骨修复促进剂的制作方法

骨修复促进剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供包含至少一种B-型利尿钠肽受体激动剂作为活性成分的骨修复促进剂。
【专利说明】骨修复促进剂

【技术领域】
[0001] 本发明涉及含有利尿钠肽受体NPR-B激动剂作为活性成分的骨修复促进剂，所述 激动剂用C-型利尿钠肽（CNP)或CNP衍生物表示。

【背景技术】
[0002] 骨骼系统由骨组织和软骨以及肌肉组成，在身体各部分的运动中发挥作用。而且， 部分中枢神经组织和内脏位于颅骨和脊柱内，骨骼系统在保护中枢神经组织和内脏免受因 外界所致物理性应力中发挥作用。此外，骨骼系统是钙和磷的重要贮库，骨的内部起血细胞 的制备场所的作用。人的骨骼系统由大约200块骨形成，根据其形状和性质分类为若干种。 称为长骨或管状骨的骨包括肱骨和股骨，特征为在长管状骨干的两端都有鼓起的骨骺。当 从表面上看时，长骨似乎由密质骨（骨密质）构成，但内部是稀疏结构（松质骨），并且骨髓 位于其中。骨骺的表面是与密质骨相连的薄皮质，内部由十字交叉的薄骨胶原的松质骨构 成。
[0003] 通常，认为在长骨中，当骨组织经强大外力等而受损，以及为了便于治疗而进行切 骨程序等时，响应于这种状态，生理功能尝试修复骨以使骨具备其原形状和强度。此时，认 为牵涉到由许多不同类型的细胞和体液因子高度控制的复杂的生物学反应。
[0004] 目前，骨折的治疗经手术实施。在治疗期间，受累部分必须长时间固定等，因此，患 者的负担大。还有因不充分的修复、异常骨形成等所致而再骨折的风险。在严重损伤、骨质 疏松症/衰老伴发的骨脆等背景的情况下，存在进一步延长治疗的高可能性。因此，要求骨 修复促进剂促进骨修复和缩短修复期或者在恢复后恢复骨的正常形状和强度。但是，至今 可以满足上述要求的作用剂尚未投入实际应用。骨折的愈合过程分三个阶段进行：炎症期、 修复期和重塑期，然而相互有一定程度重叠（非专利文献1)。首先，紧接着骨折之后（炎症 期），免疫细胞清除损伤的软组织、骨碎片、内出血的血液等。由于免疫细胞的活性和血流的 增加，骨折部位周围变膨胀和疼痛。因在受累部分与血肿形成伴发的炎症反应所致，未分化 的间充质细胞被局部诱导，这些细胞分化成骨原细胞比如成骨细胞和破骨细胞或者软骨细 胞，这几种细胞在后续修复期发挥重要作用。
[0005] 修复期始于骨折几天内，需要几周至几个月，在此期间，形成修复的新骨（外骨 痂）。清除骨折裂缝的血肿，产生肉芽组织，形成软骨痂。软骨痂被硬骨痂逐渐代替的过程 (软骨内骨化）和由存在于骨膜中的骨原细胞形成新骨的过程（膜内骨化）同时进行。已 知在形成骨痂然后骨痂被更硬的结构代替的过程中，各种类型的成骨细胞、破骨细胞、软骨 细胞等控制彼此的活性。认为这些细胞由在炎症期期间诱导至损伤部位的具有多能性的未 分化间充质细胞分化而来。认为这些未分化的间充质细胞是骨和软骨细胞、脂肪细胞、肌肉 细胞、成纤维细胞等的共同前体细胞，这些细胞各自受组织特异性转录调控元件控制（非 专利文献2)。在骨折部位，还预期牵涉多个转录调控元件。
[0006] 在重塑期中，将骨修复至其正常状态的原有条件，但是，为此需要长时间比如几个 月。在此过程中，具有低密度的外骨痂被逐渐再吸收，被正常骨代替，从而最终恢复正常形 状和强度。因此，骨修复不是由骨性联接而是由在骨性联接后骨折部位的形状来完成，骨胶 原回收，即骨痂重塑的进程，对于骨折部位机械性恢复是重要的。
[0007] 另一方面，虽然在活体生长的骨生长过程中也形成骨，但这是不同于骨修复过程 的生理学现象。在长骨的生长中，在骨骺部分重复软骨形成并及其被骨的代替，骨生长。在 骨干与骨骺之间有生长板软骨（骨骺软骨），根据软骨细胞的分化阶段，可将生长板软骨自 关节软骨表面向骨干分类为休眠软骨细胞、增殖软骨细胞和肥大软骨细胞三层。长骨以两 种方式生长，即其中存在于关节侧的前体细胞分化为休眠软骨细胞的外加生长，和其中增 殖软骨细胞在增殖同时生长的内加生长。增殖软骨细胞在某个部位一起增大，变成肥大软 骨细胞。在肥大软骨细胞周围的软骨基质中，出现基质小泡，小泡充当软骨钙化的起始点。 钙化的软骨基质被消化和吸收。此时，在软骨与骨之间的边界部分，血管侵入其中已C存肥 大软骨细胞的软骨腔隙，而且破坏和吸收软骨的破软骨细胞出现在边界部分，钙化的软骨 基质被吸收，肥大软骨细胞本身也分泌基质金属蛋白酶比如MMP-3和MMP-13,作为其结果， 软骨基质降解。破软骨细胞出现，稍后成骨细胞侵入软骨基质以形成初级小梁。如上文描 述，血管和破软骨细胞侵入软骨腔隙内、钙化的软骨基质降解以及骨基质通过成骨细胞加 入消失的软骨基质中的缝隙内，连续进行，骨骺中软骨增加，然后软骨被骨代替，从而长骨 生长。当成熟时，骨生长需要的生长板骨化并消失（非专利文献3)。
[0008] C-型利尿钠肽（CNP)是作用于软骨细胞的肽激素，在骨生长中发挥重要作用（非 专利文献4、非专利文献5等）。利尿钠肽是一系列肽激素的通称，所述肽激素与包括鸟苷 酸环化酶的利尿钠肽受体特异性结合，激活鸟苷酸环化酶，调节细胞内cGMP水平，从而表 达各种生物活性。
[0009] 在哺乳动物中，主要已知三种利尿钠肽：心房利尿钠肽（ANP)、脑利尿钠肽（BNP) 和CNP 15ANP和BNP是NPR-A (利尿钠肽受体-A，也称为：GC-A)的激动剂，主要在调节体 液容积中发挥作用，在临床上已被用作心力衰竭的治疗药物。
[0010] CNP在1990年首次在大脑中发现，起初认为CNP发挥颅神经肽的功能，然而后来， 变得显然的是CNP也存在于末梢（periphery)。在早期的基础研究中，报道了其在软骨以外 的成骨细胞中表达及其对骨再吸收的作用（非专利文献6和非专利文献7)。至于CNP的体 内生理学作用，根据先前的研究，已报道：CNP敲除小鼠主要因骨骼异常所致而表现出明显 的生长停滞，通过与软骨特异性CNP转基因小鼠杂交挽救该表型（非专利文献4);在连续 静脉内给予CNP-22的正常小鼠以及全身性和软骨特异性CNP转基因小鼠中促进生长板软 骨的增殖和促进骨生长（非专利文献5和非专利文献8)等。已证实CNP在骨生长期间的 软骨形成中，特别是在生长板软骨中发挥非常重要的作用。
