一种分步制备甘草抗氧化物、甘草酸、甘草多糖的方法
【专利摘要】本发明提供了一种分步制备甘草抗氧化物、甘草酸及甘草多糖的方法。本发明通过分步提取，利用不同提取技术的特点，综合提取了甘草中的多种有效成分甘草酸、甘草多糖、甘草抗氧化物。本发明提供的方法充分利用了甘草资源，在提取的过程中实现了不同有效组分的分离，成本较低，操作简易，生产效率高，对环境无污染，能实现连续化生产，而且得的产品品质佳，易于推广和利用，为甘草的综合利用提供了一条新途径，提高了中草药的综合利用价值。
【专利说明】一种分步制备甘草抗氧化物、甘草酸、甘草多糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中草药综合利用【技术领域】，具体涉及一种甘草提取物及其制备方法。【背景技术】[0002]甘草(Glycyrrhizauralensis)别名甜草根、红甘草、国老、甜草、甜根子等,是我国传统常用中草药之一，为豆科(Leguminosae)甘草属(GlycyrrhizaLinn)多年生草本植物。甘草性平味甘，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效，具有极广的临床应用价值。在我国，甘草是2000多种草药中用量最大的一味草药，素有“十方九草，无草不成方”之说。同时，甘草还是迄今为止发现的最好的一种天然甜味剂。甘草广泛分布于北纬30-55°之间，北纬40°左右的干旱、半干旱区域，被称做“甘草分布带”，主要产地在中亚、北美及东欧，尤以中亚及地中海沿岸为分布中心。甘草在我国集中分布于三北地区(东北、华北和西北各省区)，以新疆、内蒙古、宁夏和甘肃为中心产区。
[0003]药用甘草质量与其化学成分的组成、积累变化有直接的关系。先后从甘草属植物中提取、分离、鉴定了 200多种化学成分，其中最重要并已证实具有生物活性的成分主要是甘草酸等三萜皂苷类、黄酮类、香豆素类、多糖、生物碱、氨基酸等。药理研究表明，甘草酸及甘草次酸具有解毒、消炎、镇痛、抗肿瘤的作用。近年来，甘草还用于防治病毒性肝炎、癌症以及艾滋病等。甘草甜素具有糖药一体化的特点。除药用价值外，甘草在食品、饮料、卷烟、化妆品等工业中有着重要的作用。
[0004]我国是甘草生产大国，出口三十多个国家和地区，仅日本年需求量就达I万吨之多。但对甘草主要有效成分甘草酸的生物合成、作用机制、精制加工和综合利用的深入研究还落后于日本等国。受技术条件和工艺限制，应用传统方法提取的甘草酸粗品的纯度低，在国际市场上的价格低，并且提取效率也低，对甘草资源的利用不充分，影响了我国甘草产业的发展。
[0005]目前，甘草制品多为甘草酸、甘草黄酮、多糖的初级提取物，而对于甘草的深加工却很少，现有的文献资料中没有关于甘草抗氧化物的甘草制品。中国专利(CN 1827613A)公开了从甘草中分离甘草黄酮的方法，利用有机试剂对甘草浸提液进行萃取，在经过浓缩得到粗黄酮。此法有一定的溶解残留的可能，存在潜在的安全问题。中国专利(CN101525391 A)公开了提取甘草多糖的方法，通过对甘草进行脱脂、提取、醇沉、脱蛋白、透析、干燥，制备了甘草多糖。但是其大量用到有机试剂，并且过程繁琐不易操作。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的是提供一种分步制备甘草抗氧化物、甘草酸及甘草多糖的方法。
[0007]本发明提供的一种分步制备甘草抗氧化物、甘草酸、甘草多糖的方法，包括下述步骤 I)-8):
[0008]I)将甘草粉粹；[0009]2)将步骤I)粉碎的甘草与水混合后，热水浸提步骤I)粉碎的甘草；浸提后过滤得到粗滤液I，滤渣备用；
[0010]3)步骤2)的滤渣用亚临界水浸提，得到浸提液II ；
