端粒结合蛋白daxx在制备肿瘤细胞调控剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了端粒结合蛋白DAXX在制备肿瘤细胞调控剂中的应用。所述端粒相关蛋白DAXX包含有ATRX结合结构域、组蛋白结合结构域、端粒酶结合结构域、卡哈尔小体结合结构域和端粒结合结构域。DAXX能够定位在端粒酶阳性的肿瘤细胞端粒上，通过调控端粒酶的组装和运输以维持端粒长度，从而调控肿瘤细胞的生长与繁殖。另外，DAXX也能够定位到不依赖端粒酶端粒延长机制（ALT）肿瘤细胞的端粒上，通过影响ALT机制来调控端粒的长度。因此DAXX在端粒酶阳性以及存在ALT机制的肿瘤细胞中都有重要的端粒调控功能，可以针对DAXX对肿瘤细胞的调控机制开发有效的肿瘤细胞调控剂。
【专利说明】端粒结合蛋白DAXX在制备肿瘤细胞调控剂中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤细胞调控领域。更具体地，涉及端粒结合蛋白DAXX在制备肿瘤细胞调控剂中的应用。
【背景技术】
[0002]端粒是真核生物染色体末端由高度重复DNA序列(TTAGGG)和一些结合蛋白组成的特殊结构。它能保护染色体末端免于降解和相互融合以保证染色体的完整性。正常细胞每分裂一次，端粒就逐渐变短一些，当端粒缩短到一定界限时，细胞无法继续分裂，便开始衰老和死亡。然而，肿瘤细胞存在端粒延长机制，使得其可以逃避端粒缩短造成的衰老和死亡以维持永生化状态。大约85%的癌症通过激活端粒酶的方式延长端粒，另外15%的癌症则通过称为ALT (alternative lengthening of telomeres)的不依赖端粒酶的端粒延长机制延长端粒，ALT机制是依赖同源重组实现端粒延长的。目前，可以通过TRAP技术检测端粒酶活性的有无，CO-FISH技术检测端粒处是否有同源重组的发生，就可以很方便的检测出一种肿瘤细胞中存在哪种端粒延长机制。
[0003]端粒结构和功能的维持受到以核心蛋白TRFl，TRF2，TIN2, TPPl，POTl和RAPl组成的shelterin复合物以及其他端粒相关蛋白共同形成的端粒蛋白调控网络的精确调控。因此，对端粒调控蛋白网络的解析有助于阐明不同端粒延伸方式的肿瘤发生的机制，为寻找更多的有效的肿瘤药物治疗靶标提供理论依据。
[0004]端粒结合蛋白DAXX全称为Death-domain associated protein,其氛基酸序列全长740个氨基酸，在NCBI上的登录号为:Q9UER7。DAXX包含有ATRX结合结构域、组蛋白结合结构域、端粒酶结合 结构域、卡哈尔小体结合结构域和端粒结合结构域。DAXX蛋白首先被发现是结合跨膜死亡受体FAS的死亡结构域，并提高FAS诱导的细胞死亡。DAXX是早期老鼠发育的一个非常关键的基因，敲除DAXX能够导致细胞凋亡并在胚胎孕育的第9.5天导致胚胎死亡。除了在凋亡方面发挥作用外，DAXX蛋白还被发现是一种转录共抑制子，能够抑制一些转录因子的转录活性，而且这个抑制作用与其定位到PML小体中是非常相关的。近年来DAXX被发现是组蛋白H3.3特异的分子伴侣帮助H3.3定位到异染色质(如端粒)上去。
[0005]但是，通过外显子测序，多个研究组发现在胰腺神经细胞瘤和一些胶质母细胞瘤(GBM)发现了 DAXX的丢失或者突变，而DAXX的功能丧失会激活不依赖端粒酶的端粒延长机制(ALT)。
