一种电聚丝素水凝胶膜的制备方法、装置及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种电聚丝素水凝胶膜的制备方法、装置及其应用。将丝素蛋白通过电泳动作用在纳米孔径屏障膜上快速自组装成电聚丝素水凝胶膜；制备装置由一个盛装电聚缓冲液的、中间被屏障膜分隔成内、外二室的容器组成，内室接负极、外室接正极，注入内室的丝素蛋白在含SDS的电聚缓冲液中带负电荷，在较高直流电场作用下朝正极方向泳动，在屏障膜上快速自组装形成电聚丝素水凝胶膜。这种湿态凝胶膜半透明、光滑、柔软并富有弹性，持水能力约其自身重量十倍，L929细胞能在其表面粘附生长，包埋的药物能持续释放，植入动物体内可缓慢降解，无明显免疫或炎症反应。凝胶膜在人工皮肤、外科手术植入体或填充料或细胞培养基质等领域具有应用前景。
【专利说明】一种电聚丝素水凝胶膜的制备方法、装置及其应用
【技术领域】
[0001]本发明提供一种在水或缓冲液中将带正或负电荷的生物高分子在一个直流电场作用下快速自组装成电聚丝素水凝胶膜(ESFHM)的方法与加工装置。本发明也与医用组织工程材料的制备方法与组成有关。
【背景技术】
[0002]利用天然的丝素蛋白的生物相容性特点加工成医用组织工程材料是当前研发热点之一。丝纤维是常见的蛋白质高分子聚合物，包括蜘蛛丝、家蚕丝、蓖麻蚕丝、柞蚕丝等
坐寸ο
[0003]目前常用的丝纤维通常是指某些鳞翅目昆虫家蚕生产的一种蛋白纤维。这种蛋白纤维主要由丝素蛋白纤维和被覆在其周围的胶状丝胶蛋白组成。当被覆在纤维外面的丝胶蛋白人为去除后，蚕丝丝素蛋白纤维因具有轻飘、舒适、吸放湿性强、柔软、弹性和染色艳丽等特性，自古以来是纺织材料，常被誉为纺织纤维的皇后。近年，因其生物相容性、可缓慢降解性与优异的机械特性，常用于生物医用材料尤其是医用组织工程材料的研究与开发。这些医用材料的研究 与开发往往基于脱胶的丝素纤维经过高盐溶液溶解后制成的再生液态丝素而实现的。这种液态丝素易受环境条件的影响制成各种形态的丝素生物材料如丝素膜、凝胶、再生纤维、粉末或纳米颗粒以及3D支架等。经过简单的物理或化学处理，这种再生丝素蛋白的结构也容易从无规卷曲转变成α-螺旋(Silk I)或β-折叠(Silk II)结构，这些加工特性就为丝素蛋白开发成为性能优异的生物医用组织工程材料创造了得天独厚的有利条件。
[0004]蚕丝丝素是一种独特的丝素蛋白，通过溶解、脱盐纯化制成液态丝素后，它可以从其天然形态重新改变出其它各种形状或形态。利用再生液态丝素通过多种物理或化学方法如水分挥发等制成丝素蛋白膜已有许多报道和专利申请，将这种液态丝素冻结后进行冷冻干燥制成多孔结构的丝素膜(CN1260363)。近十年来，对丝蛋白特别是丝素蛋白的开发利用已大大超出其原有传统的纺织纤维和医用缝合线的经典用途。例如，水凝胶(W02005/012606 ；PCT/US08/65076)、超薄膜(W02007/016524)、厚膜，保形涂层(W02005/000483 ； W02005/123114)、微球(PCT/US2007/020789)、3D 多孔基质(TO2004/062697)、固形物(TO2003/056297)，微流装置(PCT/US07/83646; PCT/US07/83634),电-光装置(PCT/US07/83639)、从纳米级(W02004/0000915)到几厘米(U.S.Pat.N0.6902932)的再生纤维用于生物医用材料和再生医药(W02006/042287 ;US20070212730 ； PCT/US08/55072)，甚至是纳米级颗粒或药物缓释的固定化酶/药物纳米颗粒(W0 2005/085327 ;W02007/112679)。尤其是在低压电场作用下丝素蛋白在正极附近转变成丝素电凝胶，这种电凝胶主要可以用于医用生物胶水等领域(US20110171239A1或W02010036992A2)。
