一种多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～1000nm。该多聚体白蛋白纳米球是一种安全、稳定的生物相容性纳米载体，可以包裹药物或者造影剂等目标投递物，且其储存稳定性高，有利于长时间有效、稳定地释放目标投递物；此外，该多聚体白蛋白纳米球的粒径小，且尺寸均一，分散性好；本发明还提供了该多聚体白蛋白纳米球的制备方法及应用。
【专利说明】一种多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及一种多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]纳米技术的兴起使得基于高分子纳米微粒的药物输送得到了广泛的关注，白蛋白具有可生物降解、无毒、无抗原性等诸多特点，被认为是一个理想的药物载体。而通常单个白蛋白质分子的尺寸在几个纳米以内，不适合直接用于载药，超声乳化法和去溶剂法可制得粒径小于Iym的白蛋白纳米球，可用于运载药物，但由于白蛋白分子的水溶性高，该类方法制得的白蛋白纳米球载体的释药性能不易于控制，如何使白蛋白纳米颗粒在水中有良好的稳定性，且在稀释条件下不溶解是目前制备技术上的难点。
[0003]戊二醛等交联剂常被用来稳定得到的纳米球，但戊二醛会非选择性的结合白蛋白表面的氨基位点，在生物体内会释放出醛类残基，对生物体有着显著毒副作用。因此，有必要提供一种制备安全、稳定性高的白蛋白纳米球的方法。
【发明内容】
[0004]为解决上述问题，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球，该多聚体白蛋白纳米球包括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，在稀释条件下有较高的稳定性；此外，该多聚体白蛋白纳米球的粒径为10~lOOOnm，且其尺寸均一，分散性好，是运载药物或造影剂等目标投递物的良好载体，有利于在患者体内长时间有效、安全、稳定地释放投递物；本发明还提供了一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法和应用。
`[0005]第一方面，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10~lOOOnm。
[0006]优选地，所述含巯基或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。
[0007]优选地，所述多聚体白蛋白纳米球中包裹有目标投递物。
[0008]进一步优选地，所述目标投递物为抗癌药物和造影剂中的至少一种。
[0009]进一步优选地，所述抗癌药物为钼及钼的配合物、5 β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯_2_苯甲酸酯-13 [ (2’ R，3’ S) -N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯](紫杉醇)、(7S:9S) -9-羟乙酰基-4-甲氧基 _7，8, 9, 10-四氧-6，7, 9, 11-四羟基-7-0-(2’，3’，6’，- 二去氧-3’ -氣基-a-Ι-来苏已吡喃基)-5，12-萘二酮(阿霉素)、(E，E)-1，7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1，6_庚二烯-3，5-二酮(姜黄素)、4_乙基-4，12-二氧-4-羟-1H-吡喃(3’，4’ ,6,7)吡吲哚(1，2-6)喹啉-3，14- 二酮(喜树碱)、(2S-反式)-18-羧基_20_(羧甲基)-13-乙基-2，3- 二氢3，7，12，17-四甲基-8-乙烯基-21H, 23H-卟吩-2-丙酸(二氢卟吩e6)、IR700碘化物和
11-氯-1，I’- 二正丙基_3，3，3’，3’-四甲基-10，12-三亚甲基吲哚三碳花青碘盐(IR780)中的至少一种。
[0010]进一步优选地，所述造影剂为2，7-双[1，3- 二氢-1，1- 二甲基-3- (4_磺丁基)-1, 3，5-庚三烯单钠盐(吲哚青绿)、对-[(2，4- 二氨基喋啶-6)-N-甲基甲氨基]苯甲酰谷氨酸(甲氨蝶呤)、3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-翁氯化物(美蓝)、6，6’ -[[3，3’ - 二甲基(1，I’- 二苯基)-4，4’-二基]双(偶氮基)]双(4-氨基-5-羟基-1，3-萘二磺酸)四钠盐(伊文思蓝)、2_((4_ 二乙氨基)苯)(4_( 二乙氨基)环己烧_2，5- 二烯)甲烧)苯基-1，4-二磺酸盐(异硫蓝)、4，4’_双(二乙氨基)三苯脱水甲醇_2”，4”-二磺酸单钠(专利蓝)和金属纳米粒子中的至少一种。
[0011]由于白蛋白单体分子易溶性，物理方法团聚的白蛋白纳米球容易解体，纳米球中包裹的药物很容易被过早地释放，不利于药物等目标投递物在人体循环系统内的运输，即物理方法团聚的白蛋白纳米球载体的释药性能的可控性不高，而本发明提供的多聚体白蛋白纳米球由多个白蛋白单体分子通过分子间的二硫键相互连接，这种化学键稳定的多聚体结构比通过物理方法聚集的蛋白纳米球更稳定，不易被人体体液稀释、溶解而解体，有助于保证靶向部位足够的给药浓度。
[0012]在生物医学应用中，纳米粒子药物的粒径比较重要，不同的粒径代谢路径也不一样，小粒径通过肾代谢，大粒径通过肝代谢；其中，20~200nm的粒子对肿瘤有被动靶向作用，在此粒径范围内的纳米粒子药物可以消除在药物本身的尺寸大小引起的一些生物医学效应，从而影响疗效。
[0013]此外，纳米粒子药物的分散性是比较重要的，分散性不好，粒子容易团聚，甚至沉淀，导致应用较为困难，特别是其生物医学应用，分散性尤其重要。