[0006]抑制端粒酶活性是目前攻克癌症的主要手段之一。然而近来有文章报导说具有端粒酶活性的癌症可以通过激活ALT以逃避端粒酶抑制的治疗手段，从而使得癌细胞存活下来。目前，对于这种不依赖端粒酶延长端粒的方式(ALT)的具体机制研究还十分有限，尤其是它是否与端粒酶激活的延长机制有关更是不清楚。而在大量ALT肿瘤病人中发现DAXX的功能缺失，揭示了 DAXX必然参与了端粒相关功能的调控，很有可能在参与端粒酶转换到ALT机制中扮演重要的角色，这将对以后发现癌症治疗的真正靶标、攻克癌症具有重要作用。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是克服现有肿瘤细胞调控存在的问题和技术不足，提供了端粒结合蛋白DAXX在制备肿瘤细胞调控剂上的应用。所述端粒结合蛋白DAXX在端粒酶阳性的肿瘤细胞以及存在ALT机制的肿瘤细胞中都有重要的端粒调控功能。[0008]本发明的目的通过以下技术方案予以实现: 本发明解析了 DAXX在调控肿瘤细胞端粒长度中的功能。DAXX能够定位在端粒酶阳性的肿瘤细胞端粒上，通过调控端粒酶的组装和运输以维持端粒长度，从而调控肿瘤细胞的生长与繁殖，其蛋白表达水平与端粒长度成正相关。[0009]具体地，DAXX能够与端粒酶相互作用，且这种相互作用是依赖其N端结构域的，DAXX与端粒酶结合以后，调控端粒酶的组装和运输，使得端粒能够持续延长，从而引发肿瘤细胞的不断生长与繁殖。发生在N端的DAXX疾病突变体能够减弱与端粒酶的相互作用，过表达这些突变体能够使得端粒长度变短。[0010]DAXX与端粒酶相互作用是通过与端粒酶核心组分DKCl和hTERT相互作用，并且与DKCl的相互作用是直接的。[0011]DAXX也可定位在卡哈尔小体(端粒酶组装部位)上，并且这种定位是周期依赖的，主要集中在S期早期。[0012]另外，DAXX也能够定位到不依赖端粒酶端粒延长机制(ALT)肿瘤细胞的端粒上，通过影响ALT机制来调控端粒的长度。[0013]因此DAXX在端粒酶阳性的肿瘤细胞以及存在ALT机制的肿瘤细胞中都有重要的端粒调控功能，可以针对其调控机制制备有效的肿瘤细胞调控剂。[0014]本发明提供了端粒结合蛋白DAXX在制备端粒酶机制肿瘤细胞调控剂方面的应用。[0015]优选地，所述应用是端粒结合蛋白DAXX在制备端粒酶机制肿瘤细胞中端粒酶组装和运输的调控剂方面的应用。[0016]优选地，本发明提供了端粒结合蛋白DAXX的抑制剂及其表达抑制剂在制备抗端粒酶机制肿瘤细胞药物方面的应用。[0017]本发明还提供了端粒结合蛋白DAXX在制备不依赖端粒酶端粒延长机制肿瘤细胞调控剂方面的应用。[0018]优选地，所述应用是端粒结合蛋白DAXX在制备不依赖端粒酶端粒延长机制的肿瘤细胞端粒长度的调控剂方面的应用。[0019]优选地，本发明提供了端粒结合蛋白DAXX的激活剂及其表达调控剂在制备抗不依赖端粒酶端粒延长机制肿瘤细胞药物方面的应用。[0020]另外，本发明还提供了一种抗端粒酶机制肿瘤细胞的药物制剂或一种抗不依赖端粒酶端粒延长机制肿瘤细胞的药物制剂，包括有效量的端粒结合蛋白DAXX和药学上可接受的辅料。[0021]优选地，所述药物制剂为注射制剂或口服制剂。[0022]优选地，所述注射制剂为冻干粉针剂。[0023]优选地，所述口服制剂为散片剂、胶囊剂或颗粒剂。[0024]本发明为了研究端粒结合蛋白DAXX对肿瘤细胞的调控功能，具体实验设计如下:
51.免疫荧光实验，检测内源DAXX蛋白在端粒上的定位情况；
52.串联亲和纯化(TAP)结合液相色谱质谱实验，对端粒酶阳性的293T细胞中的DAXX进行质谱检测，研究DAXX与端粒酶的相互作用；
53.双分子突光互补技术(Bimolecularfluorescence complementation, BiFC)实验以及免疫荧光实验，研究DAXX与端粒酶相互作用的机制。进一步地，通过体内和体外的免疫共沉淀实验验证DAXX与端粒酶的作用；
54.免疫沉淀相结合的端粒酶活性实验，研究DAXX与端粒酶的相互作用以及相互作用的部位；
55.敲低HTC75细胞中DAXX表达水平或者过表达DAXX疾病突变体，研究DAXX与端粒长度变化的关系；
56.敲低U20S细胞中DAXX表达水平，研究DAXX与ALT机制的活性的关系。
[0025]本发明具有以下有益效果:
