一种鼠源单克隆抗体cd151 9b及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种鼠源单克隆抗体CD151?9B及其应用。所述的鼠源单克隆抗体CD151?9B，其特征在于，由保藏号为CGMCC?No.9156的杂交瘤细胞产生。本发明通过广泛而深入的研究，成功获得了靶向针对人CD151-整合素α6β1复合物结合域高特异性的鼠源单克隆抗体CD151?9B。本发明的鼠源单克隆抗体CD151?9B具有高亲和性，能较好表达肝癌细胞中CD151表达和定位。本发明的鼠源单克隆抗体CD151?9B可以竞争肝癌细胞CD151-整合素α6β1结合位点，抑制肝癌细胞移动、侵袭。因此，本发明的高亲和力、高特异性的鼠源单克隆抗体具有较好的实验和临床应用前景。
【专利说明】-种鼠源单克隆抗体CD151 9B及其应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及针对人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α 6β 1复合体结合域的单克隆抗体 ⑶1519Β及其应用。 【背景技术】
[0002] 肝癌属基因性疾病，一些关键基因在肝癌的侵袭和转移中起了重要作用。四跨膜 蛋白⑶151(Tetraspanin24，TM4SF24)是四跨膜蛋白家族最重要的成员之一，⑶151基因定 位于人类染色体11ρ15. 5,其编码蛋白质形成四次跨膜分子。CD151在人体细胞中分布广 泛，包括上皮细胞、内皮细胞和血小板等，参与细胞多种重要生理功能，如信号转导、细胞黏 附、细胞移动与形态改变等。
[0003] 多种恶性肿瘤组织包括肝癌中CD151过表达，其表达强度与患者预后密切相关。 CD151通过与整合素、生长因子结合或自身相互结合形成功能复合体，影响肿瘤细胞迁移、 病理血管形成和上皮间质样转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT)等多个方 面，参与肿瘤转移。研究证实，⑶151通过与整合素 α6β1等结合形成功能复合体，募集细 胞内憐脂醜肌醇 _3_ 激酶（Phosphatidylinositide3kinases，ΡΙ3Κ)、蛋白激酶 C(Protein kinase C，PKC)、细胞分裂控制蛋白 42 (Cell division control protein42，Cdc42)、Ras 等 信号分子，促进细胞的代谢、生长、增殖和细胞内肌动蛋白聚合，参与肿瘤细胞迁移、病理血 管形成和形态改变等过程促进肿瘤转移。⑶151可增强整合素 α6β1与其配体层粘连蛋 白-1之间的结合，加快细胞在层粘连蛋白-1基膜上的移动而促进肿瘤细胞迁徙。
[0004] 前期系列研究发现，CD151是影响肝癌转移复发的关键蛋白。我们发现，（1)肝 癌细胞中⑶151表达程度与其侵袭、转移能力密切相关，⑶151表达改变可显著影响肝 癌细胞的侵袭和转移能力；(2)⑶151通过激活ΡΙ3Κ/蛋白激酶B(Akt)/糖原合成酶激 酶 _3 β (Glycogen synthase kinase_3i3 , GSK_3i3)/Snail 信号通路促进基质金属蛋白酶 9(1&11：1^11116七311(^6口1:丨(^869，丽?9)分泌和表达，促进肝癌新生血管形成 ；（3)0)151与整 合素 α 6 β 1在肝癌细胞表面形成复合物，过表达⑶151可选择性扩大整合素 α 6 β 1-PI3K 信号导致核转录因子Snail (锌指转录因子Snail作为EMT过程中的关键调控因子在肿瘤 的侵袭转移中起重要作用）的核聚集与激活，从而促进肝癌EMT发生；(4)基于免疫共沉淀 (Co-Immunoprecipitation, coIP)结合液相色谱串联质谱（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS/MS)技术，肝癌细胞株HCCLM3细胞中CD151可与整合素 α 6、β 1等 分子伴侣结合形成功能复合。因此，四跨膜蛋白⑶151与整合素 α 6 β 1等结合所形成的功 能复合体是抗肿瘤复发/转移的潜在靶点。