[0014]本发明提供的多聚体白蛋白纳米球粒径小且尺寸均一，分散性好，用该纳米球包括投递药物在生物医学应用有较大优势，有利于纳米球通过EPR效应进入肿瘤内部并通过gp60同路祀向到肿瘤细胞。
[0015]另外，一般自由蛋白质分子的分子量大都小于60KDa，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球由多个蛋白质单体分子聚集而成，分子量高于60KDa，不易被肾小球滤过(由于肾小球的滤过作用下，一般分子量小于60KDa的蛋白质分子会在代谢的过程中被清除掉，而不能达到靶向位置)，能提高药物等目标投递物的投递效率。
[0016]第二方面，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤:
[0017](I)制备体积质量浓度为0.01~300mg/mL的含巯基的白蛋白水溶液，并调节所述白蛋白水溶液的PH值为7~12 ;
[0018](2)向步骤(1)所得的所述pH值为7~12的白蛋白混合液中加入带巯基的还原剂得反应液，然后在O~60°C下轻轻摇动反应0.05~12小时，在所述反应液中，所述带巯基的还原剂的摩尔数为白蛋白摩尔数的10~5000倍；
[0019](3)将步骤(2)反应后的溶液在O~60°C的条件下进行超声，所述超声的功率范围为I~100KW，同时在搅拌的条件下在所述进行超声的溶液中以0.01~1000ml/s的速度加入有机溶剂得到微乳溶液，所述微乳溶液在O~60°C的条件下反应5~240min后，静置分层，然后去除有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液，其中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤(2)反应后的溶液的2~100倍；
[0020](4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在O~60°C以及pH值为7~12的条件下进行透析，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；
[0021](5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥脱水处理，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10~lOOOnm。
[0022]优选地，所述步骤(1)中，所述含巯基或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。
[0023]优选地，所述步骤(1)中，所述白蛋白水溶液中含有体积分数为5%~50%的二甲基亚讽。
[0024]本发明采用的DMSO能提高药物或造影剂在溶液中的溶解度，使药物或造影剂充分溶解均匀。
[0025]优选地，所述步骤(1)中，所述白蛋白水溶液中含有目标投递物，所述目标投递物的质量为所述白蛋白质量的0.0002~0.5倍。
[0026]进一步优选地，所述目标投递物为抗癌药物和造影剂中的至少一种。
[0027]进一步优选地，所述抗癌药物为钼及钼的类似物、紫杉醇、阿霉素、姜黄素、喜树碱、二氢卟吩e6、IR700碘化物和IR780中的至少一种。
[0028]进一步优选地，所述造影剂为吲哚青绿、甲氨蝶呤、美蓝、伊文思蓝、异硫蓝、专利蓝和金属纳米粒子中的至少一种。
[0029]本发明采用的DMSO还能提高目标投递物(如药物或造影剂)在溶液中的溶解度，使目标投递物与蛋白质充分溶解并混合均匀，且目标投递物与白蛋白分子可以充分接触，为下一步超声过程中白蛋白包裹目标投递物做准备。
[0030]优选地，所述步骤(2)中，所述带巯基的还原剂为谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙醇或
二硫苏糖醇。
[0031]优选地，所述步骤(3)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇或叔丁醇中的至少一种。
[0032]进一步优选地，所述有机溶剂中还含有三氯甲烷、二氯甲烷或正己烷中的至少一种。
[0033]优选地，所述步骤(4)中，所述进行透析的方法为:先将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液置于PH值为7~12的PBS缓冲液中透析10~300小时，然后在双蒸水内透析12小时，得到含多聚体白蛋白纳米球的溶液。
[0034]本发明采用pH值为7~12的PBS缓冲液进行透析，一方面可以去除多聚体白蛋白纳米球的悬浊液中的无机小分子等杂质，另一方面，在碱性条件下，某些存在于多聚体白蛋白纳米球之间的巯基断开，然后和各自纳米球中的蛋白质分子形成新的巯基，从而使得聚集的多聚体白蛋白纳米球分离，达到分散多聚体白蛋白纳米球的目的，进而形成单个的分散的多聚体白蛋白纳米球。
[0035]优选地，所述步骤(5)中，其特征在于，所述多聚体白蛋白纳米球中包裹有目标投递物。
[0036]优选地，所述对步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥脱水处理的方式为:将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负O~20°C下预冻I~48小时后转移至负20~80°C下冷冻2~48小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥12~120小时。