本发明克服了现有肿瘤细胞调控存在的问题和技术不足，提供了端粒结合蛋白DAXX在制备肿瘤细胞调控剂上的应用。本发明发现在端粒酶阳性的细胞中端粒结合蛋白DAXX能够帮助端粒酶定位到端粒上去，调控端粒酶的组装和运输，从而延伸端粒。同时在ALT机制肿瘤细胞中DAXX功能丧失可以促进ALT机制的活性，来延伸端粒以维持端粒长度。因此，根据DAXX的这种功能 ，开发应用抗端粒酶机制肿瘤细胞药物以及抗不依赖端粒酶端粒延长机制肿瘤细胞药物，对癌症的攻克具有举足轻重的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为内源DAXX蛋白在不同细胞中与端粒的共定位情况。红色显示DAXX蛋白信号，绿色显示端粒探针信号。
[0027]图2为DAXX与卡哈尔小体在细胞周期非同步化及同步化情况下的共定位情况，PI染色显示细胞周期同步化处理效果。红色显示DAXX蛋白信号，绿色显示卡哈尔小体的marker蛋白coilin的信号,蓝色显示DAPI染色的细胞核。
[0028]图3为细胞周期同步化下DAXX与卡哈尔小体的共定位实验的统计数据。
[0029]图4为DAXX疾病突变体与卡哈尔小体的共定位情况。红色显示DAXX突变体蛋白信号，绿色显示卡哈尔小体的marker蛋白coilin的信号,蓝色显示DAPI染色的细胞核。
[0030]图5为DAXX疾病突变体与卡哈尔小体的共定位实验统计数据。
[0031 ] 图6显示在对照组和敲低DAXX的ALT机制的细胞U20S中，ALT机制的标记ALT相关的PML小体的数量变化情况。
[0032]图7为DAXX蛋白在293T细胞中的质谱数据。
[0033]图8为BiFC技术原理示意图以及DAXX与端粒酶组分DKCl的BiFC实验流式结果。TCABl是已知与DKCl相互作用的蛋白作为阳性对照，PDKl为阴性对照。
[0034]图9为DAXX与DKCl和hTERT的体内免疫共沉淀实验结果(左)以及DAXX与DKCl体外免疫共沉淀实验结果(右)。
[0035]图10为DAXX疾病突变体与ATRX、H3.3以及端粒酶组分DKCl的相互作用结果。
[0036]图11为DAXX蛋白序列以及截短(truncate)突变体和疾病突变体示意图。[0037]图12为DAXX truncate突变体的免疫沉淀相结合的端粒酶活性实验结果。
[0038]图13为DAXX疾病突变体的免疫沉淀相结合的端粒酶活性实验结果。
[0039]图14为DAXX敲低细胞系中端粒长度的变化图(左)，右侧为western blot检测DAXX敲低效率以及长度变化统计数据。
[0040]图15为稳定表达DAXX疾病突变体的细胞系端粒长度的变化。
[0041]图16为稳定表达DAXX疾病突变体的细胞系western blot结果以及端粒长度变化统计数据。
[0042]图17显示在对照组和敲低DAXX细胞系中表达端粒酶逆转录酶TERT，ChromatinFraction实验检测TERT在胞质和染色质的分布情况。
【具体实施方式】
[0043]以下结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本【技术领域】常规试剂和设备；未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。
[0044]以下实施例所使用的蛋白DAXX，是通过从哈佛医学院ORFeome数据库购买包含其序列的入门载体PD0NR223，然后连接到含有不同标签(如SFB，HA, GST)的表达载体中，再通过大肠杆菌原核表达或者真核细胞中表达得到。
[0045]肿瘤细胞(Hela，HTC75)、肿瘤细胞(U20S)、293T细胞(人肾上皮细胞)，均购买于上海中国科学院细胞库。
[0046]实施例1免疫荧光实·验 1、实验材料