[0011] 在CNP转基因小鼠中，体长随着长骨在主要轴向方向的过度生长而变长。在此类 小鼠中，根据对生长板的组织化学分析，已证实：1)生长板因增殖软骨细胞层和肥大软骨 细胞层的生长所致而变厚；2)增殖软骨细胞层的细胞外基质增加；和3)成熟肥大软骨细胞 的大小增加。除了这些事实以外，因为在所述小鼠生长板中通过肥大软骨细胞层中的BrdU 染色所显示的软骨细胞的增殖方面尚未观察到明显改变，所以认为CNP并非在生长板中促 成软骨细胞的分化或增殖，而是在生长板各个分化阶段中促进软骨细胞的分化表型的表达 (非专利文献8)。
[0012] 根据这些发现，CNP预期在发育或生长过程中发挥改善软骨发育不良的作用，还预 期有可能临床用作针对包括软骨发育不全在内的矮小症的治疗药物（非专利文献9)。此 夕卜，在非专利文献10中，已报道包含于关节软骨中的软骨细胞由CNP控制分化。
[0013] 如上文描述，公认为CNP对骨/软骨的作用是控制涉及骨生长中的生长板或关节 软骨的软骨形成，尚无关于在经历不同于骨生长的过程的骨折或骨切断的愈合中对骨修复 过程的作用的报道。
[0014] 至今已进行多种关于将某些体液因子应用于骨修复的研究。例如，已经有力地进 行旨在通过局部给予细胞生长因子比如骨形态发生因子（BMP)或碱性成纤维细胞生长因 子（bFGF)促进骨修复的研究。已报道bFGF具有增加骨痂的作用，在临床试验中通过直接给 予至骨折位点，缩短治疗期（非专利文献11)。但是，在动物实验中，证实对骨密度和机械性 强度无影响，视为不直接促进骨性联接。另外，已报道将低剂量的已知具有激活成骨细胞作 用的甲状腺激素（PTH)间歇式地给予全身，可明显增加骨痂的骨密度和机械性强度，但是， 已知PTH激活破骨细胞的作用，进一步指出了加重症状的可能性（非专利文献12)。此外， 还要注意产生诸如骨肉瘤等副作用的可能性（非专利文献13)。如上文描述，在骨修复中表 现出充分作用和效应的骨修复促进药物尚未投入实际使用，期望发现或研发一种新药。
[0015] 引用目录 非专利文献 非专利文献 I: Schindeler A等，Semin Cell Dev Biol, (2008)，19卷，5 期， 459-466 页 非专利文献2: Ohishi M等，J Cell Biochem.，（2010)，109卷，2期，277-282 页 非专利文献 3: Emons J 等，Horm Res Paediatr.，（2011)，75 卷，6 期，383-91 页 非专利文献4: Chusho H等，Proc Nat Acad Sci.，（2001)，98卷，7期，4016-4021 页 非专利文献 5: Yasoda A 等，Nat Med.，（2004)，10 卷，1 期，80-86 页 非专利文献6: Suda M等，Biochem Biophys Res Commun.，（1996)，223卷，1 期， 1-6页 非专利文献 7: Holiday LS 等，J Biol Chem.，（1995)，270 卷，32 期， 18983-18989 页 非专利文献 8: Kake T等，Am J Physiol Endocrinol Metab.，（2009)，297 卷，6 期，E1339-E1348 页 非专利文献 9: Yasoda A 等，Endocrinology, (2009)，150 卷，7 期，3138-3144 页 非专利文献 10: STEPHEN DW 等，Tissue Engineering: Part A, (2008)，14 卷，3 期，441-448 页 非专利文献 11: Kawaguchi H 等，J Bone Miner Res.，（2010)，25 卷，12 期， 2735-2743 页 非专利文献 12: Horwitz MJ等，J Bone Miner Res., (2011)，26 卷，9 期， 2287-2297 页 非专利文献 13: Vahle JL 等，Toxicol Pathol·, (2002)，30 卷，12 期，312-321 页 发明概述 技术问题 本发明的目的在于提供用于促进由骨折愈合代表的骨修复机制的药剂。
[0016] 问题的解决方案 作为对促进骨折愈合过程中的骨修复的药物的深入研究的结果，本发明人发现通过反 复皮下给予CNP衍生物至骨折模型大鼠，骨折部位的机械性强度与未给予药物组相比在更 早的时间点恢复至骨折之前的状态等。本发明人基于这些发现进一步研究，从而完成本发 明。
[0017] 本发明提供下列发明。
[0018] (1)提供骨修复促进剂，其含有至少一种利尿钠肽受体NPR-B激动剂作为活性成 分。
[0019] (2) (1)的骨修复促进剂，其中NPR-B激动剂是C-型利尿钠肽（CNP)或其活性片 段；或其突变体、其衍生物或其修饰体；或者抗利尿钠肽受体NPR-B抗体。
[0020] (3) (1)的骨修复促进剂，其中NPR-B激动剂是hCNP-22 (SEQ ID NO: 1)、 hCNP6-22 (SEQ ID NO: 1 的氨基酸号 6 至 22)或 hCNP-53 (SEQ ID NO: 2);或其突变体、 其衍生物或其修饰体。
[0021] (4) (1)的骨修复促进剂，其中NPR-B激动剂是hCNP-22或hCNP6-22的衍生物或 修饰体。
[0022] (5) (2)至⑷中任一项的骨修复促进剂，其中衍生物是这样的衍生物，其中选自 由免疫球蛋白Fc区衍生的肽、血清白蛋白和在生长素释放肽C-端侧的部分肽的至少一种 附加肽结合至hCNP-22或hCNP6-22的N-端、C端或者其两端。
[0023] (6) (5)的骨修复促进剂，其中衍生物由其中自SEQ ID NO: 2的N端缺失1个以 上至30个以下的连续氨基酸的氨基酸序列或者选自SEQ ID NO: 6至15的氨基酸序列组 成。
[0024] (7) (2)至⑷中任一项的骨修复促进剂，其中修饰体是这样的修饰体，其中PEG 或其类似亲水聚合物结合至hCNP-22、hCNP6-22或hCNP-53的N端、C端或其两端。
