一种银杏叶提取物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种银杏叶提取物及其制备方法和应用。本发明所述的银杏叶提取物中总银杏萜内酯的含量为6％～12％(w/w)，总黄酮含量为30％～70％(w/w)，原花青素含量为20％～60％(w/w)，总银杏萜内酯％+总黄酮％+原花青素％>90％，且总黄酮醇苷含量20％～50％(w/w)，其可作为制备用于预防或治疗神经系统疾病，如糖尿病性白内障、糖尿病性视神经病变或糖尿病性视网膜脂血症的食品、保健食品或药品。其制备方法包括：乙醇水溶液提取银杏叶，提取液浓缩至稠膏，冷水浸提稠膏，过滤后，滤液用大孔树脂吸附分离，洗脱液浓缩干燥后得银杏叶提取物。
【专利说明】一种银杏叶提取物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及天然植物提取物，具体涉及从一种银杏叶提取物及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 各国药典中收载的银杏叶提取物活性成分为黄酮和内酯，如《中国药典》2010年 第一版收载银杏叶提取物含量测定仅限定总黄酮醇苷和银杏内酯的含量分别不得低于 0. 40%、0. 25%。但近年来，越来越多的报道提示原花青素是植物界中抗氧化能力最强的成 分之一，对心脑血管疾病、神经系统疾病等的预防和治疗均具有很好的作用。而且，银杏叶 中含有资源丰富的原花青素，其在银杏叶干品中的含量可达0.5%?4%，甚至更高。因此， 从银杏叶中同时提取黄酮、内酯、原花青素用于开发药物具有良好的发展前景。
[0003] 但目前为止，银杏叶中的原花青素开发利用还比较缺乏，大部分文献研究仍然集 中在提高总黄酮、内酯的含量方面，提取物中原花青素的含量仍然偏低，如CN1660224公 开了一种葡萄提取物1-99%、银杏叶提取物1-99%的抗氧化组合物，葡萄提取物含有原 花青素（葡萄籽中的原花青素成分与银杏叶中的原花青素成分不同，后者抗氧化能力强 于前者）和白藜芦醇，银杏叶提取物含有黄酮类物质，或同时含有黄酮类物质和内酯类物 质；CN100421680公开了银杏叶提取物及其制备方法和应用，银杏叶提取物中银杏总黄酮 >64%，银杏总内酯>11 %，原花青素类化合物含7-10 %。
[0004] 因此，开发一种原花青素、黄酮、内酯含量都较高的银杏叶提取物，对于银杏叶的 综合利用、疾病的治疗都具有重要的价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供了一种银杏叶提取物及其制备方法和应用，该提取物中银 杏萜内酯、黄酮和原花青素三者的含量超过90%，其中，总银杏萜内酯的含量为6%?12% (w/w)，总黄酮含量为30 %?70 % (w/w)，原花青素含量为20 %?60 % (w/w)，且总黄酮醇 苷含量20 %?50% (w/w)。
[0006] 为了获得更好的药理活性，上述银杏叶提取物中，总银杏萜内酯的含量为6%? 12% (w/w)，总黄酮含量为40 %?60 % (w/w)，原花青素含量为30 %?50 % (w/w)，且总黄 酮醇苷含量24%?32% (w/w)，原花青素/总黄酮醇苷含量比值1?2。
[0007] 本发明的另一目的是提供了一种银杏叶提取物的制备方法，具体制备步骤如下：
[0008] 1)银杏叶经粉碎后，用乙醇溶液30?90% (v/v)提取，共2?3次，每次1?3 小时，每次乙醇溶液用量为银杏叶的3?10倍，获得提取液；
[0009] 2)回收提取液至黑色黏稠状浸膏；
[0010] 3)浸膏冷却至低于30°C，用水浸提浸膏，水的用量为浸膏的3?10倍，浸提时间 为1?48小时；
[0011] 4)浸提液过滤，滤液用大孔树脂吸附分离，用乙醇溶液进行洗脱，获得洗脱液；
[0012] 5)洗脱液干燥后即得银杏叶提取物。
[0013] 作为优选方案，
[0014] 步骤1)中，银杏叶经粉碎后，用乙醇溶液60% (v/v)提取，共提取3次，每次1小 时，每次乙醇溶液用量为银杏叶的8倍。
[0015] 步骤2)中，回收提取液至黑色黏稠状浸膏，该黑色黏稠状浸膏在50°C时，相对密 度为1. 25?L 30。
[0016] 步骤3)中，浸膏冷却至室温后，用4?25°C水浸提8?24h，水的用量为浸膏的6 倍。
[0017] 步骤4)浸提液过滤，滤液用HPD417大孔树脂吸附，水洗后，用乙醇溶液50% (v/ v)洗脱，获得洗脱液；
[0018] 步骤5)洗脱液干燥后即得银杏叶提取物。