[0005] 目前已有几种抗人CD151单克隆抗体用于肿瘤治疗的实验研究，并显示出一定的 疗效。但这些抗体制备时未考虑⑶151功能发挥依赖于功能复合体存在这一特征，因此这 些单克隆抗体在抑制肿瘤的侵袭同时也影响其的多种重要生理功能，如信号转导、细胞黏 附、细胞移动与形态改变。
[0006] 因此，本领域迫切需要研制具有针对⑶151-整合素α6β 1复合体结合域的靶向 单克隆抗体，为临床治疗开发治疗效果更佳、副作用更小的药物。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种靶向针对人⑶151-整合素 α 6β 1复合物结合域的鼠源 单克隆抗体（CD1519B)及其应用，新研制的抗体能定位、表达细胞、组织（如肝细胞癌）内 ⑶151蛋白，一方面不影响⑶151正常的生理功能，另一方面又能竞争性抑制⑶151过表达 引起的肝癌侵袭和转移。
[0008] 为了达到上述目的，本发明提供了一种靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β1 复合体结合域的鼠源单克隆抗体⑶1519Β，其特征在于，由保藏号为CGMCC No. 9156的杂交 瘤细胞产生。
[0009] 优选地，所述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β 1复合体结合域的鼠源单 克隆抗体⑶1519Β包含可与人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β 1复合体结合的功能域，该 功能域包含至少一个轻链可变区和至少一个重链可变区。
[0010] 更优选地，所述的功能域选自单克隆抗体，完整抗体，单链抗体（scFV)，Fab片段， Fd片段，Fv片段，F (ab'）2片段及其功能性衍生物。
[〇〇11] 更优选地，所述的功能域是抗体可变区，其包含一个轻链可变区和一个重链可变 区，编码轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID N0 :1，编码重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO :2。
[0012] 更优选地，所述的功能域是抗体可变区，其包含一个轻链可变区和一个重链可变 区，所述的轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID N0 :3,所述的重链可变区具有氨基酸序列 SEQ ID N0 :4。
[0013] 本发明还提供了上述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β 1复合体结合域的 鼠源单克隆抗体CD1519B在与其他药物或标记物连接中的应用。
[0014] 本发明还提供了上述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β 1复合体结合域的 鼠源单克隆抗体CD1519B在制备治疗、预防或缓解肿瘤的药物中的应用。
[0015] 本发明还提供了上述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β 1复合体结合域的 鼠源单克隆抗体⑶1519Β在制备检测细胞、组织中⑶151表达和定位试剂中的应用。
[0016] 本发明还提供了一种药物组合物，其包含上述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合 素 α 6 β 1复合体结合域的鼠源单克隆抗体⑶1519Β和药学可接受的载体。
[0017] 本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株为保藏号 为CGMCC No. 9156的杂交瘤细胞株。
[0018] 本发明的原理是：四跨膜蛋白⑶151形成四次跨膜的分子结构。⑶151在人体细 胞中分布广泛，包括上皮细胞、内皮细胞和血小板等，参与细胞多种重要生理功能，如信号 转导、细胞黏附、细胞移动与形态改变等。CD151是影响肝癌转移复发的关键蛋白。CD151 通过与整合素 α 6 β 1形成复合物，参与肝癌细胞的侵袭、新生血管形成、上皮间质样转化。 既往抗人CD151单克隆抗体未考虑CD151功能发挥依赖于功能复合体存在这一特征，因此 这些单克隆抗体在抑制肿瘤的侵袭同时也影响其多种重要生理功能。⑶151的细胞外区域 QRD194496对于维持与整合素 α 6 β 1复合体至关重要，在肝癌细胞株HCCLM3细胞中⑶151可 与整合素 α 6、β 1等分子伴侣结合形成功能复合物，⑶151与整合素 α 6 β 1形成复合物，参 与肝癌进展。本发明新研制的小鼠抗人CD151-整合素 α6β1复合物结合域的单克隆抗体 (⑶1519Β)能竞争性抑制⑶151高表达细胞（包括肝细胞癌）移动和侵袭，但不影响⑶151 正常的生理功能；能特异性定位、表达细胞、组织（如肝细胞癌）内⑶151蛋白。
