drugsfrom pluronic F127/poly (lactic acid) nanoparticles.Journal of ControlledRelease, 2005.103(1): p.73-82) (Shelkej N.B.and T.M.Aminabhavij Synthesisand characterizat1n of novel poly (sebacic anhydride-^c-Pluronic F68/F127) b1polymeric microspheres for the controlled release of nifedipine.1nternat1nal journal of pharmaceutics, 2007.345(1): p.51-58) (Guo，D.D., etal.，Enhanced anticancer effect of conjugated linoleic acid by conjugat1n withPluronic F127 on MCF-7 breast cancer cells.Cancer letters, 2007.254(2): p.244-254) (Gao，Q.，et al.，Synthesis and characterizat1n of novel amphiphiliccopolymer stearic acid-coupled Fl27 nanoparticles for nano-technology baseddrug delivery system.Colloids and Surfaces B: B1interfaces, 2011.88(2): p.741-748)。从上述文献可以看出，对泊洛沙姆进行结构修饰是可行的，合成的产物显著降低了泊洛沙姆的临界胶束浓度，提高了其载药能力。但是也要意识到上述配基可能存在的问题。比如以聚合物PLA和聚癸二酸酐为配基，由于聚合物自身的可降解性，会导致反应合成及纯化困难，产物分子量不单一。而采用亚麻酸这类不饱和物质为配基时，反应物本身就存在易氧化变质等问题，所得产物稳定性较差。因此，对泊洛沙姆修饰物的选择应该慎重，不仅要考虑增加泊洛沙姆的疏水性，更应该选择稳定性及生物相容性好的材料。
[0013]胆固醇又称胆留醇，是一种环戊烷多氢菲的衍生物，其广泛存在于动物体内，是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，不仅参与细胞膜的形成，而且是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料。一些研究表明由于肿瘤细胞的快速增殖，需要从血浆中大量摄取胆固醇来满足有丝分裂，导致机体胆固醇代谢紊乱、发生低胆固醇血症现象。(Scali，J., etal.，Relat1nship of serum cholesterol, dietary and plasma beta-carotene withlung cancer in male smokers.Eur J Cancer Prevj 1995.4: p.169-174) (Boyd,N.，et al.，Plasma lipids, lipoproteins, and familial breast cancer.CancerEpidem1logy B1markers & Prevent1n, 1995.4(2): p.117-122)。临床试验结果也显示，前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌及食管癌等患者的血清中胆固醇含量较低，癌细胞中胆固醇含量较高。(Freeman，M.R.and K.R.Solomon, Cholesterol and prostatecancer.Journal of cellular b1chemistry, 2003.91 (1): p.54-69) (Daniloj C.and P.G.Frank, Cholesterol and breast cancer development.Current Opin1n inPharmacology, 2012.12 (6):p.677-682) (Dessi，S.，et al.，Cholesterol contentin tumor tissues is inversely associated with high - density lipoproteincholesterol in serum in patients with gastrointestinal cancer.Cancer, 2006.73(2): p.253-258)。