[0011]4)步骤2)的粗滤液I离心后，得澄清液I，将澄清液I浓缩后，所得浓缩液进行多次醇沉处理，每次醇沉处理后，将所得的醇沉液离心，合并每次离心所得的上清液得到合并液I，收集最终沉淀，得到沉淀I ;
[0012]5)步骤3)得到的浸提液II冷却至室温后离心，上清液保留待用，沉淀用乙醇复溶；复溶溶液再一次进行离心，并将两次离心上清液合并得合并液II ；
[0013]6)将步骤4)所得的合并液I和步骤5)所得的合并液II，分别通过膜过滤进行精滤处理，分别得到膜滤液I和膜滤液II ；
[0014]7)将步骤6)所得的膜滤液1、膜滤液II分别浓缩，分别得浓缩液1、浓缩液II ；
[0015]8)将步骤4)所得的沉淀I干燥后即得甘草多糖；将步骤7)所得的浓缩液I干燥后即得甘草酸；浓缩液II干燥后即得甘草抗氧化物。
[0016]所述方法中，所述步骤I)制备得到的甘草粉碎颗粒的平均粒径为178-420 μ m ;优选 178 μ m、250 μ m 或 420 μ m。
[0017]所述方法中，所述步骤2)中，所述热水浸提的条件为:浸提温度为70-90°C，料液比为1:10-1:25，浸提次数为1-2次，每次浸提时间为2-5h ;优选的，浸提温度为70°C、80°C或90°C，料液比为1:10-1:20，浸提次数为I次或2次，每次浸提时间为2.5_5h ;再优选，料液比为1:10或1:20,每次浸提时间为2.5h或5h。
[0018]所述料液比为质量体积比,质量的单位以g计，体积的单位以ml计。
[0019]所述步骤2)中，所述过滤采用200目滤布过滤。
[0020]所述方法中，所述步骤3)中，所述亚临界水浸提的条件为:浸提压力为6MPa，浸提温度为120-200°C，料液比为1:20-1:30，浸提次数为I次，每次浸提时间为30_60min ;优选的，浸提温度为140-200°C，料液比为1:20或1:30，每次浸提时间为30min、45min或60min ；再优选的，浸提温度为140°C、160°C、180°C或200°C。
[0021]所述料液比均为质量体积比，质量的单位以g计，体积的单位以ml计。
[0022]所述步骤3)中，所述浸提过程是在无氧环境中进行的；具体的，所述所述浸提过程是在惰性气体保护下进行的；所述惰性气体具体为氮气。
[0023]所述方法中，所述步骤4)中，所述醇沉处理过程包括:加入体积百分含量为95%的乙醇水溶液，使得溶液乙醇终浓度达到体积百分含量65%以上，4°C静置过夜；优选的，乙醇终浓度达到体积百分含量65%、75%、85%或90%。
[0024]所述步骤4)中，所述多次醇沉处理具体为2-3次；优选2次或3次。
[0025]所述步骤4)中，所述粗滤液I离心的条件为:转速4200r/min,时间20min。
[0026]所述步骤4)中，所述澄清液I浓缩的条件为:≥45°C，0.08Mpa。
[0027]所述方法中，所述步骤5)中，所述乙醇复溶中，乙醇的浓度为体积百分含量30-50%，溶剂为水；优选的，所述乙醇复溶中，乙醇的浓度为体积百分含量为30%、40%或50%。
[0028]所述步骤5)中，所述乙醇复溶中，使用的乙醇水溶液的体积为20ml。
[0029]所述步骤5)中，所述浸提液II冷却至室温后离心，离心条件为:转速4200r/min，离心IOrnin0
[0030]所述方法中，所述合并液I膜过滤的条件为:采用截留分子量10KD-20KD)的聚丙烯纤维膜，进料压力1-1.3Mpa，进料温度为25°C -40°C ;优选的，采用截留分子量IOKD或20KD的聚丙烯纤维膜，进料压力IMpa，进料温度为25°C、30°C、35°C或40°C ；