试剂:本实验所用兔多抗DAXX内源抗体(购于Santa Cruz公司，产品货号sc_7152)，使用时用3%牛血清蛋白(BSA)按1:200稀释；coilin抗体(购于Abcam公司，产品货号ab11822)，使用时用3% BSA按1:2000稀释；PML抗体(购于Santa Cruz公司，产品货号sc-966)，使用时用3% BSA按1:100稀释；HA抗体(购于sigma公司，产品货号H3663)，使用时用3% BSA按1:500稀释；二抗(羊抗鼠，FITC标记，购于Invitrogen公司，产品货号A11017，羊抗兔，TXRED标记，购于联科生物公司，产品货号LK-GAR5492)，使用时用3% BSA按1:2000稀释；PNA端粒探针(购于Panagene公司，产品货号F1009-5)，工作浓度为10nM。
[0047]2、实验方法
S1.细胞准备:按照常规肿瘤细胞培养方法进行培养，将培养的肿瘤细胞放入24孔板(用前在24孔板中放入盖玻片)，让细胞在盖玻片上贴壁生长，待细胞生长至细胞汇合度为85%~95%时，吸走培养基，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗两次；
所述培养基的组成为=DMEM培养基、10%FBS。
[0048]S2.固定:加4%多聚甲醛，冰上固定细胞lOmin，再用PBS洗两次，置于水平摇床，室温震荡2min。
[0049]S3.细胞通透处理:每孔加入 ImL 透化液(5% Triton-X, 20mM HEPES,50mM NaCl,3mM MgCl2, 300mM Sucrose),室温静置30分钟后，加入适量的体积比浓度5%的羊血清(用PBS配制)洗三次，每次5分钟，置于水平摇床。
[0050]S4.封闭:用体积比浓度5%的羊血清(用PBS配制)做封闭液，封闭至少I小时，滤干玻片。
[0051]S5.—抗结合:孵一抗，倒扣，4°C过夜(12小时)，置于湿盒中，用吐温含量为0.1%的磷酸盐吐温缓冲液(PBST)清洗三次，每次15分钟。
[0052]S6.二抗结合(该步骤需避光):滤干玻片，孵二抗，置于室温I小时后PBST洗三次，每次15分钟；加入适量固定液(4%多聚甲醛)，冰上固定15分钟，之后用PBS洗两次，每次15分钟，依次用体积比浓度为70%、90%、100%的无水乙醇脱水，风干。
[0053]S7.加 PNA探针:加PNA端粒探针，倒扣在载玻片上，85°C热变性，湿盒中孵育2小时；wash I (IOmM Tris-HCL (ΡΗ7.4)，70% 甲酰胺，0.1%BSA)洗两次，wash II (Tris-HCL缓冲盐溶液，0.l%Tween 20)洗三次，依次用体积比浓度为70%、90%、100%的无水乙醇脱水。
[0054]S8.封片及检测:自然风干，加封片液(DAPI)染核，涂指甲油封片，荧光显微镜检测。[0055]3、实验结果
(I)实验结果如附图1所示，DAXX能够定位到端粒酶阳性的肿瘤细胞(Hela，HTC75)的端粒上，并且也能够定位到ALT机制肿瘤细胞(U20S)的端粒上，而且偏向于长度较长的端粒上。
[0056](2)进一步地，免疫荧光实验检测到DAXX与端粒酶组装部位卡哈尔小体(Cajalbody)共定位并且这种定位是周期依赖的，主要集中在S期早期，与端粒酶组装时期符合(如附图2、附图3所示)。
[0057](3)实验结果还显示了，某些DAXX的疾病突变体不能够去到卡哈尔小体(Cajalbody)中(如附图4、附图5所示)，说明DAXX的疾病突变体能够影响端粒酶的组装或组装后的运输。
[0058](4)敲低U20S细胞中DAXX表达水平，结合免疫荧光实验结果显示，敲低U20S细胞中DAXX表达水平，能够增加ALT机制细胞的标记ALT相关的PML小体的数量。说明DAXX的失活能够增强ALT的活性(如附图6所示)。表明在ALT机制肿瘤细胞中的蛋白表达水平与ALT机制的标记ALT相关的PML小体(APB)的数量呈负相关。
[0059]实施例2串联亲和纯化(TAP)结合液相色谱质谱实验 1、实验方法