[0025] (8) (1)的骨修复促进剂，其中NPR-B激动剂是SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 2的 氨基酸号18至53、SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 15中的任一个氨基酸序列组成的肽。
[0026] (9) (1)至（8)中任一项的骨修复促进剂，其中骨损伤部位中直至骨修复的时间 段缩短。
[0027] (10) (1)至（8)中任一项的骨修复促进剂，其中在骨修复后骨组织的骨强度和/ 或连续性恢复至等同于未骨折的骨中相应部位的水平。
[0028] (11) (1)至（8)中任一项的骨修复促进剂，其中通过在骨修复的骨痂形成阶段给 予骨修复促进剂和在骨痂形成的后期或者形成完成之后停止给予而实现促进骨修复。
[0029] (12) (1)至（11)中任一项的骨修复促进剂，其用于治疗骨折。
[0030] 此外，本发明将提供促进骨修复的方法(其中使用上述（1)至（12)中任一项的骨 修复促进剂)、用作骨修复促进剂的活性成分的NPR-B激动剂或其用途，即以下发明。
[0031] (13) -种促进骨修复的方法，其包括将有效量的NPR-B激动剂给予需要骨修复 的受试者。
[0032] (14) -种治疗骨折的方法，其包含将有效量的NPR-B激动剂给予骨折患者。
[0033] (15) -种NPR-B激动剂，其用于在需要骨修复的受试者中促进骨修复。
[0034] (16) (15)的NPR-B激动剂，其用于治疗骨折患者的骨折。
[0035] 发明的有益效果 本发明的NPR-B激动剂具有通过促进骨折愈合过程的骨修复缩短骨折治疗期的作用。 此外，通过使修复后的骨强度恢复至等同于骨折之前的水平，改善治疗的预后，此外，再骨 折的风险小。
[0036] 附图简述 图1显示给予药物后8周大鼠骨折模型的股骨软X射线图像。上部分（第1组）是对 照组，中间部分（第2组）是其中以10 nmol/kg给予CNP衍生物A的组，下部分（第3组） 是其中以100 nmol/kg给予CNP衍生物A的组。通过从左边开始以RL的顺序排列来显示 每组10个模型中各个体的左和右股骨。R是未处理的右股骨，L是已向其实施了骨折手术 的左股骨。
[0037] 图2是显示在大鼠闭合式股骨骨折模型中骨折治疗后4周的股骨强度的图。阴影 线条图代表媒介物给予组，黑线条图代表CNP衍生物A给予组，R是未处理的右股骨，L是已 实施骨折治疗的左股骨。此外，垂直轴显示骨的硬度（N X mm/deg)。
[0038] 图3显示这样的直方图，其显示在图2所显示的骨强度测量值的分布。3A显示未 处理的右股骨的结果，3B显示已实施骨折治疗的左股骨的结果。阴影线条图代表媒介物给 予组，黑线条图代表向其给予CNP衍生物的组。水平轴显示硬度的水平（N X _/deg)，垂 直轴显示属于各种硬度水平的例数。
[0039] 图4显示这样的图，其显示在大鼠闭合式股骨骨折模型中骨折治疗后1周在股骨 中各基因（4A: sox9基因，4B: II型胶原基因，4C: X型胶原基因）的表达水平。阴影 线条图代表媒介物给予组，黑线条图代表CNP衍生物A给予组。"假手术"显示已实施假手 术治疗的大鼠左股骨的结果，"骨折"显示已实施骨折治疗的大鼠左股骨的结果。垂直轴显 示通过泛素 C的mRNA表达水平标化的各基因 mRNA表达水平。
[0040] 图5显示各种NPR-B激动剂在大鼠闭合式股骨骨折模型中的作用（5A:血液CGMP 水平，5B:已对其实施了骨折治疗的左股骨的骨折部位的骨痂直径，5C:已对其实施了 骨折治疗的股骨中X型胶原基因表达水平）。在所有图中，阴影线条图代表媒介物给予组， 黑线条图代表给予NPR-B激动剂的组（从左边起：CNP衍生物A、hCNP-53、CNP衍生物C和 CNP衍生物D)。
[0041] 在图5A中，垂直轴显示血液中cGMP水平。在图5B中，垂直轴显示骨痂的直径 (mm)。在图5C中，垂直轴显示通过泛素 C mRNA表达水平标化的X型胶原基因 mRNA的表达 水平。
[0042] 实施方案的说明 在本发明中，"利尿钠肽受体NPR-B激动剂"意指与B-型利尿钠肽受体（利尿钠肽受 体-B，也称为：鸟苷酸环化酶B (GC-B)，有时称为"NPR-B"）结合并具有激活其鸟苷酸环化 酶的作用（下文，"NPR-B激动剂活性"）的物质，有时简称为"NPR-B激动剂"。代表性NPR-B 激动剂的实例包括例如C-型利尿钠肽（CNP)。本发明的NPR-B激动剂无特殊限定，只要 NPR-B激动剂是具有NPR-B激动剂活性的物质，可使用CNP和其活性片段、其突变体、其衍 生物、其修饰体等。此外，本发明的激动剂包括与CNP不具有结构相似性的肽或小分子化合 物，只要此类物质具有NPR-B激动剂活性。
[0043] 本发明CNP的实例包括由22个氨基酸组成的人衍生的CNP-22 (hCNP-22: GLSKGCFGLK LDRIGSMSGL GC: SEQ ID NO: 1，其具有哺乳动物比如猪和大鼠的共同氨基酸 序列）、人衍生的 CNP-53 (hCNP-53,氨基酸序列：DLRVDTKSRA AWARLLQEHP NARKYKGANK KGLSKGCFGL KLDRIGSMSG LGC: SEQ ID NO: 2)、鸡衍生的CNP-22 (GLSRSCFGVK LDRIGSMSGL GC: SEQ ID NO: 3)和蛙衍生的 CNP-22 (GYSRGCFGVK LDRIGAFSGL GC: SEQ ID NO: 4)。