[0031]所述合并液II膜过滤的条件为:采用截留分子量6000-10000Da的聚丙烯纤维膜，进料压力0.6-1.0Mpa，温度为20-30°C;优选的，采用截留分子量6000Da或IOOOODa的聚丙烯纤维膜，进料压力0.6Mpa、0.8Mpa或1.0Mpa，温度为20°C、25°C或30°C。
[0032]所述方法中，所述步骤7)中，所述膜滤液1、II的浓缩过程包括:采用反渗透或真空蒸发器进行浓缩处理，反渗透浓缩使用截留分子量300-800Da的醋酸纤维素膜；真空蒸发器浓缩的条件为:浓缩温度为40-50°C，真空度为0.07-0.08MPa ;浓缩至可溶性固形物含量达到25-40Brix ;优选的，反渗透浓缩使用截留分子量300Da或800Da的醋酸纤维素膜；真空蒸发器浓缩的条件为:浓缩温度为40或50°C，真空度为0.07或0.08MPa ;浓缩至可溶性固形物含量达到25、30、35、40Brix。
[0033]所述方法中，所述步骤8)中，所述沉淀I干燥的过程包括:采用真空冷冻干燥工艺进行干燥处理，真空度为0.014MPa，冷阱温度为-40°C -60°C，干燥时间为20_30h ;优选的，所述冷阱温度为-40°C、-50°C或_60°C，所述干燥时间为20、25或30h。
[0034]所述浓缩液I和浓缩液II干燥的过程包括:采用喷雾干燥工艺进行干燥处理，喷雾干燥进口温度160-200°C，出口温度80-85°C ;优选的，所述喷雾干燥进口温度160°C、180°C或 200°C，出口温度 80°C或 85°C。
[0035]本发明的另一个目的是提供上述任一所述方法制备得到的甘草抗氧化物或甘草 多糖。
[0036]本发明的还一个目的是提供上述任一所述方法制备得到的甘草抗氧化物作为抗氧化剂和/或在制备具有抗氧化作用的产品中的用。
[0037]本发明的再一个目的是提供上述任一所述方法制备得到的甘草多糖作为功能因子在制备食品和/或保健品中的应用。
[0038]本发明通过分步提取，利用不同提取技术的特点，综合提取了甘草中的多种有效成分(甘草酸、甘草多糖、甘草黄酮)。本发明提供的方法充分利用了甘草资源，在提取的过程中实现了不同有效组分的分离，成本较低，操作简易，生产效率高，对环境无污染，能实现连续化生产，而且得的产品品质佳，易于推广和利用，为甘草的综合利用提供了一条新途径，提高了中草药的综合利用价值。本发明制备的甘草酸含量大于65% (质量百分含量)，甘草多糖含量大于30% (质量百分含量)，甘草抗氧化物清除DPPH.自由基能力0.08mmolTrolox当量/g(mmol TE/g),清除ABTS.+自由基0.1mmol TE/g。本发明制备的产品可以进一步用作食品、保健品的生产加工，也可以作为食品工业、制药工业的原料。本发明制备的一系列甘草提取物，不但可以作为速溶粉直接冲调，还可以作为功能因子添加在食品、保健品中，也可直接作为食品工业、制药工业的原料，从而实现了对甘草的深加工，扩大了其应用范围，提高了其附加值。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为甘草中甘草抗氧化物、甘草酸、甘草多糖的分步制备流程图。[0040]图2为甘草浸提液II的紫外全波段扫描图。
[0041]图3为所得黄酮的标准曲线。
[0042]图4为所得多酚的标准曲线。
[0043]图5为浸提液I和甘草酸标准品的液相色谱图。
[0044]图6为所得甘草酸的标准曲线。
[0045]图7为所得甘草多糖的标准曲线。
【具体实施方式】
[0046]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0047]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0048]实施例1、甘草中甘草抗氧化物、甘草酸、甘草多糖的分步制备
[0049](一)分步制备方法