[0037]本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的制备方法，采用了边超声边将有机溶剂(乙醇或含氯仿等非极性溶剂的乙醇)注入白蛋白溶液的超声乳化-去溶剂法的方式制备纳米球，一方面，乙醇等有机溶剂注入白蛋白溶液时能将蛋白质分子析出，与此同时，白蛋白分子间因二硫键的形成而聚集形成多聚体白蛋白纳米球。另一方面，控制好超声功率的大小和乙醇等有机溶剂的注入速度，可以控制所制备的多聚体白蛋白纳米球的粒径。这是因为，当超声功率的大，乙醇等有机溶剂的注入速度大，所得的多聚体白蛋白纳米球的粒径就小；反之，当超声功率的小，乙醇等有机溶剂的注入速度小，所得的多聚体白蛋白纳米球的粒径就大。因此，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的制备方法不但能获得多聚体白蛋白纳米球，而且能得到粒径可控的多聚体白蛋白纳米球，本发明提供的方法可以制备出粒径在10~1000nm之间的多聚体白蛋白纳米球。
[0038]此外，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的制备方法，将白蛋白水溶液和目标投递物先充分混合，使得白蛋白在包裹目标投递物之间就与目标投递物充分接触，能提高白蛋白包裹目标投递物的效率。
[0039]第三方面，本发明提供了如第一方面所述的多聚体白蛋白纳米球或如第二方面所述的多聚体白蛋白纳米球的制备方法在制备预防、治疗或诊断癌症的药物中的应用。
[0040]本发明提供了的多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用具有如下有益效果:
[0041](I)本发明提供的多聚体白蛋白纳米球由不同的白蛋白分子通过分子之间二硫键相互连接形成纳米球团，在水、磷酸盐缓冲液、乙醇、血清、培养基等溶剂稀释条件下，比物理结合的白蛋白载体具有更高的稳定性；
[0042](2)与使用化学交联剂如戊二醛等稳定的白蛋白载体相比，本发明提供的白蛋白纳米球采用了蛋白质分子本身的二硫键来获得稳定的纳米球，因此本分明提供的白蛋白纳米球更加安全；`
[0043](3)本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的粒径为10~lOOOnm，且其尺寸均一，分散性好，是运载药物或造影剂等目标投递物的良好载体，有利于在患者体内长时间有效、安全、稳定地释放投递物；
[0044](4)本发明提供的多聚体白蛋白纳米球可用于制备预防、治疗或诊断癌症的药物。【专利附图】
【附图说明】
[0045]图1为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球的扫描电子显微镜图像；
[0046]图2为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球在不同溶剂中的稀释实验；
[0047]图3为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球在还原型条件下溶解实验。
【具体实施方式】
[0048]以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
[0049]实施例一[0050]—种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤:
[0051](1)取ImL体积质量浓度为0.01 (w/v, mg/mL)的吲哚青绿的二甲基亚砜溶液和ImL体积质量浓度为0.02 (w/v, mg/mL)的牛血清白蛋白混合,得到白蛋白混合液,然后采用0.lmol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合液的pH值到7 ；
[0052](2)向步骤(1)所得的所述pH值为7的白蛋白混合液中加入谷胱甘肽得反应液，然后在o°c下轻轻摇动反应I小时，在所述反应液中，所述谷胱甘肽的摩尔数为白蛋白摩尔数的10倍；
[0053](3)将步骤(2)反应后的溶液在0°C的条件下进行超声，超声功率为100KW，同时在所述进行超声的溶液中以1000mL/S的速度注入的4mL无水乙醇得到微乳溶液，所述微乳溶液在0°C的条件下反应5min后，静置待微乳溶液分层后除去有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
[0054](4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为(TC的条件下，将透析袋置于5L pH为10的PBS缓冲液内透析10小时，期间每12个小时换液I次，每次都采用5L pH为10的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析I小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；
[0055](5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20°C下预冻2小时后转移至负80°C下冷冻12小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥12小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10~lOOnm。
[0056]为充分说明本发明实施例制备的多聚体白蛋白纳米球的有益效果，本实施例还提供了该多聚体白蛋白纳米球的扫描电子显微镜图像，如图1所示，图1为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球的扫描电子显微镜图像，由该图像可知，本实施例制备的多聚体白蛋白纳米球尺寸均一，颗粒较为分散。