[0044] 认为在各种类型的CNP中，由包含于序列中的2个C残基之间的二硫键所形成 的环结构（例如，在hCNP-22中，在SEQ ID NO: 1的6位C与22位C之间形成二硫键， 形成环结构）对于与NPR-B受体结合和活性重要（Furuya, M.等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，（1992)，183，3 期，964-969 页；Silver, MA, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. , (2006), 15, 14-21 页; 和 Calderone, A. , Minerva Endocrinol., (2004)，29，113-127页）。根据Furuya等的报道，已报道CNP6-22 (其为仅由环结构组 成的肽（由SEQ ID NO: 1的氨基酸号6至22组成的肽）），或者甚至是其中将ANP环结构 N-端侧序列和C-端侧序列分别添加至环结构的N端和C端的肽，显示与hCNP-22几乎相同 的NPR-B激动剂活性。该报道还显示在hCNP-22的9位L和10位K具有突变的肽减弱活 性，但在除以上2处以外的位置（例如16位S和17位M)具有突变的肽，和其中ANP的10 至12位的氨基酸序列取代为L-K-L (其为hCNP-22的相应序列（SEQ ID NO: 1的9至11 位））的肽，显示与hCNP-22几乎相同的NPR-B激动剂活性等。根据这些发现，对于NPR-B 激动剂活性而言重要的环结构氨基酸序列是CFGLKLDRIG-Xaal-Xaa2-SGLGC (这里，Xaal 代表S或A, Xaa2代表M、F或E; SEQ ID NO: 5)，该序列称为"环结构序列"。
[0045] 在本发明中，具有生物学活性的肽或蛋白的"活性片段"意指由与肽或蛋白的生物 学活性相关的区域组成并保留至少部分的肽或蛋白所具备的生物学活性的活性片段。由 SEQ ID NO: 1至4中任一个的氨基酸序列的至少部分氨基酸序列组成并具有NPR-B激动剂 活性的肽可用作本发明CNP的活性片段。活性片段的实例包括由上述环结构序列（SEQ ID NO: 5的氨基酸序列）组成的肽，具体实例包括hCNP6-22; SEQIDN0: 1、3或4的肽，其中 氨基酸序列1至5位的一些或全部氨基酸缺失，其中所述缺失包括含有1位的连续氨基酸； 和SEQ ID NO: 2的肽，其中氨基酸序列1至31位的一些或全部氨基酸缺失，其中所述缺失 包括含有1位的连续氨基酸，然而，活性片段不限于此，任何具有环结构序列和NPR-B激动 剂活性的活性片段都可用作本发明的CNP活性片段。
[0046] 作为本发明的NPR-B激动剂，可使用上述活性片段本身，此外，也可使用肽例如活 性片段的衍生物，只要它保留预期的激动剂活性，其中将一个或更多个氨基酸添加至活性 片段的N端、C端或其两端。此类肽的实例可包括其中将从ANP的C端和N端衍生的序列 添加至 hCNP6_22 的 N 端、C 端或其两端的肽（Furuya, M.等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，（1992)，183，3 期，964-969 页）。
[0047] 在本发明中，具有生物学活性的肽或蛋白的"突变体"意指其中在肽或蛋白的氨基 酸序列中一个至几个区域中的一个至几个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加（在下文称 为"取代等"）并且保留至少部分的肽或蛋白所具备的生物学活性的突变体。"几个区域"通 常意指3个区域，优选2个区域。"几个氨基酸"通常意指10个氨基酸，优选5个氨基酸， 更优选3个氨基酸，甚至更优选2个氨基酸。在多个区域进行取代等的情况下，可以进行取 代、缺失、插入和添加中仅任一种，或者可进行取代、缺失、插入和添加中的两种或更多种的 组合。此外，用于取代等的氨基酸可以是天然存在的氨基酸，可以是修饰体比如酰化形式的 天然存在的氨基酸，或者可以是人工合成的氨基酸类似物。另外，只要保留原肽或蛋白的部 分活性，可以选择其中进行了取代等的任何区域，但优选对其进行取代等的区域是原肽或 蛋白的活性区域或受体结合区域以外的区域。
[0048] 例如，作为CNP突变体，可采用其中在任何区域已进行取代等的突变体，只要保留 NPR-B激动剂活性，但CNP突变体优选包括其中保留上述环结构序列并且在环结构序列区 域以外的区域已进行取代等的肽。具体的CNP突变体可以是其中在描述于SEQ ID NO: 1 至4的氨基酸序列中预期的一个或更多个区域内可进行一个至几个氨基酸的取代等的突 变体，只要具备NPR-B激动剂活性，但是其可优选为其中在描述于SEQ ID NO : 1至4的任一 个的氨基酸序列中除了 SEQ ID NO :5中所显示的氨基酸以外的氨基酸处的一个至几个区 域内进行一个至几个氨基酸的取代等的突变体，可更优选其中在描述于SEQ ID NO :1、3或 4的氨基酸序列的1至5位处的一个至几个区域内进行一个至几个氨基酸的取代等的突变 体，或者其中在描述于SEQ ID NO :2的氨基酸序列的1至31位处的一个至几个区域内进行 一个至几个氨基酸的取代等的突变体。
[0049] 作为本发明的NPR-B激动剂，可采用上述突变体本身，此外，还可以采用肽比如突 变体的衍生物，其中将一个或更多个氨基酸加至突变体的N端、C端或其两端，只要保留预 期的激动剂活性。
[0050] 作为CNP突变体的具体实例，有报道：在hCNP-22的17位和18位带有突变的肽 具有与hCNP-22相同的NPR-B激动剂活性；甚至在其中这类突变体的环结构元件的N端和 C端被由ANP衍生的序列置换的突变体的衍生物中，已显示NPR-B激动剂活性为hCNP-22 活性的约90% ;在9至11位任一位带有突变的肽显示hCNP-22的50%以上的NPR-B激动剂 活性；在10和11位都带有突变的肽具有hCNP-22的40%以上的NPR-B激动剂活性；等等 (Furuya, M.等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，（1992)，183，3期，964-969页）。 此外，在另一份参考文献中，已描述各种hCNP-22突变体保留NPR-B激动剂活性；并进一步 具有对由中性内肽酶（NEP)产生的裂解的耐受性，所述中性内肽酶是CNP分解代谢酶；等等 (W0 2009/067639 小册子）。