首先利用Invitrogen公司Gateway技术，将从哈佛医学院购买的入门载体DAXXpDonor223通过LR反应连接到目的载体pBabe-CMV-SFB-puro (美国贝勒医学院生化与分子生物学实验室惠赠，SFB同时含有链霉亲和素结合的标签(B标签)，核糖核酸酶A蛋白水解剪切后的一段肽段S标签，Flag标签)中，制备得到pBabe-CMV-SFB-DAXX-puro病毒载体(反应条件参照Invitrogen公司产品LR CL0NASE II ENZYME MIX产品说明书，货号11791020)，通过包装表达DAXX-SFB的逆转录病毒，感染293T细胞，48小时用嘌呤霉素筛选，挑选能稳定表达DAXX-SFB的293T单克隆细胞系，经大规模培养后，裂解细胞提取蛋白，然后将蛋白经过链霉亲和素琼脂糖珠(从Amersham Biosciences购买,货号17_5113_01)和S蛋白琼脂糖珠(从Novagen公司购买，货号69704-4) 2步纯化，获得含有DAXX-SFB的与DAXX互相作用的蛋白，将该蛋白跑SDS-PAGE胶分离，切下特异胶带，送去哈佛医学院进行质谱结果分析。
[0060]2、实验结果实验结果如附图7所示，在端粒酶阳性的293T细胞中的质谱结果显示，DAXX除了能够拉下已知相互作用的蛋白ATRX和组蛋白外,还能拉下端粒酶复合物(DKC1, coilin, GARl,NAFl等)，说明DAXX能与端粒酶相互作用。
[0061]实施例3 双分子突光互补实验(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)
1、实验方法
首先利用Invitrogen公司Gateway技术，将从哈佛医学院购买的入门载体DKClpDonor223通过LR反应连接到目的载体pBabe-CMV-YFPn_neo (美国贝勒医学院生化与分子生物学实验室惠赠)中，制备得到pBabe-CMV-YFPn-DKCl-neo病毒载体，以该病毒感染HTC75细胞并用抗生素G418筛选出稳定表达DKCl-YFPn的诱饵(Bait)细胞。然后用同样的方法利用Invitrogen公司Gateway技术,将从哈佛医学院购买的入门载体DAXX pDonor223通过LR反应连接到目的载体pBabe-CMV-YFPc-puro (贝勒医学院生化与分子生物学实验室惠赠)中，制备得到pBabe-CMV- YFPc-DAXX-puro病毒载体，以该病毒感染筛选出的稳定细胞系(Prey细胞),再通过嘌呤霉素(puro)筛选,最后使用流式细胞仪技术分析两者是否具有相互作用。
[0062]2、实验结果
实验结果如附图8所示，双分子荧光互补技术实验中，分别表达连有YFP部分结构的DAXX和DKCl，两半YFP蛋白重新结合成会发荧光的完整的YFP蛋白，从而证实了 DAXX可以与蛋白DKCl相互作用。
[0063]实施例4免疫共沉淀实验
1、实验使用的抗体有FLAG抗体(购于sigma公司，产品货号F7425)，使用时用3%牛血清蛋白(BSA)按1:5000稀释；GST抗体(购于Abmart公司，产品货号M20007)，使用时用3%牛血清蛋白(BSA)按1:5000稀释；DKC1抗体(购于Santa cruz公司，产品货号sc-48794)，使用时用3%牛血清蛋白(BSA)按1:500稀释；ATRX抗体(购于Santa cruz公司，产品货号sc-15408)，使用时用3%牛血清蛋白(BSA)按1:500稀释；H3抗体(购于Cell signalingtechnology公司，产品货号9701S)，使用时用3%牛血清蛋白(BSA)按1:1000稀释。
[0064]2、体内免疫共沉淀实验