[0057]此外，本实施例还提供了该多聚体白蛋白纳米球在不同溶剂中的稀释实验，具体操作为:将该多聚体白蛋白纳米球溶液分别溶解在磷酸盐缓冲液(pH为7.4)、血清(pH为7.4)和细胞培养基(pH为7.4)中，随后在不同的时间点取样观察该多聚体白蛋白纳米球的粒径，结果如图2所示。
[0058]图2为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球在不同溶剂中的稀释实验，由图2可知:该多聚体白蛋白纳米球在磷酸盐缓冲液、血清和细胞培养基中的粒径随时间变化不明显，即本发明提供的多聚体白蛋白纳米球能在接近生理条件下的稀释实验中稳定存在，具有医学应用前景。
[0059]其次，本实施例还提供了该多聚体白蛋白纳米球在还原型条件下的溶解实验，具体操作为:将该多聚体白蛋白纳米球溶液分别溶解在浓度为20mM的二硫苏糖醇，2小时，8小时和24小时后，分别跑SDS-PAGE电泳，检测该多聚体白蛋白纳米球在还原型条件下的溶解规律，其中，a、b、c泳道分别对应多聚体白蛋白纳米球在还原2小时、8小时、24小时后的样品，d泳道为白蛋白单体分子的对照，结果如图3所示。
[0060]图3为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球在还原型条件下溶解实验，由图3可知，框I中的条带为本实施例制备的多聚体白蛋白纳米球，框2中的条带为组成该多聚体白蛋白纳米球的白蛋白低聚物的条带，框3中的条带为组成该多聚体白蛋白纳米球的白蛋白二聚体和三聚体的条带，框4中的条带为组成该多聚体白蛋白纳米球的白蛋白单分子的条带；该结果显示，即白蛋白二聚体和三聚体对应的框3中的条带浓度随还原时间的延长而升高，此外，蛋白质单体对应的框4中的条带浓度随还原时间的延长也有明显的提高；即本实施例提供的该多聚体白蛋白纳米球可以在还原剂存在的条件下溶解，并随还原时间的延长，其二硫键被还原的程度越高，因此，当采用该多聚体白蛋白纳米球进行药物投递时，可以被细胞中的还原性谷胱甘肽等还原性物质降解，从而释放药物。
[0061]实施例二
[0062]一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤:
[0063](I)取0.1mL体积质量浓度为0.l(w/v，mg/mL)阿霉素的二甲基亚砜溶液和2mL体积质量浓度为315 (w/v,mg/mL)的猪血清白蛋白混合,得到白蛋白混合液,然后采用Imol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合液的pH值到7 ；
[0064](2)向步骤(1)所得的所述pH值为7的白蛋白混合液中加入二硫苏糖醇得反应液，然后在60°C下轻轻摇动反应0.05小时，在所述反应液中，所述二硫苏糖醇的摩尔数为白蛋白摩尔数的5000倍；
[0065](3)将步骤(2)反应后的溶液在60°C的条件下进行超声，超声功率为1KW，同时在所述进行超声的溶液中以0.01ml/s的速度注入的200mL含氯仿的乙醇溶液(氯仿和乙醇的体积比为1:9)得到微乳溶液，所述微乳溶液在60°C的条件下反应20min后，静置待微乳溶液分层后除去有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
[0066](4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为30°C的条件下，将透析袋置于 IL pH为7的PBS缓冲液内透析300小时，期间每12个小时换液I次，每次都采用IL pH为7的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析24小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液，
[0067](5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负0°C下预冻I小时后转移至负20°C下冷冻2小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为900~lOOOnm。
[0068]实施例三
[0069]一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤:
[0070](I)取0.5mL体积质量浓度为0.5(w/v，mg/mL)美篮的二甲基亚砜溶液和1.5mL200(w/v,mg/mL)的重组血清白蛋白混合,得到白蛋白混合液,然后采用2mol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合液的pH值到12 ；
[0071](2)向步骤(1)所得的所述pH值为12的白蛋白混合液中加入巯基乙醇得反应液，然后在30°C下轻轻摇动反应12小时，在所述反应液中，所述β -巯基乙醇的摩尔数为白蛋白摩尔数的100倍；
[0072](3)将步骤(2)反应后的溶液在30°C的条件下进行超声，超声功率为100KW，同时在所述进行超声的溶液中以lOOOml/s的速度注入的IOOmL含氯仿的乙醇溶液(氯仿和乙醇的体积比为1:9)得到微乳溶液，所述微乳溶液在30°C的条件下反应240min后，静置待微乳溶液分层后除去有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
[0073](4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为60°C的条件下，将透析袋置于IL pH为12的PBS缓冲液内透析144小时，每次都采用IL pH为12的PBS缓冲液，期间每12个小时换液I次，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液，