[0005]丝素溶液加工成为一定形态和质地的丝素生物材料要求特定的探索和个性研发技术。例如，电纺是一个产生纳米级纤维的过程，这种纤维常加工成垫子和管状结构的物品。在这个电纺加工工艺中，常用10 KV~20 KV范围的高压电用来驱动针头中丝素溶液的快速喷射，从而加速凝固成亚微米直径的固体纤维。这种工艺可以平稳堆积成类似于无纺布结构的层状材料(Li et al., Biomaterials.27: 3115-24，2006)。而在电凝胶加工工艺中，浸在高浓度的(常用浓度9%)再生丝素溶液中的正负电极，在低压电场(直流电或交流电)如24.8 V电场作用下，丝素分子在正极周围产生电凝胶，这种丝素电凝胶可以用作医用生物胶粘剂(Yucel et al., J Struct.Biol.170 (2010) 406 - 412)，当电场极性相反时，正极周围产生丝素凝胶又转变称为液态的丝素溶液。所以，电凝胶加工过程中，丝素溶液与丝素凝胶的转变是可以可逆的。也有报道通过电泳沉积技术来制备水凝胶膜(Zhanget al., Journal of Materials Chemistry.2011, 21, 7705)。将丝素溶液和壳聚糖溶液混合成电泳液，使用钛合金板作为电极，在4V, 5v/cnT2的条件下恒压30 S，就可获得丝素-壳聚糖凝胶状涂层材料，这些凝胶涂层材料可以用于细胞培养，也可以作为一种有效的药物载体。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的问题是克服现有技术存在的不足，提供一种具有柔软、弹性特性的纳米多孔性或网络结构的丝素水凝胶膜的制备方法、装置及其应用。 [0007]实现本发明目的的技术方案是提供一种丝素水凝胶膜的制备方法，将盛有水溶性丝素蛋白溶液的内室容器置于盛有电聚缓冲液的外室容器中，内室容器的底部为屏障膜；将内室接负极，外室接正极，在直流电场作用下，于屏障膜上得到一种丝素水凝胶膜；所述屏障膜为截留I~100 kDa以上分子量的纳孔膜；所述水溶性丝素蛋白溶液的质量浓度为
0.5~10% ;所述电聚缓冲液为含质量浓度0.05~5% SDS的盐-甘氨酸系统，甘氨酸的浓度为1.0 mM~1000 mM，盐的浓度为1.0 mM~1000 mM ;用HCl调节电聚缓冲液的pH值为
4.0~10.0 ;所述直流电场为10~200 mA的恒流电场，或50~200 VDC的恒压电场；直流电场的作用时间为10~100 min。
[0008]本发明所述的纳孔膜为亲水性天然高分子材料的纳孔膜，所述的亲水性天然高分子亲水性材料为琼脂糖、葡聚糖膜中的一种。所述的纳孔膜还可以为亲水性合成高分子材料的纳孔膜，所述的亲水性合成高分子材料为聚丙烯酰胺凝胶。所述的纳孔膜也可以为无机材料的纳孔膜，所述的无机材料为陶瓷。所述的纳孔膜为亲水性高分子材料的透析膜，所述的透析膜为再生纤维素透析膜、纤维素酯透析膜。 [0009]本发明所述的盐为无机盐磷酸盐或碳酸盐。也可以为有机盐柠檬酸盐或醋酸盐。
[0010]本发明技术方案在水溶性丝素蛋白溶液中还可以包括生物活性物质酶、多肽药物，或小分子药物。
[0011]一种制备上述丝素水凝胶膜的装置，其结构为:内外容器固定于外室容器中，内室容器底部为屏障膜，所述屏障膜为截留I~100 kDa以上分子量的纳孔膜；内室接通直流电源的负极，外室接通直流电源的正极。
[0012]本发明技术方案还包括将所述的丝素水凝胶膜用作医用组织工程材料人工皮肤、外科手术植入式填充料、细胞培养基质。