[0050]甘草中甘草抗氧化物、甘草酸、甘草多糖的分步制备流程图见图1，具体步骤如下所述:
[0051]I)原料的预处理:将甘草予以筛选(剔除霉变原料)，去除各种杂质，然后用水洗净、去除灰尘，干燥，粉粹后过60目筛，所得甘草粉碎颗粒的平均粒径为250 μ m。
[0052]2)热水浸提处理:取步骤I)制备的粉碎甘草50g，按料液比为1:10 (即Ig甘草原料:IOmL水)混合，进行热水浸提处理，浸提次数为I次，浸提时间为5h，浸提温度为70°C，收集得到浸提液I，通过200目滤布过滤得到粗滤液I，滤渣备用。
[0053]3)甘草渣的亚临界水萃取处理:步骤2)的滤渣用亚临界水浸提，浸提压力6MPa，浸提温度为140°C料液比为1:20 (Ig渣:20mL水)，浸提次数为I次，浸提时间为60min，所述浸提过程是在氮气保护下进行的；浸提完收集得到浸提液II。
[0054]4)醇沉处理:将粗滤液I经过离心处理，转速4200r/min，时间20min得到澄清液I，澄清液I于< 45°C，于0.0SMpa进行浓缩至可溶性固形物含量达到lOBrix，浓缩液进行醇沉处理。通过向上述浓缩液添加95% (体积百分比)乙醇，使乙醇终浓度达到65% (体积百分比)，低温4°C静置过夜。将醇沉液进行离心，上清液保留待用，湿渣(即沉淀)加入湿渣质量2倍量的水复溶，再一次进行醇沉处理；醇沉处理次数共为2次，达到粗多糖的纯化，最后，将每一次醇沉上清液合并得到合并液I，收集最终沉淀I。
[0055]5)澄清处理:将浸提液II冷却至室温后进行离心，转速4200r/min，离心lOmin。离心上清液保留待用，沉淀用20mL体积百分比30%的乙醇水溶液乙醇复溶。复溶溶液再一次进行离心，并将两次离心上清液合并得合并液II。
[0056]6)精滤处理:将合并液1、合并液II，分别通过膜过滤进行精滤处理，以除去其中细微颗粒，合并液I通过截留分子量IOKD的聚丙烯纤维膜，进料压力IMpa，进料温度为25°C，得到膜滤液I。合并液II通过采用截留分子量6000Da的聚丙烯纤维膜，进料压力
0.6Mpa，进料温度为20°C，得到膜滤液 II。
[0057]7)浓缩处理:将膜滤液1、膜滤液II均采用反渗透(醋酸纤维素膜)进行浓缩处理；反渗透浓缩采用截留分子量300Da的醋酸纤维素膜，浓缩至可溶性固形物含量均达到25Brix,分别得到浓缩液1、II。
[0058]8)干燥处理:将沉淀I采用真空冷冻干燥技术进行干燥，真空度为0.014MPa,冷阱温度为-40°C，干燥时间为20h，得到甘草多糖。将浓缩液1、II分别采用喷雾干燥工艺对其进行干燥处理，喷雾干燥进口温度160°C，出口温度80°C，即分别得到甘草酸和甘草抗氧化物。
[0059](二)产品验证、得率及各活性组分含量
[0060]I)甘草抗氧化物产品验证及各活性组分含量测定方法
[0061]将甘草浸提液II用体积百分比50%乙醇-水溶液适当稀释，于紫外-分光光度计分析，紫外全波段扫描结果见图2。图2结果显示，甘草浸提液II在300~400nm之间和240~280nm之间各出现了一个吸收带，说明甘草浸提液II中含有黄酮、多酚类的甘草抗氧化物。
[0062]甘草抗氧化物中黄酮含量的测定方法使用亚硝酸钠-氢氧化钠比色法(以芦丁计)，所得标准曲线见图3。
[0063]甘草抗氧化物中多酚含量的测定方法使用福林酚比色法(以没食子酸计)，所得标准曲线见图4。
[0064]2)甘草酸的验证及含量测定方法
[0065]甘草酸的验证采用高效液相法，具体为将浸提液I的高效液相分析结果同甘草酸标准品的高效液相分析结果进行比对。甘草酸标准品的高效液相分析结果见图5a，浸提液I的高效液相分析结果见图5b，通过图5a与图5b的结果比对可知，浸提液I中含有甘草酸。