[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0020] 本发明通过广泛而深入的研究，成功获得了靶向针对人⑶151-整合素 α6β 1复 合物结合域高特异性的鼠源单克隆抗体CD1519B。本发明的鼠源单克隆抗体CD1519B具有 高亲和性，能较好表达肝癌细胞中⑶151表达和定位。本发明的鼠源单克隆抗体⑶1519Β 可以竞争肝癌细胞⑶151-整合素 α6β1结合位点，抑制肝癌细胞移动、侵袭。因此，本发 明的高亲和力、高特异性的鼠源单克隆抗体具有较好的实验和临床应用前景。
[0021] 本发明的杂交瘤细胞株（保藏日期2014年4月24日、保藏单位全称：中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心和保藏编号CGMCC No. 9156)。 【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为小鼠抗人⑶1519B单克隆抗体变性蛋白SDS-PAGE电泳图。
[0023] 图2为单克隆抗体免疫分型结果图；
[0024] 图3为Western blot实验结果图；
[0025] 图4为细胞免疫荧光实验结果图；
[0026] 图5为免疫组织化学染色结果图；
[0027] 图6为co-IP实验结果图；
[0028] 图7为细胞划痕实验结果图；
[0029] 图8为Transwell实验结果图。 【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验手册（New York :Cold Spring Harbor laboratory Press， 1989)中所建议的条件，或按照试剂公司所建议的条件。
[0031] 实施例1.抗原的制备
[0032] 根据 Kazarov AR，Yang X, Stipp CS，Sehgal B，Hemler ME :An extracellular site on tetraspanin CD151determines alpha3and alpha6integrin-dependent cellular morphology. J CellBiol2002 ; 158 (7) :1299-309,设计需合成的肽段序列为 GQRDHASNIYKVEGGC，按以下步骤合成肽段。
[0033] 1. 1称取η当量树脂（Sigma)放入反应器（上海强耀生物科技有限公司），加入 二氯甲烷（DCM，Sigma)溶胀半小时，然后抽掉DCM，加入一定量配好的六氢吡啶（Sigma)去 Fmoc保护基。清洗，检测；
[0034] 1. 2称取多肽C端的第一个氨基酸〃Fmoc-Cys (Tbu) -0H〃、HBTU、DIEA各三倍当量 加入反应器，队鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮（Sigma)检测，用吡啶、乙酸酐（Sigma)， 封端。然后洗净，加入适当量的脱帽液去除Fmoc保护基，去好后洗净，茚三酮检测；
[0035] 1. 3称取多肽C端的第二个氨基酸，HBTU、DIEA (Sigma)各三倍当量加入反应器， N2鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮检测，无色则加入适当量的脱帽液去除Fmoc保护基， 洗净，检测；
[0036] 1. 4称取多肽C端的第三个氨基酸，HBTU、DIEA各三倍当量加入反应器，N2鼓泡反 应半小时，洗掉反应液，茚三酮检测，无色则加入适当量的脱帽液去除Fmoc保护基，洗净， 检测；
[0037] 1. 5依次类推，从C端向N端接氨基酸，接到最后一个氨基酸后；