[0013]本发明在电聚合的加工过程中，弓丨入一个直流恒流或恒压的电场，在含有或不含有SDS的Tris-甘氨酸缓冲液中，丝素分子在不能穿过的纳孔屏障膜上快速自组装成为ESFHM。在这种充满电聚缓冲液(pH6.50)的容器中，被一种纳孔屏障膜(仅限制生物高分子如丝素通过的薄膜)分隔成内、外二室，外室插入钼丝或钼板阳极，内室插入钼丝或钼板阴极并额外加入丝素蛋白溶液。在恒压13 VDC/cm2或恒流6 mA/cm2情况下,丝素分子在SDS包裹下带大量的负电荷，在电场作用下均匀地向正极方向移动，因不能穿过纳孔屏障膜，故在此纳米膜上快速自组装形成ESFHM。
[0014]本发明的丝素蛋白电聚膜的加工工艺较简单，丝素蛋白分子在电聚缓冲液中与阴离子去污剂SDS结合后带大量的负电荷，在较高的直流电场作用下像其它带电的小分子或离子一样，向正极方向运动。带电的小分子或离子因体积小能穿透安装在内、外室中间的纳米孔径屏障膜，而巨大的丝素蛋白分子无法穿透纳孔屏障膜，从而在纳孔屏障膜上快速自组装堆积形成具有多孔结构的丝素水凝胶膜。
[0015]屏障膜是小分子或离子能通过而生物大分子无法穿透的纳米孔径的有机膜或无机膜，纳孔有机膜主要是指聚丙烯酰胺凝胶膜、透析膜或其它高分子聚合膜等；纳孔无机膜主要是指陶瓷膜等。聚丙烯酰胺凝胶膜的孔径大小由凝胶含量而定；透析膜的孔径大小可以选用市售截留不同分子量范围的透析膜而定。这种限制丝素分子通过的高分子聚合膜或无机膜起到了生物高分子电聚合的关键作用。
[0016]在Tris-甘氨酸电聚缓冲液(最佳方案为ρΗ6.5)加入质量浓度0.05~5% (最佳方案为0.2% )的SDS对液态丝素电聚成丝素膜同样起到关键的作用，但过多、过少或甚至没有SDS，虽然也能形成水凝胶膜，但影响ESFHM的特性如弹性、平整程度或透明程度等。
[0017]电聚形成的丝素水凝胶膜比其它方法形成的丝素膜或丝素3D材料更具有优越性，如靠水份挥发形成的丝素膜。后者形成的丝素膜需经过其他物化处理后才能成为不溶于水的膜，水溶液中此膜弹性、伸缩性、吸水性有限；湿态电聚丝素水凝胶膜(ESFHM)非常柔软、富有弹性，吸水能力是其自身重量10倍左右，在体外能被蛋白酶降解，在生物体内能缓慢分解、无明显免疫反应和炎症反应；同时在体外细胞也易在其表面粘附、增殖与生长。
[0018]电聚形成的丝素水凝胶膜比靠水份挥发形成的丝素膜更具有优越性，特别是这种水凝胶膜的纳米多孔性或网络结构。电聚过程中，因带电小分子的电泳动，使电聚形成的丝素水凝胶膜成为纳米多孔性。
[0019]ESFHM制备时，两端应用的恒压或恒流直流电场特别重要，它的大小直接影响ESFHM的柔软、弹性等特性。
[0020]在ESFHM中若要加入活性物质如药物等，可以将这些活性物质加入到再生液态丝素中。通过电场的作用，这些活性物质就可以嵌入到ESFHM中。这些具有活性物质的ESFHM在作为医用组织工程材料如人工皮肤、3D支架时具有重要的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是本发明实施例提供的一种丝素水凝胶膜的制备装置的结构示意图；
图2是本发明实施例提供的丝素水凝胶膜用甲醇浸溃处理前(ESFHM)后(ESFHM-M)的红外吸收光谱；
图3本发明实施例 提供的丝素水凝胶膜用甲醇浸溃处理前(曲线ESFHM)后(曲线ESFHM-M)的X-衍射分析图谱；
图4本发明实施例提供的丝素水凝胶膜用甲醇浸溃处理前(ESFHM)后(ESFHM-M)的热分析图谱；
图5是本发明实施例提供的丝素水凝胶膜的扫描电镜图片；a图为在无SDS的缓冲液中制备的丝素水凝胶膜，b图为在含SDS缓冲液中制备的丝素水凝胶膜；
图6是本发明实施例提供的丝素水凝胶膜(ESFHM)在体外的酶解进程曲线图；