[0066]甘草酸含量的测定方法参照国标GB/T22248-2008，所得标准曲线见图6。
[0067]3)甘草多糖的验证及含量测定方法
[0068]甘草多糖的验证及含量测定方法采用苯酚-硫酸比色法(以葡萄糖计)，所得标准曲线见图7。
[0069]上述甘草抗氧化物、甘草酸、甘草多糖的得率计算公式为:
[0070]得率(%)=cXvXn/mX 100(c:由标准曲线得到的浓度；v:提取液体积；m:原料质量；η:稀释倍数)
[0071]上述各活性组分含量测定计算结果显示，通过上述方法制备得到的甘草多糖得率为14.0%，含量32.2g/100g ;甘草酸得率为3.0%，含量为68.lg/100g ;甘草抗氧化物得率为
5.8%，其中含有黄酮 23.5g/100g,多酚 24.7g/100g。
[0072](三)甘草抗氧化物的生物活性检测
[0073]抗氧化性评价方法是通过测定清除DPPH、ABTS自由基能力的能力。样品的清除能力与Trolox清除自由基的能力进行对比,确定其抗氧化活性，以Trolox当量表示(mmolTE/g)。自由基清除率可用下列公式表示:AQ-At/AQX 100%。
[0074]上述制备的甘草抗氧化物的抗氧化性即清除DPPH.、ABTS.+的能力分别为
0.093mmol TE/g, 0.136mmol TE/g。
[0075]实施例2-4、甘草中甘草抗氧化物、甘草酸、甘草多糖的分步制备
[0076](一)分步制备方法
[0077]实施例2-4的甘草中甘草抗氧化物、甘草酸、甘草多糖的分步制备方法同实施例1，其中步骤I) -8)中， 不同之处见表1。
[0078]表1
【权利要求】
1.一种分步制备甘草抗氧化物、甘草酸、甘草多糖的方法，包括下述步骤I)-8): 1)将甘草粉粹； 2)将步骤I)粉碎的甘草与水混合后，热水浸提步骤I)粉碎的甘草；浸提后过滤得到粗滤液I，滤渣备用； 3)步骤2)的滤渣用亚临界水浸提，得到浸提液II； 4)步骤2)的粗滤液I离心后，得澄清液I，将澄清液I浓缩后，所得浓缩液进行多次醇沉处理，每次醇沉处理后，将所得的醇沉液离心，合并每次离心所得的上清液得到合并液I，收集最终沉淀，得到沉淀I ; 5)步骤3)得到的浸提液II冷却至室温后离心，上清液保留待用，沉淀用乙醇复溶；复溶溶液再一次进行离心，并将两次离心上清液合并得合并液II ； 6)将步骤4)所得的合并液I和步骤5)所得的合并液II，分别通过膜过滤进行精滤处理，分别得到膜滤液I和膜滤液II ； 7)将步骤6)所得的膜滤液1、膜滤液II分别浓缩，分别得浓缩液1、浓缩液II； 8)将步骤4)所得的沉淀I干燥后即得甘草多糖；将步骤7)所得的浓缩液I干燥后即得甘草酸；浓缩液II干燥后即得甘草抗氧化物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤I)制备得到的甘草粉碎颗粒的平均粒径为 178-420 μ m ;优选 178 μ m、250 μ m 或 420 μ m。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述步骤2)中，所述热水浸提的条件为:浸提温度为70-90°C，料液比为1:10-1:25，浸提次数为1_2次，每次浸提时间为2_5h ；优选的，浸提温度为70°C、80°C或90°C，料液比为1:10-1:20，浸提次数为I次或2次，每次浸提时间为2.5-5h ;再优选，料液比为1:10或1:20，每次浸提时间为2.5h或5h。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于:所述步骤3)中，所述亚临界水浸提的条件为:浸提压力为6MPa，浸提 温度为120-200°C，料液比为1:20_1:30，浸提次数为I次，每次浸提时间为30-60min ;优选的，浸提温度为140-200°C，料液比为1:20或1:30，每次浸提时间为30min、45min或60min ;再优选的，浸提温度为140°C、160°C、180°C或200°C。