[0038] 1. 6接完后将树脂拉干，从反应柱中取下，树脂倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定 量的切割液（上海强耀生物科技有限公司），震荡2小时（目的是将多肽从树脂载体上裂解 下来和去除各个保护基团）；
[0039] 1. 7滤掉树脂，得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚（上海强耀生物科技有限公 司），粗产物会析出，然后离心，清洗即可得到，GQRDHASNIYKVEGGC这个序列的粗产物；
[0040] 1. 8提纯：用高效液相色谱（上海强耀生物科技有限公司）将粗品提纯至要求纯 度 99. 99% ;
[0041] 1. 9纯化好的液体放入冻干机（上海强耀生物科技有限公司）中进行浓缩，冻干成 白色粉末；
[0042] 1. 10 称量 KLH(Sigma)和 BSA(Sigma)分别溶于少量 PBS 中；
[0043] 1. 11将多肽溶于少量MDF (Sigma)中边搅拌边加入"1. 10"中的溶液中；
[0044] 1. 12边搅拌边加入适量EDC、NHS (上海强耀生物科技有限公司）；
[0045] 1. 13室温反应2小时；
[0046] 1. 14边搅拌边加入适量EDC(上海强耀生物科技有限公司）；
[0047] 1. 15室温反应20小时；
[0048] 1. 15 用 0· 01mol/L 的 PBS(PH7. 2)于 4°C充分透析；
[0049] 1. 16 冻干，得到 GQRDHASNIYKVEGGC-KLH 偶联物和 GQRDHASNIYKVEGGC-BSA 偶联物。 [〇〇5〇] 实施例2.抗原免疫及杂交瘤筛选
[0051] 2.1重组蛋白免疫：
[0052] 准备六周龄健康雄性BALB/c小鼠，进行初次免疫，称取一定量的⑶151-整合 素 α 6 β 1-KLH 复合体蛋白（GQRDHASNIYKVEGGC-KLH)，内含 CD151-整合素 α6β1 抗原 量100 μ g/小鼠。溶解后与等量完全弗氏佐剂（Sigma)混合充分乳化，每只小鼠腹腔注射 0. 5ml抗原佐剂混合物。2周后进行第一次加强免疫，抗原量同前与不完全弗氏佐剂混合乳 化腹腔注射。间隔2周再行第二次加强免疫，条件同前。二次加强免疫后2周进行冲击免 疫，抗原量是加强免疫的2倍。冲击免疫后3天处死小鼠，进行融合。
[0053] 2. 2抗⑶151-整合素 α 6 β 1杂交瘤细胞株建立
[0054] (1)细胞融合
[0055] 融合前24小时制备饲养层细胞，取免疫同系小鼠腹腔巨噬细胞铺成96孔培养板2 块备用。准备对数生长期小鼠骨髓瘤NS-1细胞系（中国科学院典型培养物保藏委员会细 胞库）融合。冲击免疫3天处死小鼠，在处死前先眼球取血，以后作阳性对照。在无菌条件 下取脾，分离得到脾细胞，细胞活率>95%。分别将NS-1细胞和脾细胞洗2次，以10 : 1 比例将脾细胞和NS-1细胞混合，离心弃上清，细胞混匀。将试管直立，取0. 8ml预热的5% PEG MN1500 (Roche)，用1分钟时间慢滴慢摇的加入混合细胞内，然后静止10分钟。加入lml 无血清培养液于混合细胞内终止反应，持续1分钟，在2分钟内加完15ml无血清培养液， 500rpm离心3分钟，室温，弃上清，加25ml含10% FBS的HAT (选择性培养基Sigma)，将细 胞滴加在已含饲养细胞的96孔培养板上培养。
[〇〇56] (2)杂交瘤的细胞筛选
[0057] 每天观察杂交细胞生长情况，第4天已有大小不等克隆形成。克隆细胞生长至> 50%时，收集上清，筛选阳性克隆。HAT完全培养液培养3周后换成DMEM培养液（Gibco)。 阳性克隆筛选采用酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法， CD151-整合素 α 6β l-BSA(GQRDHASNIYKVEGGC-BSA)连接的抗原 10ug/ml，每孔 lOOul 包 被。检测到阳性克隆时用有限稀释法进行再克隆化（2块96孔）。第二天挑选一个细胞克 隆重点观察进行检测，反复3次。挑选到3个稳定克隆，其中一个克隆命名为CD151/9B细 胞株，进行培养，该细胞株保藏在（保藏日期2014年4月24日、保藏单位：中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号CGMCC No. 9156。）