在293T细胞中共转染待验证相互作用的蛋白(DAXX和DKCl，DAXX和TERT )。所述DKCl的cDNA全长是通过PCR方法从Hela细胞中获得并连接到InvitrogenpEnter-D-TOPO入门载体，得到DKCl pENTER载体，然后再利用Gateway技术进行LR反应连接到pCL-CMV-2XFlag-puro目的载体(美国贝勒医学院生化与分子生物学实验室惠赠)；所述TERT的cDNA全长是通过PCR方法从Hela细胞中获得并连接到InvitrogenpEnter-D-TOPO入门载体，得到记为TERT pENTER载体，然后再利用Gateway技术进行LR反应连接到pBabe-CMV-SFB-puro目的载体(美国贝勒医学院生化与分子生物学实验室惠赠)，得到TERT-SFB载体质粒。通过GST pull down,然后western blot (使用FLAG抗体、GST抗体)检测拉下来的蛋白，或者单独转染DAXX突变体，通过Flag IP (FlagImmunoprecipitation),然后 western blot (使用 FLAG 抗体、DKCl 抗体、ATRX 抗体、和 H3抗体)检测与ATRX，DKCl, H3的相互作用。
[0065]3、体外免疫共沉淀实验首先以含有DAXX的pD0NR223为模板，通过PCR方法拿到DAXX核苷酸序列全长的161-240位，以DKCl pENTER载体为模板，通过PCR方法拿到DKC核苷酸序列全长的1-250位这段序列，然后将该PCR产物和Invitrogen pEnter-D-TOPO入门载体空载进行过双酶切CAscI和舱(/，从Thermo公司购买)，通过T4连接酶进行连接，得到含有目的片段的入门载体，再通过Gateway技术进行LR反应连接到原核表达目的载体H)EST15 (GST标签，市购于Invitrogen公司)或FOESTU (His标签,市购于Invitrogen公司)中，获得能够在BL21大肠杆菌(市购)中进行表达的目的载体。将获得的目的载体在BL21大肠杆菌(市购)中经过IPTG诱导表达，并用GST琼脂糖珠(beads，购自GE公司)及镍柱进行体外纯化得到重组蛋白DAXX 161-240-GST和DKCll-250-His，将2种蛋白4°C孵育过夜，然后4°C与GST琼脂糖珠孵育2小时，NETN洗3遍，然后跑SDS-PAGE胶，考马斯亮蓝检测结果。
[0066]4、实验结果
实验结果显示，体内和体外的免疫共沉淀实验证实了 DAXX与DKCl的相互作用是直接的，DAXX能够与端粒酶核心组分逆转录酶hTERT相互作用(如附图9所示)，说明DAXX的确能够与端粒酶组分相互作用。
[0067]实验结果还显示了 DAXX疾病突变体能够影响与ATRX、组蛋白H3.3或端粒酶组分DKCl相互作用(如附图10所示)。
[0068]实施例5免疫沉淀相结合的端粒酶活性实验 1、实验方法
在293T细胞中瞬时转染带Flag标签的DAXX核苷酸序列全长及truncate突变体和疾病突变体的质粒，48小时后收集蛋白，经过Flag IP后，用3XFlag P印tide洗脱beads上的蛋白。将洗脱下来的蛋白与体外端粒酶延伸的底物(底物是一段序列为AATCCGTCGAGCAGAGTT的引物)孵育，然后通过实时荧光定量PCR技术检测拉下来的端粒酶活性。
[0069]2、实验结果
实验结果显示，DAXX的N端能够拉下极强的端粒酶活性，C端不能，说明DAXX N端是与端粒酶相互作用的部位(如附图11、附图12所示)。另外，某些DAXX的疾病突变体能够减弱与端粒酶的相互作用(如附图13所示)。
[0070]实施例6通过shRNA蛋白敲低的方法研究DAXX对肿瘤细胞的作用机制
1、本实施例中的稳定表达shRNA (shDAXX)的细胞系的筛选方法
首先合成含有shRNA正反序列的oligo引物，通过梯度降温的方式将2条引物退火，将退火好的含有shRNA正反序列的双链RNA连接于pcl-MU6载体中，制备逆转录病毒。以病毒感染HTC75细胞或者U20S细胞，并用嘌呤霉素筛选出稳定表达shRNA的细胞系。