[0074](5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负4°C下预冻48小时后转移至负50°C下冷冻48小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥96小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为100~200nm。
[0075]实施例四
[0076]一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤:
[0077](I)取ImL体积质量浓度为I (w/v，mg/mL)二氢卟吩e6溶液的二甲基亚砜溶液和lmL300 (w/v,mg/mL)的血红蛋白溶液混合,得到白蛋白混合液,然后采用0.5mol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合的PH值到9 ;
[0078](2)向步骤(1)所得的所述pH值为9的白蛋白混合液中加入谷胱甘肽得反应液，然后在60°C下轻轻摇动反应0.05小时，在所述反应液中，所述谷胱甘肽的摩尔数为白蛋白摩尔数的2500倍；
[0079](3)将步骤(2)反应后的溶液在60°C的条件下进行超声，超声功率为10KW，同时在所述进行超声的溶液中以50ml/s的速度注入的22mL含氯仿的乙醇溶液(氯仿和乙醇的体积比为1:9)得到微乳溶液，所述微乳溶液在60°C的条件下反应30min后，静置待微乳溶液分层后除去有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
[0080](4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为60°C的条件下，将透析袋置于IL pH为9的PBS缓冲液内透析36小时，期间每12个小时换液I次，每次都采用IL pH为9的P`BS缓冲液，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析18小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液，
[0081](5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负10°C下预冻24小时后转移至负80°C下冷冻24小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥120小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为600~700nm。
[0082]实施例五
[0083]一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤:
[0084](I)取2mL体积质量浓度为0.01 (w/v，mg/mL)的猪血清白蛋白溶液，然后采用lmol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合液的pH值到7 ；
[0085](2)向步骤(1)所得的所述pH值为7的白蛋白混合液中加入半胱氨酸得反应液，然后在60°C下轻轻摇动反应0.05小时，在所述反应液中，所述半胱氨酸的摩尔数为白蛋白摩尔数的10倍；
[0086](3)将步骤(2)反应后的溶液在60°C的条件下进行超声，超声功率为1KW，同时在所述进行超声的溶液中以50ml/s的速度注入的4mL含氯仿的乙醇溶液(氯仿和乙醇的体积比为1:9)得到微乳溶液，所述微乳溶液在60°C的条件下反应20min后，静置待微乳溶液分层后除去有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
[0087](4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为30°C的条件下，将透析袋置于IL pH为7的PBS缓冲液内透析10小时，期间每12个小时换液I次，每次都采用IL pH为7的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析I小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液，
[0088](5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负0°C下预冻I小时后转移至负20°C下冷冻2小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥12小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为100~200nm。
[0089]实施例六
[0090]一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤:
[0091](I)取2mL300 (w/v, mg/mL)的重组血清白蛋白溶液，然后采用2mol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合液的PH值到12 ；
[0092](2)向步骤(1)所得的所述pH值为12的白蛋白混合液中加入二硫苏糖醇得反应液，然后在30°C下轻轻摇动反应12小时，在所述反应液中，所述二硫苏糖醇的摩尔数为白蛋白摩尔数的5000倍；