[0058] 实施例3.单克隆抗体免疫分型检测
[0059] 收集抗CD151/9B杂交瘤细胞株（CD151/9B细胞株）培养上清，用mouse monoclonal antibody/isotyping kit(Roche)进行免疫分型鉴定，结果为 IgGl，如图 1 所 示。以下实验选用CD151/9B杂交瘤细胞进行。
[0060] 实施例4.腹水制备和纯化
[0061] 4. 1扩增CD151/9B杂交瘤细胞
[0062] 制备腹水前向BALB/C小鼠腹腔注射液体无菌石蜡油0. 5ml，7天后小鼠腹腔注 射0. 5ml实施例2获得的含抗CD151/9B杂交瘤细胞株（CD151/9B细胞株）的培养液，抗 CD151/9B杂交瘤细胞数为8 X 105。接种细胞后每天观察小鼠腹腔增大情况，15天后收集腹 水。收集的腹水以4000rpml0分钟4°C离心，保留上清，分装，_20°C贮存备用。根据需要进 行纯化。
[0063] 4. 2纯化靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α 6β 1复合体结合域的鼠源单克隆抗 体⑶1519Β (小鼠抗人⑶1519Β单克隆抗体）
[0064] 采用protein G亲和层析柱（GE Healthcare)。室温解冻⑶151/9Β腹水，用结合缓 冲液（20mM sodium phosphate PH7. 0)稀释 1 倍，0· 45um 滤器过滤备用。将 protein G 柱室 温复温，用10个柱体积的结合缓冲液平衡和洗柱子，加 CD151/9B腹水，8个柱体积的结合缓 冲液洗直到无液体流出，加5个柱体积的PH2. 7,0. 1M甘氨酸盐酸洗脱液洗脱。每个收集管 内预加100ullMTris-HCL(PH9. 0)起中和作用，每管收集流出液lml进行蛋白浓度测定，将 有效的流出液透析0. 1M PBS PH7. 0，透析24小时，其间换两次。将透析液浓缩，测蛋白浓度 (Nanovue plus GE)，得到小鼠抗人OH519B单克隆抗体。然后0· 22um灭菌过滤，分装-80°C 保存。
[0065] 4. 3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)
[〇〇66] (1)样品制备：采用步骤4.1中制备的腹水，将腹水样品与5X样品缓冲液 (20ul+5ul)在一个Eppendorf管中混合。放入10(TC加热10分钟，取上清点样；
[0067] (2)分离胶及浓缩胶的制备：将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用 ddH20(碧云天）冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按 照Bio-Rad Mini II/III说明书提示装好玻璃板；按如下体积配制12%分离胶10. 0ml，混 匀；
[0068] ddH203. 3ml
[0069] 1. 5mol/L Tris-HCl (pH = 8· 8) 2. 5ml
[0070] 30% Acr-Bis4ml
[0071] 10% SDSlOOy 1
[0072] 10% ΑΡΙΟΟμ 1
[0073] TEMED4 μ 1
[0074] 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20分钟后胶即可聚合；按如下 体积配制5 %浓缩胶3. 0ml，混匀；
[0075] ddH202. 1ml
[0076] 1. Omol/LTris-HCl (pH = 6. 8) 380ul
[0077] 30% Acr-Bis500y 1
[0078] 10% SDS30y 1
[0079] 10% ΑΡ30μ 1
[0080] TEMED3 μ 1
[0081] 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；
[0082] (3)装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20μ 1 ;稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶 时，停止电泳，约需45分钟-1小时；