[0071]2、Southern blot 实验 (1）实验方法
首先构建稳定表达shDAXX和DAXX疾病突变体的HTC75细胞系，通过western检测shRNA的敲低效率，取不同代次的细胞，提取基因组DNA，使用限制性内切酶fca/和HinfI将其切碎到只剩下端粒区，跑0.7%琼脂糖凝胶电泳分离，然后转移到尼龙膜(购自GE公司)上，紫外交联，然后变性、中和，与同位素P32标记的端粒探针杂交，然后用Typhoon扫描仪进行信号检测。[0072](2)实验结果
实验结果显示，敲低HTC75细胞中DAXX表达水平，导致端粒长度逐渐变短(如附图14所示)，过表达DAXX疾病突变体也能够导致端粒长度变短(如附图15、附图16所示)，说明DAXX能够正调控端粒长度。
[0073]3、核质分离(Chromatin Fraction)实验 (O实验方法
构建稳定表达shDAXX的293T细胞系，瞬时转染能够表达端粒酶核心组分逆转录酶的载体TERT-SFB(构建方法同实施例4中2步骤所述)，48小时后收集细胞，首先用低盐裂解液(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, IOmMNaCl, 1.5mM MgC12, I mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40,20mM NaF, ImM Na3V04, I μ g/ml aprotinin, and I μ g/ml pepstatin)提取胞质蛋白，将细胞沉淀用PBS洗3遍后，用0.2M HCl提取结合在染色质上的蛋白。跑SDS-PAGE胶，进行western blot检测(使用FLAG抗体、GAPDH抗体(购于Abmart公司，产品货号M20006M,使用时用3%牛血清蛋白(BSA)按1:5000稀释)、H3抗体)。用GAPDH抗体和H3抗体检测细胞质和染色质分离效果。
[0074](2)实验结果
实验结果显示，敲低293T细胞中DAXX表达水平，能够影响端粒酶核心组分逆转录酶hTERT运输到端粒上去延伸端粒(如附图17所示)，说明DAXX是通过影响端粒酶的运输来调节端粒长度的。
【权利要求】
1.端粒结合蛋白DAXX在制备端粒酶机制肿瘤细胞调控剂方面的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述应用是端粒结合蛋白DAXX在制备端粒酶机制肿瘤细胞中端粒酶组装和运输的调控剂中的应用。
3.权利要求1所述端粒结合蛋白DAXX的抑制剂及其表达抑制剂在制备抗端粒酶机制肿瘤细胞药物中的应用。
4.端粒结合蛋白DAXX在制备不依赖端粒酶端粒延长机制肿瘤细胞调控剂中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述应用是端粒结合蛋白DAXX在制备不依赖端粒酶端粒延长机制的肿瘤细胞端粒长度的调控剂中的应用。
6.权利要求4所述端粒结合蛋白DAXX的激活剂及其表达调控剂在制备抗不依赖端粒酶端粒延长机制肿瘤细胞药物中的应用。
7.一种抗端粒酶阳性肿瘤细胞的药物制剂，其特征在于，包括有效量的端粒结合蛋白DAXX和药学上可接受的辅料。
8.一种抗不依赖端粒酶端粒延长机制肿瘤细胞的药物制剂，其特征在于，包括有效量的端粒结合蛋白DAXX和药学上可接受的辅料。
9.根据权利要求7或8所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为注射制剂或口服制剂。
10.根据权利要求8所述药物制剂，其特征在于，所述注射制剂为冻干粉针剂，所述口服制剂为散片剂、胶囊剂或颗 粒剂。
【文档编号】A61P35/00GK103585618SQ201310527333
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】松阳洲, 唐梦帆 申请人:中山大学