[0051] 在本发明中，具有生物学活性的肽或蛋白的"衍生物"意指这样的融合肽，其包含 肽或蛋白的氨基酸序列，所述肽或蛋白上另外添加了另一种肽或蛋白，并且保留了至少部 分的该生物活性肽或蛋白所具备的生物学活性。具有至少部分此类生物学活性（在本发明 中，结合NPR-B并激活鸟苷酸环化酶的作用）的融合肽也称为生物活性肽的衍生物。在本 发明的衍生物中，附加肽可融合于原生物活性肽或蛋白的C端或N端之一，或者附加肽可融 合于原生物活性肽或蛋白的C端和N端两端。作为待添加的肽，肽无特殊限定，但是优选不 具有自身生物活性的肽。此外，附加肽可以直接键合，或者可以通过由一个至几个氨基酸组 成的连接序列键合。作为连接序列，已知各种连接系列，但是经常使用含有许多G、S等的连 接序列。此类附加肽的实例包括免疫球蛋白（优选IgG)的Fc区、血清白蛋白和来自生长 素释放肽C-端侧的部分序列。用作本发明NPR-B激动剂的衍生物的实例可包括CNP (优选 hCNP-22或hCNP-53)的衍生物和CNP活性片段（优选hCNP6-22)的衍生物，优选hCNP-22 的衍生物或者hCNP6-22的衍生物。
[0052] CNP衍生物的具体实例可包括例如公开于美国专利申请US 2010-305031公布内 容中的各种CNP衍生物（美国专利申请公布内容中的SEQ ID NO: 109、110、124至130、157 和158)。在该文中，已报道在其中将从生长素释放肽C-端侧衍生的部分序列添加至生物 活性肽比如ANP、CNP和促胃动素的衍生物中，在保留原肽的生物活性的同时改善了血液半 衰期。在该报道中，在任何其中将含有从生长素释放肽C端衍生的W k-X1-Y-Zm-Wn (这里，W 代表碱性氨基酸比如Lys和Arg ;Y代表酸性氨基酸比如Asp和Glu ;X和Z相同或相互不 同，可以是除了酸性氨基酸和碱性氨基酸以外的任何氨基酸；k和η相互独立，是整数1或 2 ;1和m相互独立，是自然数0、1或2 ;此类序列的实例优选包括RKESKK、RKDSKK、RKSEKK 和RKSDKK)的肽添加至CNP的N端或C端或者其两端的各种衍生物中，也保留NPR-B激动 剂活性，并且延长血液半衰期。该公布内容的描述结合到本说明书的描述中。
[0053] 此外，作为CNP或CNP活性片段的衍生物，甚至在其中将ANP的C-端部分添加至 hCNP-22 C-端的肽，或者其中将ANP的N-端部分和C-端部分加至hCNP6-22 (CNP活性片 段的衍生物）的N端和C端的肽中，保留具有与hCNP-22大致相同的程度的NPR-B激动剂 活性（Furuya, M.等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，（1992)，183，3 期，964-969 页）。此外，在另一份参考文献中，已描述hCNP-22和hCNP-53的各种衍生物保留NPR-B激动 剂活性；此外在各种衍生物中多种衍生物具有NEP降解耐受性；等等（W0 2009/067639小 册子）。而且，在描述于该WO 2009/067639小册子的衍生物中，已报道定义为本说明书中的 CNP衍生物D、由SEQ ID NO :15的氨基酸序列组成的衍生物对小鼠软骨发育不全模型的药 理学作用（Florence L.等·，Am. J. Hum. Genet.，（2012)，91 (6)，1108-1114 页：正 文：http://www. sciencedirect. com/science/article/pii/S000292971200537X:补充： http://download, cell. com/AJHG/mmcs/journals/0002-9297/PIIS000292971200537X. mmcl. pdf) 〇
[0054] 本发明的CNP-22衍生物的实例包括由其中自N端连续的I个以上至30个以下氨 基酸从CNP-53氨基酸序列（SEQ ID NO: 2)中缺失的氨基酸序列组成的肽。此类衍生物优 选由自 hCNP-53 (SEQIDN0: 2) N 端连续的 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24或25个氨基酸缺失的氨基酸序列组成的肽，更优选hCNP-36,其中来自hCNP-53 N端 的17个连续氨基酸缺失（由SEQ ID NO: 2的氨基酸号18至53的氨基酸序列组成的肽， CNP衍生物C)。
[0055] 这些各种CNP衍生物和CNP活性片段的衍生物可优选用作本发明的NPR-B激动 齐U。本发明的NPR-B激动剂更优选为由其中来自N端的1个以上至30个以下（优选25个 以下，更优选20个以下）连续氨基酸从SEQ ID N0:2中缺失的氨基酸序列组成的衍生物，或 者任何选自SEQ ID NO: 6至15的衍生物；而且优选CNP衍生物A (SEQ ID NO: 13)、CNP 衍生物C (SEQ ID NO: 2的氨基酸号18至53)，或者CNP衍生物D (SEQ ID NO: 15)。
[0056] 在本发明中，具有生物学活性的肽或蛋白的"修饰体"意指这样的修饰体，其中通 过与另一种化学物质的化学反应修饰包含于肽或蛋白中的氨基酸的一个至几个区域，此外 在此类修饰体中保留至少部分的肽或蛋白所具备的生物学活性。只要在此类修饰体中保留 原肽或蛋白的活性，任何区域可选作为进行修饰的区域。例如，在其中化学物质大至某种程 度比如聚合物的修饰体中，优选在肽或蛋白的除开活性区域或受体结合部位以外的区域进 行修饰。另外，在用于防止被分解代谢酶裂解的修饰的情况下，优选在裂解位点进行修饰。
[0057] 例如，只要具备NPR-B激动剂活性，CNP的修饰体可以是其中在SEQ ID NO: 1至 4中任一个的氨基酸序列中预期的一个或更多个区域被修饰的修饰体，但是优选其中在SEQ ID N0:1至4中任一个的氨基酸序列中，在除了 SEQ ID N0:5显示的氨基酸以外的氨基酸中 的一个至几个区域被修饰的修饰体，更优选其中在SEQ ID NO :1、3或4的氨基酸序列的1 至5位处的一个至几个区域被修饰的修饰体。此外，在赋予抗NEP裂解的耐受性的修饰的 情况下，已知NEP在环结构中SEQ ID NO :5的1位C与2位F之间的位点裂解CNP，该位点 包含于各种CNP肽内，因此，可修饰该区域。
[0058] 此外，上述CNP活性片段、CNP突变体及其衍生物的修饰体也包括于本发明中。只 要此类各种修饰体保留NPR-B激动剂活性，它们也可用于本发明。