图7是本发明实施例提供的丝素水凝胶膜(ESFHM)中利福平的释放曲线图；
图8是本发明实施例提供的丝素水凝胶膜在小鼠血清中TNF-α含量的结果图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图和实施例对本发明技术方案作进一步阐述。
[0023]实施例1
1、再生丝素溶液制备
本发明主要使用以下三种蚕丝脱胶方法:
(I)尿素缓冲液脱胶方法:将蚕茧去衣，剖开去蛹称取质量后加入30倍量体积SM尿素-Tris-H2SO4-0.5M巯基乙醇(ρΗ7.00)的尿素脱胶液，于80°C水浴锅中以150 rpm振荡2h。取出后用去离子水冲洗干净，于80°C干燥2 h,即得完全脱胶的丝素蛋白纤维。 [0024](2)碳酸钠脱胶方法:将蚕茧去衣，剖开去蛹称取质量后加入25倍量体积的质量分数为0.2%的碳酸钠溶液，煮沸30 min，用去离子水冲洗干净后，以同样比例、同样浓度的碳酸钠溶液中再脱胶30 min,以确保去除丝素纤维外粘附的丝胶蛋白。最后用去离子水冲洗干净，于80°C干燥2 h,即得完全脱胶的丝素蛋白纤维。
[0025](3)强碱性电解水脱胶法:将蚕茧去衣，剖开去蛹称取质量后加入25倍量体积的pHll.5强碱性电解水(简称:电解水)煮沸30 min,同样换液重复煮沸I次，以确保去除丝素纤维外粘附的丝胶蛋白。于80 °C干燥2 h,即得完全脱胶的丝素蛋白纤维。
[0026]丝素纤维溶解的方法有以下二种:
(I)溴化锂溶液溶解:将脱胶的丝素蛋白纤维溶于9.3M的溴化锂溶液中，浴比20:I (V/W)，于25 °C恒温摇床中以90 rpm振荡至全部溶解。
[0027](2)氯化钙三元溶剂溶解:将脱胶的丝素蛋白纤维溶于(CaCl2-EOH-H2O=1:2:8)的三元溶剂中，浴比20:1(V/W)于70 °C恒温摇床中以90 rpm振荡至全部溶解。获得的纤维溶液用透析袋(3.5K MWC0)经过净水或去离子水透析48h。透析液用滤纸过滤或离心(8，OOOrpm)分离20min，取上清液获得丝素浓度为4%水溶液(W/V)，置于4 °C存放备用。
[0028]从蚕茧脱胶到丝素纤维溶解与纯化总体分为以下三类:
(1)尿素脱胶和溴化锂溶液溶解(简称:尿素-溴化锂);
(2)强碱性电解水脱胶和三元溶剂溶解(简称:碱性水-三元溶剂)；
(3)碳酸钠溶液脱胶与三元溶剂溶解(简称:碳酸钠-三元溶剂)。
[0029]2、电聚丝素水凝胶膜制备
参见附图1，它是本实施例丝素水凝胶膜的制备装置的结构示意图，分别用两个容器组成内室和外室，内室容器通过内室底座固定于外室容器中，内室容器的底部为纳孔屏障膜，由屏障膜支撑将其固定于内室容器底部，纳孔屏障膜为截留I~100 kDa以上分子量的纳孔膜；内室通过电极接通直流电源的负极，外室通过电极接接通直流电源的正极；将一定体积的Tris-甘氨酸缓冲液(0.2% SDS，pH6.5)加入电聚装置的外室，而一定体积的再生丝素溶液与一定体积的Tris-甘氨酸缓冲液(0.2% SDS，pH6.5)混合后，加入到电聚装置的内室，然后打开电聚装置的直流可控电源(本实施例选用Tanon EPS100，上海天能科技有限公司制造)，调节直流电压80v开始电聚，50 min后切断电源，取出纳孔屏障膜上形成的电聚丝素水凝胶膜，这种柔软的半透明水凝胶膜冲洗后浸于纯水中置于4 °C备用。以甲醇浸溃处理作为对照(简称:ESFHM-M)，将ESFHM浸于80%的甲醇溶液中处理20min，取出后用去离子水冲洗，最后浸于纯水中置于4 °C备用。
[0030]在本发明技术方案中，纳孔屏障膜可以是为亲水性天然高分子材料的纳孔膜，如琼脂糖、葡聚糖膜等；纳孔屏障膜也可为亲水性合成高分子材料，如聚丙烯酰胺凝胶等；还可以是无机材料如陶瓷，及亲水性高分子材料的透析膜，如再生纤维素透析膜、纤维素酯透析膜等。