[0014]近年来对胆固醇的研究还集中在将其与SiRNA偶联后用于SiRNA的递送。与不含胆固醇的载体相比，含胆固醇的载体可以显著提高DNA/RNA的转染效率。(Liu，Y.，et al.，Factors influencing the efficiency of cat1nic liposome-mediatedintravenous gene delivery.Nature b1technology, 1997.15(2): p.167_173)(Liu，Y.，et al.，Cat1nic liposome-mediated intravenous gene delivery.Journal ofB1logical Chemistry, 1995.270(42): p.24864-24870) (Soutschekj J.，et al.，Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administrat1n ofmodified siRNAs.Nature, 2004.432(7014): p.173-178)在siRNA递送过程中，胆固醇不仅介导载体与细胞膜融合及内吞，更重要的是其还起到靶向配基的作用。(董文娟，周银键，梁伟，siRNA脂质纳米输送载体的研究进展.2012.39(5): p.396-401)。
[0015] 因此如果将泊洛沙姆与胆固醇结合，将具有以下优势:首先，由于胆固醇具有较强的亲脂性，可以显著降低泊洛沙姆的临界胶束浓度，提高其载药能力；其次，可以利用胆固醇调节膜融合、胞饮及胞吞等特点，增加细胞对制剂的摄取，尤其对于胆固醇需求量较大的肿瘤细胞来说，还具有一定的靶向性。目前只有一篇关于泊洛沙姆与胆固醇合成的相关专利(专利申请号为:200610090689.7，无权)。该专利主要是以胆固醇、脂肪酸酐及泊洛沙姆为原料，合成单侧接枝的泊洛沙姆胆固醇聚合物，连接键为酸酐酯键，具体结构如下:
【权利要求】
1.一种胆固醇-泊洛沙姆-胆固醇三嵌段共聚物，其特征在于该共聚物是以泊洛沙姆为基本骨架，在其两端通过碳酸酯键连接胆固醇得到，其结构式如下:
其中，泊洛沙姆的平均分子量为1900-15000，η为2-130，m为15-70 ;优选地，泊洛沙姆的平均分子量为4600-15000，η为20-130，m为25-70 ;更优选地，泊洛沙姆的平均分子量为4600-12600，η 为 20-100，m 为 29-70。
2.根据权利要求1所述的胆固醇-泊洛沙姆-胆固醇三嵌段共聚物的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)取泊洛沙姆置于密闭容器中，氮气条件下加入碱性催化剂和缚酸剂，缓慢滴加含胆固醇氯甲酯的二氯甲烷溶液，其中泊洛沙姆与胆固醇氯甲酯的摩尔比为1:2-1:20，碱性催化剂选自4-二甲基吡啶或4-二烯丙基氨基吡啶，缚酸剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或吡啶，冰水浴中搅拌混合5-30 min后置于室温反应，反应时间为1-72 h，待反应结束后减压除去溶剂，得到粗产物； (2)向所得粗产物中加入适量蒸馏水，以二氯甲烷萃取三次，再依次用冰水、饱和氯化钠和100 mM盐酸清洗3次，经冰乙醚沉淀得白色蜡状物； (3)对所得白色蜡状物经冰乙醚反复沉淀精制，得到白色粉末状胆固醇-泊洛沙姆-胆固醇三嵌段共聚物。
3.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于泊洛沙姆与胆固醇氯甲酯的摩尔比为1:3-1:8，反应时间为12-24 h0
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于所述的碱性催化剂为4-二甲基吡啶，所述的缚酸剂为三乙胺。
5.一种药物载体组合物，其特征在于包含一种或多种如权利要求1所述的胆固醇-泊洛沙姆-胆固醇三嵌段共聚物。