[0059] 作为化学修饰的方法，已知多种方法，例如已知添加用于制药技术（药理学上使 用）的高分子量聚合物比如聚乙二醇（PEG)和聚乙烯醇（PVA)的方法；其中将作为连接体 的化合物添加至侧链中的氨基比如K残基，经由该连接体键合另一种蛋白等（例如血清白 蛋白）的方法；等等。但是，方法不限于此，可采用多种方法。
[0060] 作为CNP、其活性片段、其突变体及其衍生物的这类修饰体的具体实例，例如 在TO 2009/067639小册子中公开其中将各种类型的水性聚合物比如PEG与hCNP-22 和hCNP-53键合的修饰体，和其中Cys6-Phe7的肽键（hCNP-22中的NEP裂解位点） 被-CH 2-NH-、-C(=0)-N(R)-(其中R代表低级烷基比如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、 异丁基、仲丁基或叔丁基）的假肽键取代的多重修饰体，等等保留NPR-B激动剂活性，其中 许多具有比hCNP-22更改善的血液半衰期。此外，至于各种生物活性肽的修饰体的制备方 法，例如可以参考美国专利申请US 2009-0175821等的公开内容适当制备修饰体。
[0061] 环结构对于CNP和NPR-B受体的结合是重要的。因此，特别是在其中附加肽或部 分键合至其末端部分的衍生物或修饰体中，此类附加肽或部分影响环结构较少，可在充足 程度上预期衍生物或修饰体保留NPR-B激动剂活性，而不抑制与NPR-B受体结合。这得到 上述许多参考文献的支持。
[0062] 上述CNP或其活性片段；或其突变体、其衍生物及其修饰体可以是从天然细胞或 组织收集的那些，可以是通过使用遗传工程或细胞工程技术制备的那些，可以是化学合成 的那些，或者可以是其中将如上获得的那些经酶处理或者化学处理以修饰氨基酸残基或者 除去部分氨基酸序列的那些。这些物质可以根据常规方法参考本说明书及引用文献的描述 而适当地制备。
[0063] 可通过本领域技术人员已知的常规方法容易地测量某种物质是否具有NPR-B 激动剂活性。具体来讲，所述方法是将物质加至其中强制表达NPR-B(Suga S.等， Endocrinology，（1992)，130 (1)，229-239页）的培养细胞中，测量培养细胞的胞内 cGMP水平。描述"保留部分NPR-B激动剂活性"意指当在同一试验中测量NPR-B激动剂物 质和CNP的NPR-B激动剂活性时，NPR-B激动剂物质增加 cGMP活性的峰值保留CNP的峰值 的至少10%以上，优选保留30%以上，更优选50%以上，甚至更优选70%以上。此外，即使 NPR-B激动剂物质的活性在其峰值无明显增加，当给予活体时在活性持续时间和血液半衰 期方面显示有利结果的物质也可用于本发明。
[0064] 此外，即使不具有与利尿钠肽共有的结构的化合物（例如小分子化合物），只要其 为当加入上述测试方法时，引起产生cGMP的能力得到改善的化合物，也可在本发明中用作 在NPR-B激动剂。
[0065] 此外，根据本领域的普通知识通过上述方法从由用含有NPR-B配体结合位点的抗 原蛋白免疫动物而制备的抗NPR-B抗体中筛选具有NPR-B激动剂活性的抗体。由此制备的 具有NPR-B激动剂活性的抗-NPR-B抗体也可用作本发明的NPR-B激动剂。另外，可将由此 使用的抗体制备成各种已知形式，即通过免疫原性动物制备的抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗 体、人源化抗体、完全全人抗体等。可使用基于上述抗体制备的抗体片段比如Fab和scFv。
[0066] 本发明的NPR-B激动剂实例优选包括CNP、具有其环结构序列的活性片段，或者 其中在环结构序列以外的序列中进行取代等的突变体，或其衍生物或修饰体；更优选包括 hCNP-22、hCNP-53、hCNP6-22、其衍生物或其修饰体；甚至更优选包括hCNP-53、CNP衍生物A (CNP(l-22)生长素释放肽（12-28，E17D) :SEQIDN0:13)、CNP衍生物B(CNP(l-22)生 长素释放肽（12-28) :SEQ ID NO: 8)、CNP衍生物C (SEQ ID NO: 2的氨基酸号18至53)、 CNP衍生物D (SEQ ID NO: 15)，及其部分肽。
[0067] 上述NPR-B激动剂用作骨修复促进剂的活性成分。"骨修复促进剂"意指具有加速 或促进在骨折、截骨手术、骨延长手术、骨移植手术等中受损骨组织的修复进程的作用的作 用剂。通过使用骨修复促进剂的作用，缩短骨组织的修复时间，或者使修复后的骨强度恢复 直至骨折前的水平，可避免再骨折的风险，可减少受试患者的负担。
[0068] 向其施用本发明药用组合物的受试者无特殊限制，只要其是具有在除了只通过膜 内骨化形成的骨比如颅骨等以外的骨中受损骨组织的患者。只要其是这样的骨，可将药用 组合物施用于任何部位的受损骨，所述骨优选为头部分（眼眶骨、颧骨和下颚骨）、躯干部 分（肋骨、髋骨、颈椎骨、胸椎、腰椎、骶骨和尾骨）、上肢（肩胛骨、锁骨、肱骨、肘部、桡骨、 尺骨、舟骨、钩骨、掌骨和趾骨）或下肢（髋关节、股骨、胫骨、腓骨、足关节、跟骨、舟骨和跖 骨），更优选股骨、肱骨或肋骨。此外，骨组织的损伤形式无具体限制，例如可提到在截骨术 或骨延长手术中已被切开的骨的骨性联接、骨折（骨的断裂、裂化、粉碎性骨折、复杂性骨 折等）的治疗等。
[0069] 可用作本发明药用组合物的活性成分的物质可以是上述NPR-B激动剂的药学上 可接受的盐。也就是说，在本发明中，上述NPR-B激动剂的无机酸（例如盐酸、硫酸或磷酸） 或有机酸（例如甲酸、乙酸、丁酸、琥珀酸、柠檬酸等）的酸加成盐也可用作活性成分。备选 地，在本发明中，上述物质的金属（钠、钾、锂、钙等）盐或者与有机碱的盐的形式也可用作 活性成分。此外，本发明的药用组合物可包含游离形式的根据活性成分的物质或其药学上 可接受的盐。
[0070] 本发明的药用组合物包含NPR-B激动剂或其药学上可接受的盐作为活性成分，此 外通过使用在普通配制期间所使用载体、赋形剂、其它添加剂、稀释剂等来制备。配制的载 体或赋形剂的实例包括例如乳糖、硬脂酸镁、淀粉、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、橄榄 油、麻油、可可脂、乙二醇及其它常用的载体或赋形剂。