[0093](3)将步骤(2)反应后的溶液在30°C的条件下进行超声，超声功率为100KW，同时在所述进行超声的溶液中以lOOOml/s的速度注入的200mL含氯仿的乙醇溶液(氯仿和乙醇的体积比为1:9)得到微乳溶液，所述微乳溶液在30°C的条件下反应240min后，静置待微乳溶液分层后除去有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
[0094](4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为60°C的条件下，将透析袋置于I L pH为12的PBS缓冲液内透析300小时，每次都采用IL pH为12的PBS缓冲液，期间每12个小时换液I次，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析24小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液，
[0095](5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负4°C下预冻48小时后转移至负80°C下冷冻36小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥96小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10~lOOnm。
[0096]实施例七
[0097]一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤:
[0098](I)取2mL150 (w/v, mg/mL)的白蛋白溶液，然后采用2mol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合液的PH值到9 ；
[0099](2)向步骤(1)所得的所述pH值为9的白蛋白混合液中加入β-巯基乙醇得反应液，然后在0°c下轻轻摇动反应17小时，在所述反应液中，所述β-巯基乙醇的摩尔数为白蛋白摩尔数的2500倍；
[0100](3)将步骤(2)反应后的溶液在O°C的条件下进行超声，超声功率为10KW，同时在所述进行超声的溶液中以0.01ml/s的速度注入的IOOmL含氯仿的乙醇溶液(氯仿和乙醇的体积比为1:9)得到微乳溶液，所述微乳溶液在0°C的条件下反应5min后，静置待微乳溶液分层后除去有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
[0101](4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为(TC的条件下，将透析袋置于IL pH为9的PBS缓冲液内透析144小时，每次都采用IL pH为12的PBS缓冲液，期间每12个小时换液I次，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液，
[0102](5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20°C下预冻24小时后转移至负50°C下冷冻48小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥120小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为100~200nm。
[0103]对比实施例一
[0104]一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤:
[0105](I)取2mL0.01 (w/v, mg/mL)的牛血清白蛋白溶液；
[0106](2)向步骤(1)所得的牛血清白蛋白水溶液中加入半胱氨酸得反应液，然后在60°C下轻轻摇动反应0.05小时，在所述反应液中，所述半胱氨酸的摩尔数为白蛋白摩尔数的10倍；
[0107](3)在所述步骤(2)所得的溶液中加入的IOmL无水乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液在0°c的条件下反应10min后，静置待微乳溶液分层后除去有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
[0108](4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为25°C的条件下，将透析袋置于5L双蒸水内透析12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液，
[0109](5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20°C下预冻2小时后转移至负80°C下冷冻24小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包`括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10-600nm。
[0110]对比实施例二
[0111]一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤:
[0112](I)取ImL体积质量浓度为I (w/v, mg/mL)的吲哚青绿和lmL300 (w/v, mg/mL)的牛血清白蛋白混合，得到白蛋白混合液；
[0113](2)向步骤(1)所得的白蛋白混合液中加入谷胱甘肽得反应液，然后在60°C下轻轻摇动反应0.05小时，在所述反应液中，所述谷胱甘肽的摩尔数为白蛋白摩尔数的5000倍;