[0083] (4)卸下胶板，剥离胶放入考马斯亮蓝G250染色液中，室温染色2小时；加入脱色 液，置于80rpm脱色摇床上，每20分钟更换一次脱色液（10ml冰乙酸；45ml乙醇；45ml蒸馏 水）至完全脱净，摄片，结果如图2所示。
[0084] 实施例5.抗⑶151-整合素 α 6 β 1复合体结构域单克隆抗体可变区测序
[0085] 提取实施例2获得的ΟΗ51/9Β细胞株的总RNA(Invitrogen)、逆转录（Promega)。 利用5'-race技术（TAKARA)扩增抗体重链和轻链可变区。然后将抗体重链及轻链可变区 克隆到T载体（TAKARA)，测序。PubmedBlast IgBlast数据库对比序列，找出杂交瘤单克隆 细胞株重链轻链可变区（附序列）。确定CD151/9B重链及轻链可变区至恒定区的序列：具 体方法按照5'-RACE试剂盒（TAKARACode :D315)说明书进行实验。具体方法如下：
[0086] 5. 1抗⑶151/9B杂交瘤细胞总RNA的提取：
[0087] 抗⑶151/9B杂交瘤细胞于5% C02 , 37°C培养箱中培养。将抗⑶151/9B杂交瘤细 胞收集于离心管中，室温，l，〇〇〇rpm离心5分钟，弃上清。PBS (Corning)洗漆细胞2次。每 1〇6细胞加 lml Trizol (Invitrogen)，充分裂解细胞；按每毫升Trizol加0· 2ml的比例加入 氯仿（国药集团化学试剂有限公司），剧烈振荡15秒，室温静置孵育5分钟；4°C，12, OOOrpm 离心15分钟；将无色上清液移入RNAasefree EP管中，按每毫升Trizol加0. 5ml异丙醇（国 药集团化学试剂有限公司），室温静置10分钟，12, 000rpm，4°C离心10分钟；弃上清，70% RNAase free乙醇（国药集团化学试剂有限公司）洗漆，4°C，12, OOOrpm离心5分钟；室温 干燥RNA10分钟。随后用DEPC处理后的RNAase free H20(生物工程上海有限公司）溶解。 分光光度计法定量RNA浓度。
[0088] 以下 5. 2-5. 7 为 5' -RACE 实验步骤（试剂盒，TAKARA Code :D315)
[0089] 5· 2去磷酸化处理
[0090] 使用Alkaline Phosphatase (CIAP)对总RNA裸露的Y磷酸基团进行去磷酸反 应。按下列组份配制去磷酸反应液：
[0091] Total RNA(1 μ g/ μ 1) 1 μ 1
[0092] RNase Inhibitor (40U/ μ 1) 1 μ 1
[0093] 10XAlkaline Phosphatase Buffer(MgC12Free) 5μ 1
[0094] Alkaline Phosphatase (Calf intestine) (16U/ μ 1) 0. 6 μ 1
[0095] 加 RNase Free 去离子水至 5〇 μ 1。
[0096] 上述反应体系于50°C反应1小时。随后向上述反应液中加入20 μ 1浓度为3mol 0130)0似(?!15.2)和13(^18似86?代6去离子水，充分混匀。加入20(^1苯酚/氯仿/异戊 醇（25 : 24 : 1)，充分混匀，13, OOOrpm室温离心5分钟，将上层水相转移至新的离心管中。 加入200 μ 1氯仿，充分混勻，13, OOOrpm室温离心5分钟，将上层水相转移至新Microtube 中。加入2 μ 1 ΝΑ Carrier后均匀混合。加入200 μ 1异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10分 钟。13, 000rpm4°C离心20分钟，弃上清。加入500 μ 170%冷乙醇（RNase Free去离子水配 制）漂洗，13, 000rpm4°C离心5分钟，弃上清后干燥。加入7 μ 1 RNase Free去离子水溶解 沉淀，得到 CIAP-treated RNA。
[0097] 5.3"去帽子"反应：
[0098] 使用 Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP)去掉 mRNA 的 5'帽子结构，保留一个 磷酸基团。按下列组份配制"去帽子"反应液：