[0071] 作为口服给予的固体组合物，使用片剂、丸剂、胶囊、散剂、粒剂等。在此类固体组 合物中，将至少一种活性成分与至少一种非活性稀释剂例如乳糖、甘露醇、葡萄糖、羟丙基 纤维素、微晶纤维素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、偏硅酸铝镁等混合。根据常规方法，组合物可 包含除非活性稀释剂以外的添加剂，例如润滑剂比如硬脂酸镁、崩解剂比如乙醇酸钙纤维 素和增溶剂比如谷氨酸或天冬氨酸。可将片剂或丸剂根据需要用糖衣比如蔗糖、明胶或羟 丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，或者胃溶或肠溶物制成的膜来包衣，或者可用两层以上包 衣。此外，还包括用可吸收的物质比如明胶制成的胶囊。
[0072] 口服给予的液体组合物包含药学上可接受的乳化剂、溶液剂、助悬剂、糖浆剂、酏 剂等，可另外包含常用的非活性稀释剂，例如纯净水、乙醇等。该组合物可包含辅剂比如湿 润剂、除了非活性稀释剂以外的助悬剂；甜味剂；香料；芳香剂；防腐剂等。
[0073] 作为胃肠外给予的注射剂，包括在无菌和含水形式或无水形式下的溶液剂、助 悬剂和乳化剂。作为含水溶液剂或助悬剂，包括例如注射溶剂和可注射的盐水溶液。作 为无水溶液剂和助悬剂，包括例如丙二醇、聚乙二醇、植物油比如橄榄油、醇比如乙醇、 Polysorbate 80 (注册商标）等。此类组合物可另外包含辅剂比如防腐剂、湿润剂、乳化 齐?、分散剂、稳定剂（例如乳糖）和增溶剂（例如谷氨酸和天冬氨酸）。可将这些例如通过 用微滤膜过滤除菌、热灭菌比如高压蒸汽灭菌或者混合杀菌剂的常用灭菌方法等灭菌。注 射剂可以是溶液制剂，或者可以是在使用前溶解和重构的冻干制剂。作为冻干用的赋形剂， 可使用例如糖醇比如甘露醇或者葡萄糖或糖类。
[0074] 本发明的药用组合物优选通过常用于药物的给予方法，例如口服给予法；或者跨 黏膜给予、静脉内给予、肌内给予、皮下给予等的胃肠外给予方法来给予。在活性成分是 NPR-B激动剂抗体的情况下，本发明的药用组合物通常经由胃肠外途径给予，例如经注射 (皮下注射、静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射等）、经皮肤、经黏膜、经鼻、经肺等给予，但 是也可口服给予。
[0075] 在活性成分是肽类物质的情况下，本发明的药用组合物也可作为在消化道中较不 容易降解的药用制剂口服给予，例如作为其中将作为活性成分的肽封闭在核糖体内的微胶 囊制剂口服给予。此外，还可使用其中经由消化道以外的直肠、鼻、舌下等黏膜吸收本发明 药用组合物的给予方法。在这种情况下，可将本发明的药用组合物以栓剂、喷鼻剂、吸入剂 或舌下片剂的形式给予个体。
[0076] 可用作本发明药用组合物活性成分的物质的剂量根据疾病类型；个体（患者）的 年龄和体重；症状程度；和给予途径而变化，但是，例如约100 mg/kg以下,优选约50 mg/kg 以下，更优选5 mg/kg以下，通常作为每天剂量的上限。此外，作为每天剂量的下限，剂量是 例如约0. 005 yg/kg以上，优选0. 025 yg/kg以上，更优选0. I yg/kg以上。
[0077] 在本发明中CNP的剂量根据受试个体的体重、待治疗的疾病、症状等而变化，但 是，在局部给予时组织水平为约KT 15 M至KT6 M水平，优选约KT12 M至KT8 M水平。对于 全身给予，在本发明中CNP的剂量为约0.01 μ g/头至10000 μ g/头水平，优选1 μ g/头 至5000 μ g/头水平。
[0078] 本发明的骨修复促进剂可通过在骨的修复阶段给予至少一段时间直至充分形成 骨痂，然后停止给予而达到充分促进骨折修复或者对骨折的治疗效果。本发明提供此类治 疗方法、特征为在该方法给予的骨修复促进剂等。已发现NPR-B激动剂至少促进骨痂形成， 从而在骨修复过程中促进受损骨的修复。认为在该过程中，NPR-B激动剂抑制骨受损部位 中软骨细胞肥大，由此维持软骨细胞的增殖期，从而增加软骨细胞的数量，增加软骨细胞产 生的软骨基质的量，然后促进骨痂形成。从这种机制的角度来看，认为从骨损伤治疗开始给 予本发明的NPR-B激动剂直至骨痂充分形成时，从而可充分实现骨修复促进作用，因此认 为在骨痂充分形成阶段，可停止给予所述促进剂。在骨受损部位形成骨痂的时间根据骨损 伤的部位、损伤的状况、患者的愈合能力等而变化。可依据受伤部分的X射线图像来确定骨 痂的形成状态，因此，规律地观察和监测受伤部分的X射线图像，然后优选确定停止给予的 时间。
[0079] 本发明的药用组合物可与另一种骨形成促进剂、骨再吸收抑制剂或骨折治疗剂组 合使用。待组合的作用剂的实例包括例如二膦酸盐剂、BMP剂、PTH剂、bFGF剂和抗-RANKL 抗体剂，但不限于这些作用剂。
[0080] 此外，在本发明治疗剂用于基因疗法的情况下，可使用这样的疗法，其中将在宿主 细胞中发挥功能的启动子(例如巨细胞病毒启动子（CMV启动子）等)序列下游的编码NPR-B 激动剂肽的氨基酸序列的核酸并入适合基因疗法的已知载体比如病毒载体优选慢病毒载 体、腺相关病毒载体，更优选腺病毒载体；或者化学合成的脂质体、病毒包膜，或者病毒包膜 和合成脂质体的复合物内。作为编码CNP的基因，可使用含有编码SEQ ID NO :1至5中任一 氨基酸序列的核苷酸序列的基因。至于具体基因疗法的方法，可使用描述于Experimental Medicine (Jikken Igaku), 12卷，303页，1994中的方法，在其中所引用文献的方法等。 实施例
[0081] 下面，通过实施例更详细地描述本发明。