[0114](3)在所述步骤(2)所得的溶液中加入的IOmL无水乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液在0°c的条件下反应10min后，静置待微乳溶液分层后除去有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；
[0115](4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为25°C的条件下，将透析袋置于5L双蒸水内透析12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液，
[0116](5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20°C下预冻2小时后转移至负80°C下冷冻24小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为100~lOOOnm。
[0117]相对于本发明实施例提供的多聚体白蛋白纳米球，对比实施例1和对比实施例2提供的多聚体白蛋白纳米球粒径分布集中度不高，不利于其在生物医学上的应用。[0118]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之 内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种多聚体白蛋白纳米球，其特征在于，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10~lOOOnm。
2.如权利要求1所述的一种多聚体白蛋白纳米球，其特征在于，所述含巯基或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。
3.如权利要求1所述的一种多聚体白蛋白纳米球，其特征在于，所述多聚体白蛋白纳米球中包裹有目标投递物。
4.如权利要求3所述的一种多聚体白蛋白纳米球，其特征在于，所述目标投递物为抗癌药物和造影剂中的至少一种。
5.如权利要求4所述的一种多聚体白蛋白纳米球，其特征在于，所述抗癌药物为钼及钼的配合物、5β，20_环氧_1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-1 1-烯-9-酮-4，10- 二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13 [ (2’ R, 3’ S) -N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]、(7S:9S)-9-羟乙酰基-4-甲氧基-7，8，9，10-四氢-6，7，9，11-四羟基-7_0-(2’，3’，6’，_二去氧-3’ _氣基-a_l_来苏已吡喃基)_5，12-蔡二丽、(E, E)-1, 7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1，6-庚二烯-3，5- 二酮、4-乙基-4，12- 二氧-4-羟-1H-吡喃(3’，4’，6，7)吡吲哚(I，2-6)喹啉-3，14- 二酮、(2S-反式)-18-羧基-20-(羧甲基)-13-乙基-2，3- 二氢3，7，12，17-四甲基-8-乙烯基-21H，23H-卟吩-2-丙酸、IR700碘化物和11-氯-1，I’ - 二正丙基-3，3，3’，3’ -四甲基-10，12-三亚甲基吲哚三碳花青碘盐中的至少一种。
6.如权利要求4所述的一 种多聚体白蛋白纳米球，其特征在于，所述抗造影剂为2，7-双[1，3- 二氢-1，1- 二甲基-3- (4-横丁基)-1, 3, 5-庚二烯单钠盐、对-[(2, 4- 二氨基喋啶-6)_N-甲基甲氨基]苯甲酰谷氨酸、3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-翁氯化物、6，6’-[[3，3’-二甲基(1，1’-二苯基)-4，4’-二基]双(偶氮基)]双(4-氨基-5-羟基-1，3-萘二磺酸)四钠盐、2-((4- 二乙氨基)苯)(4_( 二乙氨基)环己烧_2，5- 二烯)甲烷)苯基-1，4-二磺酸盐、4，4’-双(二乙氨基)三苯脱水甲醇_2’’，4’’-二磺酸单钠和金属纳米粒子中的至少一种。
7.一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)制备体积质量浓度为0.01~300mg/mL的含疏基的白蛋白水溶液，并调节所述白蛋白水溶液的PH值为7~12 ; (2)向步骤(1)所得的所述pH值为7~12的白蛋白混合液中加入带巯基的还原剂得反应液，然后在O~60°C下轻轻摇动反应0.05~12小时，在所述反应液中，所述带巯基的还原剂的摩尔数为白蛋白摩尔数的10~5000倍； (3)将步骤(2)反应后的溶液在O~60°C的条件下进行超声，所述超声的功率范围为I~100KW，同时在搅拌的条件下在所述进行超声的溶液中以0.01~1000ml/s的速度加入有机溶剂得到微乳溶液，所述微乳溶液在O~60°C的条件下反应5~240min后，静置分层，然后去除有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液，其中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤(2)反应后的溶液的2~100倍； (4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在O~60°C以及pH值为7~12的条件下进行透析，得到多聚体白蛋白纳米球溶液； (5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥脱水处理，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10~lOOOnm。