[0099] CIAP-treated RNA 7 μ 1
[0100] RNase Inhibitor (40 U/ μ 1) 1 μ 1
[0101] 1 OX TAP Reaction Buffer 1 μ 1
[0102] Tobacco Acid Pyrophosphatase (0. 5 U/ μ 1) 1 μ 1
[0103] 总体积10μ 1。37°C反应1小时。得到的反应液为CIAP/TAP-treated RNA。取 5μ 1用于Y -RACE Adaptor连接反应，剩余的5μ 1保存于-80°C备用。
[0104] 5. 4 5 ' RACE Adaptor 的连接。
[0105] 首先配制下列溶液：
[0106] CIAP/TAP-treated RNA 5 μ 1
[0107] 5' RACEAdaptor(15yM) 1μ 1
[0108] RNase Free dH20 4 μ 1
[0109] 于65°C孵育5分钟后冰上放置2分钟，然后加入下列试剂：
[0110] RNase Inhibitor (40 U/ μ 1) 1 μ 1
[0111] 5 XRNA Ligation Buffer 8μ1
[0112] 40%PEG#6000 20 μ 1
[0113] T4 RNALigase (40 U/ μ 1) 1 μ 1
[0114] 反应体系于16°C孵育1小时。向上述反应液中加入20 μ 1的3 mol的CH3C00Na(PH 5. 2)和140 μ 1 RNase Free去离子水后，充分混勻。加入200 μ 1苯酚/氯仿/异戊醇 (25 : 24 : 1)，充分混匀后于13, OOOrpm室温离心5分钟，将上层水相转移至新的离心管 中。加入200 μ 1氯仿，充分混匀后于13, OOOrpm室温离心5分钟，将上层水相转移至新的 离心管中。加入2 μ 1 NA Carrier后均匀混合。加入200 μ 1异丙醇，充分混匀后，冰上冷却 10分钟。13,000rpm4°C离心20分钟，弃上清。加入500μ1预冷的70%乙醇（RNaseFree 去离子水配制）漂洗，13, OOOrpm 4°C离心5分钟，弃上清后干燥。加入6 μ 1 RNase Free去 离子水溶解沉淀，得到Ligated RNA。
[0115] 5.5反转录反应。
[0116] 按下列组份配制反转录反应液：
[0117] LigatedRNA 6 μ 1
[0118] Random9mers (50 μ Μ) 0. 5 μ 1
[0119] 5XM-MLV Buffer 2 μ 1
[0120] dNTP (10mM each) 1 μ 1
[0121] RNase Inhibitor (40U/ μ 1) 0. 25 μ 1
[0122] Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-) (200U/ μ 1) 0. 25 μ 1
[0123] 加 RNase Free去离子水至10 μ 1。反转录反应条件如下：30°C 10分钟，42°C 1小 时，70°C 15分钟。反应结束后可以进行下一步实验，或将反应液保存于_20°C。
[0124] 5. 60uterPCR 反应
[0125] PCR反应使用TaKaRa LA Taq? (TaKaRa)，按下列组份配制Outer PCR反应液：
[0126] 上述的反转录反应液2 μ 1
[0127] 1 X cDNA Dilution Buffer II 8 μ 1
[0128] 10 X LA PCR Buffer 11 (Mg2+Free) 4 μ 1
[0129] MgCl2 (25mM) 3 μ 1
[0130] TaKaRa LA Taq (5U/ μ 1) 0· 25 μ 1
[0131] mlgGfOUter Primer (10 μ Μ) 2 μ 1
[0132] 5' RACE Outer Primer (10 μ Μ) 2μ1
[0133] 加灭菌去离子水至50 μ 1。PCR反应条件：94°C 3分钟；[94°C 30秒，55°C 30秒， 72°C 1分]X20个循环；72°C 10分钟。
[0134] 5. 7InnerPCR 反应