[0019] 本发明人发现，本发明提供的银杏叶提取物所含的银杏原花青素含量高达 20-60% (w/w)，总黄酮醇苷为20-50% (w/w)，该银杏叶提取物具有较好的抗氧化作用，可 以改善模型小鼠的神经功能，可用于预防或治疗糖尿病性白内障、糖尿病性视神经病变、糖 尿病性视网膜脂血症等。且当该银杏叶提取物中原花青素：黄酮醇苷含量比例在1 :1?2 : 1之间时，上述作用更强。因此，本发明制备的银杏叶提取物，其可作为制备用于预防或治疗 神经系统疾病的食品、保健食品或药品。
[0020] 本发明以银杏叶为原料，通过醇提、浓缩至稠膏、水浸提、树脂纯化步骤制备目标 产物，获得银杏叶提取物。本发明取得以下有益效果：
[0021] 1、本发明提供了一种银杏叶提取物，银杏萜内酯、黄酮和原花青素三者的含量 >90%，总银杏萜内酯的含量为6%?12% (w/w)，总黄酮含量为40%?60% (w/w)，原花青 素含量为30 %?50 % (w/w)，且总黄酮醇苷含量24%?32 % (w/w)，原花青素/总黄酮醇 苷含量比值1?2,具有更好的药理活性。
[0022] 2、本发明提供了一种银杏叶提取物制备方法，包括醇提、浓缩至稠膏、水浸提、树 脂纯化四个过程，操作简单，对仪器设备的要求低、成本低，适合工业化生产。
[0023] 3、本发明提供的银杏叶提取物制备方法中的步骤3回收提取液至黑色黏稠状浸 膏，用水浸提该稠膏，所得浸提液可以很好的分离溶液和沉淀，仅用滤纸即可以滤清浸提 液，成本低、速度快、且最大程度的保留了原花青素成分，使提取物中的原花青素含量达到 20%以上，具有更好的药理活性。
[0024] 4、本发明提供了一种制备预防或治疗神经系统疾病的药物，可用于治疗糖尿病性 白内障、糖尿病性视神经病变、糖尿性视网膜脂血症。 具体实施方案：
[0025] 下面的实施例，用于进一步说明和描述本发明，但并不意味着本发明仅限于此。
[0026] 实施例1 :原花青素、总黄酮、总黄酮醇苷、总萜内酯含量测定方法
[0027] 1.原花青素含量测定
[0028] 1. 1供试品溶液：精密称取试样粉末100mg，置50ml容量瓶中，精密加甲醇30mL， 超声处理20min，放冷至室温后，加甲醇至刻度，摇匀，取上清液，即得。
[0029] 1. 2原花青素对照品标准曲线制备：取原花青素对照品30mg，精密称定，置50ml容 量瓶中，精密加甲醇30mL，超声处理20min，放冷至室温后，加甲醇至刻度，摇匀，吸取原花 青素对照品溶液〇. 〇, 1. 〇,2. 0,3. 0,4. 0,5. OmL，分别置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。 分别取lml入10ml西林瓶中，再依次加入0. 2ml硫酸铁铵溶液，6ml盐酸-正丁醇（5 :95， V/V)，摇匀，密封，置沸水浴水解40min,水解结束立即置冰水中冷却，于546nm波长处测吸 光度值。以吸光度为纵坐标，对照品浓度为横坐标（mg/mL)，绘制标准曲线。
[0030] 1. 3样品测定：精密吸取供试品溶液lmL，照"1. 2"自"入10ml西林瓶中"起，在 546nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含原花青素的浓度，计算样品中 原花青素的含量。
[0031] 2.总黄酮含量测定
[0032] 2. 1供试品溶液：精密称取试样粉末lOOmg，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25mL，密 塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离 心，取上清液作为供试品溶液。
[0033] 2. 2芦丁对照品标准曲线制备：精密吸取芦丁对照品溶液0. 0,1. 0, 2. 0, 3. 0,4. 0， 5.0,6.〇1^，分别置251^量瓶中，加水至61^，加入5%亚硝酸钠溶液11^，摇匀，放置611^11， 加10%硝酸铝溶液lmL，摇匀放置6min，加氢氧化钠试液10mL，摇勻，再加水至刻度，摇匀， 放置15分钟，以0. OmL对照品溶液制得的溶剂为空白，在波长510nm处分别测定吸收度值。 以吸光度为纵坐标，对照品浓度为横坐标（mg/mL)，绘制标准曲线。
[0034] 2. 3样品测定：精密吸取供试品溶液2mL，至25mL量瓶中，照"2. 2"自"加水至6mL" 起，在510nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含总黄酮的浓度，计算样 品中总黄酮的含量。
[0035] 3.总黄酮醇苷含量测定