[0031]在本发明技术方案中，盐为无机盐磷酸盐或碳酸盐，也可以为有机盐柠檬酸盐或醋酸盐。电聚缓冲液为含质量浓度0.05~5% SDS的盐-甘氨酸系统，甘氨酸的浓度为1.0mM~1000 mM，盐的 浓度为1.0 mM~1000 mM ;用HCl调节电聚缓冲液的pH值为4.0~10.0。在水溶性丝素蛋白溶液中还可加入生物活性物质酶、多肽药物，或小分子药物。
[0032]在本发明技术方案中，直流电场为10~200 mA的恒流电场，或50~200 VDC的恒压电场；直流电场的作用时间为10~100 min。
[0033]3、电聚丝素水凝胶膜的结构测定
采用YG021单纱强力机(本实施例选用常州第二纺织仪器厂有限公司)分析ESFHM的机械性能，结果参见表1，测试速度10 mm/min ;采用KES-FB3型Compression Tester分析ESFHM的压缩性能，结果参见表2 ;采用Varian傅里叶红外光谱分析仪(本实施例选用Nicolet 6700 ；Thermo Fisher, USA)对ESFHM进行红外光谱扫描，结果参见附图2，扫描次数32次，分辨率I cnT1; ESFHM的X-衍射分析结果参见附图3;采用Pyris-1 D碳酸钠、TGA、TMA-7型热分析仪(美国PE公司)进行ESFHM热分析，N2保护条件下，升温速率200C /min，温度为50~350 °C，测定样品的D碳酸钠曲线参见附图4 ;将ESFHM用去离子水反复冲洗去除表面残留的盐离子，洗净后通过戊二醛-锇酸固定液进行双固定，经过磷酸盐缓冲液冲洗后进行剪切固定，喷金后在扫描电镜(本实施例选用S-4700，日本日立公司)上，在15 kV电压下观察ESFHM超微结构参见附图5 ；a图为在无SDS的缓冲液中制备的丝素水凝胶膜，b图为在含SDS缓冲液中制备的丝素水凝胶膜。所提供的多孔丝素水凝胶膜可用作医用组织工程材料人工皮肤、外科手术植入式填充料、细胞培养基质等。
[0034]4、电聚丝素水凝胶膜的体外酶降解
为了测定电聚丝素水凝胶膜在体外的酶解特性，水凝胶膜样品浸入分子量为13万的中性蛋白酶(酶活性浓度为4 U/ml)溶液中，浴比1:50，于371:恒温摇床中轻微振荡降解(90 rpm)。在1，2，3，4天时取出水凝胶膜称重，并将含有降解产物的酶溶液用新配制的酶溶液换掉，结果参见附图6。
[0035]5、药物缓释实验
本发明选取利福平这种药物作为包埋对象。电聚后将含有药物的电聚膜表面使用去离子水冲洗，定量后置于5mL的EP管中，加入pH7.4的磷酸盐缓冲液。在固定的时间段吸取上清液并使用 Spectra Max M5 型酶标仪(Tuv Rheinland of North American.1nc.)在475 nm处测定上清液的吸光度值，绘制药物释放曲线，结果参见附图7。[0036]6、细胞培养实验
在含小牛血清10 %的DMEM-H30243.0lB (Thermo HyClone)培养基中添加1.8%Penstrep (invitrogen)和 1.1% L-Glutamine (invitrogen)配制成细胞培养基,用于培养L-929小鼠成纤维细胞。电聚丝素水凝胶膜使用75%酒精浸泡24h消毒，PBS冲洗后加到48孔细胞培养板中，在细胞培养之前加入事先配置好的培养基500 μ L作为实验组过夜处理。对照组仅加入500 μ L培养基，将细胞浓度约为1.5X104 cells/mL的细胞悬浮液加入培养板中，每孔中加入100 UL0每组均设3个复孔，在37°C，5% CO2细胞培养箱中培养。采用3块48孔板分别培养3，4，5天，结果参见附图8。待培养到相应的时间点时，从培养箱中取出培养板，采用Te2000-U型倒置荧光显微镜(Nikon，Japan)观察细胞的生长形态。并采用MTT法处理试样，每孔加入5 mg/mL MTT 500 μ L，继续培养4 h，弃上清液，加入二甲基亚讽(DMSO) 500 μ L,震荡 10 min,用 Spectra Max M5 型酶标仪(Tuv Rheinland ofNorth American.1nc.)在570 nm处测定吸光度值,绘制细胞生长曲线，结果参见表3。