[0135] 按下列组份配制Inner PCR反应液：
[0136] OuterPCR 反应液 1 μ 1
[0137] 10 X LAPCR BufferII (Mg2+Free) 5 μ 1
[0138] MgCl2 (25mM) 5 μ 1
[0139] dNTP Mixture (2. 5mM each) 8 μ 1
[0140] TaKaRa LATaq (5U/ μ 1) 0· 5 μ 1
[0141] mlgGfinner (10 μ Μ) 2 μ 1
[0142] 5' RACE Inner Primer (10 μ M) 2 μ 1
[0143] 加灭菌去离子水至50μ 1。PCR反应条件如下：94°C 3分钟，[94°C 30秒，55°C 30 秒，72°C lmin] X25 个循环；72°C 10 分钟。
[0144] 5. 8琼脂糖凝胶电泳
[0145] 反应结束后，取5 μ 1 PCR反应液进行1 %的琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物。 然后将PCR扩增得到的抗体重链及轻链可变区分别链接到pGEM?-T载体（PromegaCode : A3610)，连接反应体系如下：
【权利要求】
1. 一种靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素α6β1复合体结合域的鼠源单克隆抗体 ⑶1519Β，其特征在于，由保藏号为CGMCC No. 9156的杂交瘤细胞产生。
2. 如权利要求1所述的靶向人四跨膜蛋白CD151-整合素α6β1复合体结合域的鼠源 单克隆抗体⑶1519Β，其特征在于，包含可与人四跨膜蛋白⑶151-整合素α6β 1复合体结 合的功能域，该功能域包含至少一个轻链可变区和至少一个重链可变区。
3. 如权利要求2所述的靶向人四跨膜蛋白CD151-整合素α6β1复合体结合域的鼠源 单克隆抗体CD 1519Β，其特征在于，所述的功能域是抗体可变区，其包含一个轻链可变区和 一个重链可变区，编码轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO :1，编码重链可变区的核苷酸 序列为 SEQ IDN0 :3。
4. 如权利要求2所述的靶向人四跨膜蛋白CD151-整合素α 6 β 1复合体结合域的鼠源 单克隆抗体CD1519B，其特征在于，所述的功能域是抗体可变区，其包含一个轻链可变区和 一个重链可变区，所述的轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO :2,所述的重链可变区具有 氨基酸序列SEQ IDN0 :4。
5. 权利要求1-4中任一项所述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素α6β 1复合体结合 域的鼠源单克隆抗体CD1519B在与其他药物或标记物连接中的应用。
6. 权利要求1-4中任一项所述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素α6β 1复合体结合 域的鼠源单克隆抗体CD1519B在制备治疗、预防或缓解肿瘤的药物中的应用。
7. 权利要求1-4中任一项所述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素α6β 1复合体结合 域的鼠源单克隆抗体⑶1519Β在制备检测细胞、组织中⑶151表达和定位试剂中的应用。
8. -种药物组合物，其包含权利要求1 _4中任一项所述的靶向人四跨膜蛋白⑶151 -整 合素α 6β 1复合体结合域的鼠源单克隆抗体CD1519B和药学可接受的载体。
9. 一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株为保藏号为CGMCCNo. 9156的 杂交瘤细胞株。
【文档编号】A61K39/395GK104059145SQ201410204122
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年5月15日 优先权日:2014年5月15日
【发明者】樊嘉, 施国明, 柯爱武, 周俭, 胡美玉, 张鹏飞, 蔡加彬, 董兆如, 张驰 申请人:复旦大学附属中山医院