8.如权利要求7所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中，所述含巯基或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。
9.如权利要求7所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤(O中，所述白蛋白水溶液中含有体积分数为5%~50%的二甲基亚砜。
10.如权利要求7所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述白蛋白水溶液中含有目标投递物，所述目标投递物的质量为所述白蛋白质量的0.0002 ~0.5 倍。
11.如权利要求10所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述目标投递物为抗癌药物和造影剂中的至少一种。
12.如权利要求11所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述抗癌药物为钼及钼的配合物、50，20-环氧-1，2(1，4，7110113(1-六羟基紫杉烷-1 1-烯-9-酮-4，10- 二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13 [ (2’ R, 3’ S) -N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]、(7S:9S)-9-羟乙酰基-4-甲氧基-7，8，9，10-四氢_6，7，9，11-四羟基-7_0-(2’，3’，6’，_二去氧-3’ _氣基-a_l_来苏已吡喃基)_5，12-蔡二丽、(E, E)-1, 7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基) -1，6-庚二烯-3，5- 二酮、4-乙基-4，12- 二氧-4-羟-1H-吡喃(3’，4’，6，7)吡吲哚(I，2-6)喹啉-3，14- 二酮、(2S-反式)-18-羧基-20-(羧甲基)-13-乙基-2，3- 二氢3，7，12，17-四甲基-8-乙烯基-21H，23H-卟吩-2-丙酸、IR700碘化物和11-氯-1，I’ - 二正丙基-3，3，3’，3’ -四甲基-10，12-三亚甲基吲哚三碳花青碘盐中的至少一种。
13.如权利要求11所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述造影剂为2，7-双[1，3- 二氢-1，1- 二甲基-3- (4-横丁基)-1, 3，5-庚二烯单钠盐、对-[(2，4-二氨基喋啶-6)-N-甲基甲氨基]苯甲酰谷氨酸、3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-翁氯化物、6，6’ -[ [3，3’ - 二甲基(1，I’ - 二苯基)-4，4’ - 二基]双(偶氮基)]双(4-氨基-5-羟基-1，3-萘二磺酸)四钠盐、2-((4-二乙氨基)苯)(4-( 二乙氨基)环己烷-2，5-二烯)甲烷)苯基-1，4-二磺酸盐、4，4’-双(二乙氨基)三苯脱水甲醇-2’ ’，4’ ’ - 二磺酸单钠和金属纳米粒子中的至少一种。
14.如权利要求7所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述带巯基的还原剂为谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙醇或二硫苏糖醇。
15.如权利要求7所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇或叔丁醇中的至少一种。
16.如权利要求15所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂中还含有三氯甲烷、二氯甲烷或正己烷中的至少一种。
17.如权利要求7所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述进行透析的方法为:先将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液置于pH值为7~12的PBS缓冲液中透析10~300小时，然后在双蒸水内透析I~24小时，得到含多聚体白蛋白纳米球的溶液。
18.如权利要求7所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，其特征在于，所述对步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥脱水处理的方式为:将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负O~20°C下预冻I~48小时后转移至负20~80°C下冷冻2~48小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥12~120小时。
19.如权利要求7所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，其特征在于，所述多聚体白蛋白纳米球中包裹有目标投递物。
20.如权利要求1~6任一 所述的多聚体白蛋白纳米球在制备预防、治疗或诊断癌症的药物中的应用。
【文档编号】A61K47/42GK103495179SQ201310449770
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】蔡林涛, 胡德红, 盛宗海 申请人:深圳先进技术研究院