[0037]7、体内植入实验
本发明采用清洁级体重为35~40g的雄性ICR小鼠为实验对象，实验分为3组，每组4只小鼠。空白对照组:小鼠进行假手术，切开后再缝合；实验组:小鼠背部皮下填充经75%乙醇24h灭菌的电聚丝素水凝胶膜；阳性对照组:再生丝素溶液冻干后经75%乙醇24h灭菌再植入小鼠背部皮肤内。手术2、4、6、8周后观察小鼠手术部位的外观，体内水凝胶膜的降解情况。小鼠眼球取血，分离血清，检测血清中炎症因子的表达，结果参见附图8。
[0038]表1.ESFHM的拉伸特性
【权利要求】
1.一种丝素水凝胶膜的制备方法，其特征在于:将盛有水溶性丝素蛋白溶液的内室容器置于盛有电聚缓冲液的外室容器中，内室容器的底部为屏障膜；将内室接负极，外室接正极，在直流电场作用下，于屏障膜上得到一种丝素水凝胶膜； 所述屏障膜为截留I~100 kDa以上分子量的纳孔膜； 所述水溶性丝素蛋白溶液的质量浓度为0.5~10% ； 所述电聚缓冲液为含质量浓度0.05飞％ SDS的盐-甘氨酸系统，甘氨酸的浓度为1.0mM~1000 mM，盐的浓度为1.0 mM~1000 mM ;用HCl调节电聚缓冲液的pH值为4.0~10.0 ； 所述直流电场为10~200 mA的恒流电场，或50~200 VDC的恒压电场；直流电场的作用时间为10~100 min。
2.根据权利要求1所述的一种丝素水凝胶膜的制备方法，其特征在于:所述的纳孔膜为亲水性天然高分子材料的纳孔膜，所述的亲水性天然高分子亲水性材料为琼脂糖、葡聚糖膜中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种丝素水凝胶膜的制备方法，其特征在于:所述的纳孔膜为亲水性合成高分子材料的纳孔膜，所述的亲水性合成高分子材料为聚丙烯酰胺凝胶。
4.根据权利要求1所述的一种丝素水凝胶膜的制备方法，其特征在于:所述的纳孔膜为无机材料的纳孔膜，所述的无机材料为陶瓷。
5.根据权利要求1所述的一种丝素水凝胶膜的制备方法，其特征在于:所述的纳孔膜为亲水性高分子材料的透析膜，所述的透析膜为再生纤维素透析膜、纤维素酯透析膜。
6.根据权利要求1所述的一种丝素水凝胶膜的制备方法，其特征在于:所述的盐为无机盐磷酸盐或碳酸盐。
7.根据权利要求1所述的一种丝素水凝胶膜的制备方法，其特征在于:所述的盐为有机盐柠檬酸盐或醋酸盐。
8.根据权利要求1所述的一种丝素水凝胶膜的制备方法，其特征在于:水溶性丝素蛋白溶液中包括生物活性物质酶、多肽药物，或小分子药物。
9.一种制备丝素水凝胶膜的装置，其特征在于:内外容器固定于外室容器中，内室容器底部为屏障膜，所述屏障膜为截留I~100 kDa以上分子量的纳孔膜；内室接通直流电源的负极，外室接通直流电源的正极。
10.一种丝素水凝胶膜的应用，其特征在于:将所述的丝素水凝胶膜用作医用组织工程材料人工皮肤、外科手术植入式填充料、细胞培养基质。
【文档编号】A61L27/22GK103981561SQ201410221710
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月23日 优先权日:2014年5月23日
【发明者】王海燕, 张雨青 申请人:苏州大学