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:所述步骤4)中，所述醇沉处理过程包括:加入体积百分含量为95%的乙醇水溶液，使得溶液乙醇终浓度达到体积百分含量65%以上，4°C静置过夜；优选的，乙醇终浓度达到体积百分含量65%、75%、85%或90%。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于:所述步骤5)中，所述乙醇复溶中，乙醇的浓度为体积百分含量30-50%，溶剂为水；优选的，所述乙醇复溶中，乙醇的浓度为体积百分含量为30%、40%或50%。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于:所述步骤6)中，所述合并液I膜过滤的条件为:采用截留分子量10KD-20KD)的聚丙烯纤维膜，进料压力1-1.3Mpa，进料温度为25°C -40°C ;优选的，采用截留分子量IOKD或20KD的聚丙烯纤维膜，进料压力IMpa，进料温度为 25°C、30°C、35°C*40°C ； 所述合并液II膜过滤的条件为:采用截留分子量6000-10000Da的聚丙烯纤维膜，进料压力0.6-1.0Mpa，温度为20-30°C;优选的，采用截留分子量6000Da或IOOOODa的聚丙烯纤维膜，进料压力 0.6Mpa、0.8Mpa 或 1.0Mpa，温度为 20°C、25°C或 30。。。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于:所述步骤7)中，所述膜滤液1、II的浓缩过程包括:采用反渗透或真空蒸发器进行浓缩处理，反渗透浓缩使用截留分子量300-800Da的醋酸纤维素膜；真空蒸发器浓缩的条件为:浓缩温度为40_50°C，真空度为.0.07-0.08MPa ;浓缩至可溶性固形物含量达到25_40Brix ;优选的，反渗透浓缩使用截留分子量300Da或SOODa的醋酸纤维素膜；真空蒸发器浓缩的条件为:浓缩温度为40或50°C，真空度为0.07或0.08MPa ;浓缩至可溶性固形物含量达到25、30、35或40Brix。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于:所述步骤8)中，所述沉淀I干燥的过程包括:采用真空冷冻干燥工艺进行干燥处理，真空度为0.014MPa，冷阱温度为-40°C -60°C，干燥时间为20-30h ;优选的，所述冷阱温度为_40°C、_50°C或_60°C，所述干燥时间为20、25或30h。 所述浓缩液I和浓缩液II干燥的过程包括:采用喷雾干燥工艺进行干燥处理，喷雾干燥进口温度160-200°C，出口温度80-85°C ;优选的，所述喷雾干燥进口温度160°C、180°C或200°C，出口温度 80°C或 85°C。
10.权利要求1-9任一所述方法制备得到的甘草抗氧化物或甘草多糖； 或，权利要求1-9任一所述方法制备得到的甘草抗氧化物作为抗氧化剂和/或在制备具有抗氧化作用的产品中的用途； 或，权利要求1-9任一所述方法制备得到的甘草多糖作为功能因子在制备食品和/或保健品中的应用。。
【文档编号】A61P39/06GK103463178SQ201310397727
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月4日 优先权日:2013年8月23日
【发明者】高彦祥, 樊蕊 申请人:中国农业大学