[0082] 实施例1:大鼠股骨骨折模型测试 [方法] 在6周龄雌性SD品系（Crl:⑶）IGS大鼠的左股骨骨干经手术制备骨折模型。将巴 比妥基麻醉剂（Somnopentyl?, Kyoritsu Seiyaku Corporation)腹膜内给予动物以麻醉 动物。进行异氟烧（Escain, Mylan Inc.)吸入麻醉作为对麻醉的辅助。切开膝关节上侧的 皮肤，在股直肌与股外侧肌之间进行剥离以暴露股骨。在股骨骨干中心远端约〇. 5 _处，用 切骨机（Osada Equipment Co.，Ltd.)按横断面完全切开骨干。然后，将21G注射针插入 左股骨大转子与股骨颈之间的骨髓，用2至3条缝线缝合肌肉和皮肤。为了防止术后化脓， 给予注射用抗生素青霉素 G钾（Meiji Seika Kaisha, Limited),用聚维酮碘（Isodine?, Meiji Seika Kaisha，Limited)消毒皮肤的缝合部位。作为测试物，将CNP衍生物A (SEQ ID NO: 13:美国专利申请US 2010-305031公布内容的SEQ ID NO: 157，通过描述于该 公布内容中的方法制备）用于以10或100 nmol/kg每天1次重复皮下给予8周。将媒介 物给予对照组。在给予结束日期的第二天，切除左和右股骨和左和右胫骨。对于切除的骨， 测量骨长和骨折部位的骨痂大小，对左和右股骨进行软X射线摄影，然后确定骨折部位的 愈合状态。随后，通过使用骨强度测量仪MZ-500S (MARUT0 INSTRUMENT CO.，LTD.)和骨 强度测试系统CTR win Ver. 1.21 (System Supply Co.，Ltd.)进行三点弯曲强度测试。 完成测量后的骨用10%中性缓冲福尔马林固定，制备和观察病理样本。对包括备用大鼠在 内的一组14只大鼠进行给予。在给予后2、4和6周，将每种情况中的1只大鼠制样用于随 访，另外在对照组中已显示骨不连接样症状的1只大鼠从评估中排除，最终以一组10只大 鼠评估结果。
[0083] [结果] 股骨的软X射线图像显示于图1中。观察到给予CNP衍生物A有降低保留的骨折线的 趋势和增强皮质骨连续性的趋势。骨强度测试的结果显示于表1中。左股骨骨折部位的断 裂能以CNP衍生物A-剂量依赖性增加。在左/右股骨的比率上，与媒介物给予组的0. 45 相比，100 nmol/kg给予组恢复多至0.90。在最大负荷（左/右股骨比率）上，媒介物给予 组是0.66,这一数值意味着与正常右股骨相比骨折的左股骨的抗负荷强度已恢复了大约一 半，相比之下，第2组即10 nmol/kg给予组是0.86,第3组即100 nmol/kg给予组是1.03, 剂量依赖性增加。在测试物给予组中断裂强度和断裂变形也显示高值。
[0084] 各样本中股骨组织的结果显示于表2中。在左股骨骨折部位的骨痂区中，100 nmol/kg给予组连续性得到改善，软骨细胞减少。另一方面，在皮质骨区中，10 nmol/kg给 予组连续性稍增强。在更高剂量组，除上述以外，观察到软骨减少，破骨细胞减少，结缔组织 减少。在本测试中骨折后8周采集的个体组织的图像中，骨痂形成已完成，因此，该个体被 视为处于重塑期（骨密阶段）或更晚。在这种情况下，在100 nmol/kg CNP衍生物A给予 组中，观察到与对照组相比，软骨形成等级降低的趋势和骨痂骨化等级升高的趋势，提示有 可能促进软骨内骨化。依据这些结果，认为通过CNP衍生物A给药促进骨切断区的修复。
[0085] CNP 衍生物 A 在8周给予结束时骨强度测试的结果 (均值土标准差，N = 10)
[表1]

【权利要求】
1. 一种骨修复促进剂，其包含至少一种利尿钠肽受体NPR-B激动剂作为活性成分。
2. 权利要求1的骨修复促进剂，其中NPR-B激动剂是C-型利尿钠肽（CNP)或其活性 片段；或其突变体、其衍生物或其修饰体；或者抗利尿钠肽受体NPR-B抗体。
3. 权利要求1的骨修复促进剂，其中NPR-B激动剂是hCNP-22(SEQIDNO: 1)、 hCNP6-22(SEQIDNO: 1 的氨基酸号 6 至 22)或hCNP-53(SEQIDNO: 2);或其突变体、 其衍生物或其修饰体。
4. 权利要求1的骨修复促进剂，其中NPR-B激动剂是hCNP-22或hCNP6-22的衍生物 或修饰体。
5. 权利要求2至4中任一项的骨修复促进剂，其中衍生物是这样的衍生物，其中选自 由免疫球蛋白Fc区衍生的肽、血清白蛋白和在生长素释放肽C-端侧的部分肽的至少一种 附加肽结合至hCNP-22或hCNP6-22的N端、C端或者其两端。
6. 权利要求5的骨修复促进剂，其中衍生物由其中自SEQIDNO: 2的N端缺失一个 以上至30个以下的连续氨基酸的氨基酸序列或者选自SEQIDNO: 6至15的氨基酸序列 组成。
7. 权利要求2至4中任一项的骨修复促进剂，其中修饰体是这样的修饰体，其中PEG 或其类似亲水聚合物结合至hCNP-22、hCNP6-22或hCNP-53的N端、C端或其两端。
8. 权利要求1的骨修复促进剂，其中NPR-B激动剂是由SEQIDNO: 2、SEQIDNO: 2 的氨基酸号18至53、SEQIDNO: 13和SEQIDNO: 15中的任一个氨基酸序列组成的肽。
9. 权利要求1至8中任一项的骨修复促进剂，其中骨损伤部位中直至骨组织修复的时 间段缩短。
10. 权利要求1至8中任一项的骨修复促进剂，其中在骨修复后骨组织的骨强度和/ 或连续性恢复至等同于未骨折的骨相应部位的水平。
11. 权利要求1至8中任一项的骨修复促进剂，其中通过在骨修复的骨痂形成阶段给 予骨修复促进剂和在骨痂形成的后期或者形成完成之后停止给予来实现促进骨修复。
12. 权利要求1至11中任一项的骨修复促进剂，其用于治疗骨折。
13. -种促进骨修复的方法，其包含将有效量的NPR-B激动剂给予需要骨修复的受试 者。
14. 一种治疗骨折的方法，其包含将有效量的NPR-B激动剂给予骨折患者。
15. -种NPR-B激动剂，其用于在需要骨修复的受试者中促进骨修复。
16. 权利要求15的NPR-B激动剂，其用于在骨折患者中治疗骨折。
【文档编号】A61K47/34GK104379171SQ201380033624
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年4月24日 优先权日:2012年4月25日
【发明者】若林直美, 山木明, 杉山真佐子 申请人:第一三共株式会社