6.一种药物组合物，其特征在于包含权利要求1中所述的胆固醇-泊洛沙姆-胆固醇三嵌段共聚物和活性药物。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述的活性药物为难溶性药物，选自紫杉醇(烷)类、喜树碱类、长春碱类、阿霉素类、替尼类、埃坡霉素类、维A酸类(如(全反式)维甲酸、阿维A酯、芳维甲酸)、二氢吡啶类、人参皂甙类、脂溶性维生素类、他汀类、激素类、康唑类、泊苷类、青霉素类、头孢类、大环内酯类、多烯/多肽类、醌类化合物、金属钼类化合物、萜类化合物、黄酮类、姜黄素类、联苯酚类化合物、吡唑酮类、嘧啶类似物、嘌呤类似物、呋喃类、非留体抗炎药、非黄酮类多酚类化合物、生物碱类、阿糖腺苷类似物、沙坦类、有机碘化合物、烷基酚类及其他。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于所述紫杉醇(烷)类选自紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛，喜树碱类选自羟基喜树碱、硝基喜树碱，长春碱类选自长春新碱、长春瑞滨，阿霉素类选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、伊达霉素、吡柔比星，替尼类选自来他替尼、埃克替尼、阿法替尼、奥替尼啶、多韦替尼、苏尼替尼、坦度替尼、马赛替尼、吉非替尼、巴非替尼，埃坡霉素类选自伊沙匹隆、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、埃坡霉素D、脱氧埃坡霉素，维A酸类选自(全反式)维甲酸、阿维A酯、芳维甲酸)，二氢吡啶类选自尼群地平、尼莫地平、氨氯地平、西尼地平，人参皂甙类选自人参皂苷Re、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rhl、人参皂苷Rh2、人参皂苷Rh3、人参皂苷Rh5，脂溶性维生素类选自维生素A、维生素D、维生素E、维生素K、胆骨化醇、钙三醇、VE烟酸酯，他汀类选自辛伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、美伐他汀，激素类选自地塞米松、地塞米松棕榈酸酯、醋酸地塞米松、非那雄胺、2-甲氧基雌二醇、乙烯雌酚、醋酸甲羟孕酮、可的松、氢化可的松、泼尼松、氢化泼尼松、前列地尔，康唑类选自伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑、氟康唑、益康唑，泊苷类选自依托泊苷、替尼泊苷，青霉素类选自青霉素G、阿莫西林、氨苄西林，头孢类选自头孢他啶、头孢曲松、头孢唑肟，大环内酯类选自红霉素、罗红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、雷帕霉素，多烯/多肽类选自曲古霉素、两性霉素B、环孢菌素A、放线菌素D，醌类化合物选自辅酶Q10、丹参酮IIA、丝裂霉素，金属钼类化合物选自顺钼、卡钼、奈达钼、阿劳钼、奥沙利钼，萜类化合物选自β_榄香烯、青蒿素、二氢青蒿素、冬凌草甲素、冬凌草乙素、细辛醚、细辛脑、葫芦素提取物、蒿本内酯、马蔺子素，黄酮类选自葛根素、水飞蓟素、藤黄酸，姜黄素类选自姜黄素、单去甲氧基双黄素、双曲甲氧基双黄素，联苯酚类化合物选自厚朴酚、和厚朴酚，吡唑酮类选自氨基比林、保泰松，嘧啶类似物选自氟尿嘧啶、齐多夫定棕榈酸酯、齐多夫定肉豆蘧酸酯、齐多夫定硬脂酸酯、齐多夫定胆固醇酯，嘌呤类似物选自恩替卡韦、巯嘌呤、磺巯嘌呤钠，呋喃类选自呋喃唑酮、呋喃妥英、呋喃丙胺，非留体抗炎药选自尼美舒利、布洛芬、吲哚美辛、萘普生、双氯芬酸(钠)、美洛昔康，五环三萜类化合物选自齐墩果酸、甘草酸、乌苏酸、桦木酸、23-羟基桦木酸，非黄酮类多酚类化合物选自白藜芦醇，生物碱类选自高三尖酯碱，阿糖腺苷类似物选自阿德福韦酯，沙坦类选自坎地沙坦、氯沙坦、缬沙坦、依普罗沙坦、缬沙坦苄酯、坎地沙坦、坎地沙坦乙酯、洛沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、替米沙坦、阿齐沙坦，有机碘化合物选自胺碘酮，烷基酚类选自丙泊酚，其他选自马洛替酯、去甲斑蝥素、环扁桃酯。
9.权利要求1所述的胆固醇-泊洛沙姆-胆固醇三嵌段共聚物作为药物制剂载体的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于制剂为液体制剂、固体制剂或半固体制剂，所述的制剂选自胶束、脂质体、乳剂、纳米粒、固体分散体、颗粒剂、胶囊剂、片剂、栓剂、凝胶剂或液体微粒制剂的干燥品。
【文档编号】A61K45/00GK104163915SQ201310181525
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年5月16日 优先权日:2013年5月16日
【发明者】邓意辉, 宋艳志, 刘欣荣, 田清菁, 隋月, 蒋宫平, 佘振南, 程晓波 申请人:沈阳药科大学