[0036] 3. 1供试品溶液的制备：精密称取试样粉末35mg，置250ml茄型瓶，加甲醇-25% 盐酸（4 :1)混合液25ml，90°C加热回流30分钟，回流结束时取出放冷，提取液转移至50ml 容量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得。
[0037] 3. 2对照品溶液制备：分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素对照品、 山奈素对照品、异鼠李素对照品（中国药品生物制品检定所），加甲醇制成每lml分别含 30ug、30ug、20ug的混合液，即得。
[0038] 3. 3HPLC测定（理论板数按槲皮素峰计算不低于2500):以十八烷基硅烷键合硅胶 为填充剂；甲醇-〇. 4%磷酸溶液（50 :50)为流动相；检测波长：360nm ;进样量：10ul ;
[0039] 3.4含量计算：总黄酮苷含量=(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含 量）X2. 51
[0040] 4.总萜内酯的含量测定
[0041] 4. 1供试品溶液制备：精密称取试样粉末150mg，置10ml容量瓶中，加甲醇适量， 超声处理30min，取出放冷后甲醇定容；精密量取5ml，过酸性氧化铝柱（200-300目，3g，内 径lcm，甲醇湿法装柱），用甲醇25ml洗脱；收集洗脱液，回收至干，残渣用5ml甲醇转移至 l〇ml容量瓶中，加水约4. 5ml，超声30min ;超声结束后取出放冷，加甲醇定容，摇匀即得。
[0042] 4. 2对照品溶液制备：取内酯对照品适量，精密称定，加50%甲醇分别制成每lml 含银杏内酯A 0. 14mg、银杏内酯B 0.08mg、银杏内酯C 0.06mg、白果内酯0. 20mg的混合溶 液，即得。
[0043] 4. 3HPLC测定：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-四氢呋喃-水 (25 :10 :65)为流动相；检测器：蒸发光散射检测；流速：1. Oml/min ;柱温：30°C;进样量：对 照品溶液l〇ul、20ul，供试品溶液10-20ul。理论板数按白果内酯峰计算应不低于3000。 [0044] 4. 4含量计算：用外标两点对数方程分别计算银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C 和白果内酯的含量，即得。
[0045] 实施例2 :提取溶剂的选择
[0046] 称取15g银杏叶，置250ml茄型瓶，分别加入7倍量提取溶剂（30%乙醇、40%乙 醇、50 %乙醇、60 %乙醇、70 %乙醇、80 %乙醇、90 %乙醇），分别回流提取3次，每次提取lh， 测定原花青素、总黄酮、总黄酮醇苷和总萜内酯转移率。
[0047] 表1提取溶剂对有效成分转移率的影响
[0048]
【权利要求】
1. 一种银杏叶提取物，其特征在于，总银杏萜内酯的含量为6%?12% (w/w)，总黄酮 含量为30%?70% (w/w)，原花青素含量为20%?60% (w/w)，总银杏萜内酯％ +总黄酮％ +原花青素％ >90 %,且总黄酮醇苷含量20 %?50 % (w/w)。
2. 根据权利要求1所述的一种银杏叶提取物，其特征在于，总银杏萜内酯的含量为 6%?12% (w/w)，总黄酮含量为40%?60% (w/w)，原花青素含量为30%?50% (w/w)， 总银杏萜内酯％ +总黄酮％ +原花青素％ >90%，且总黄酮醇苷含量24%?32% (w/w)，原 花青素/总黄酮醇苷的含量比值为1?2。
3. 根据权利要求2所述的一种银杏叶提取物，其特征在于，银杏叶提取物中总银杏萜 内酯的含量为8% (w/w)，总黄酮含量为39% (w/w)，原花青素含量为48% (w/w)，且总黄酮 醇苷含量24% (w/w)。
4. 权利要求1或2或3所述的一种银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，1)银杏叶 经粉碎后，用乙醇溶液30?90% (v/v)提取，共2?3次，每次1?3小时，每次乙醇溶液 用量为银杏叶的3?10倍，获得提取液；2)回收提取液至黑色黏稠状浸膏；3)浸膏冷却至 低于30°C，用水浸提浸膏，水的用量为浸膏的3?10倍，浸提时间为1?48小时；4)浸提 液过滤，滤液用大孔树脂吸附分离，用乙醇溶液进行洗脱，获得洗脱液；5)洗脱液干燥后即 得银杏叶提取物。
5. 根据权利要求4所述的一种银杏叶提取物的制备方法，其特征在于：1)银杏叶经粉 碎后，用60%乙醇溶液（v/v)提取3次，每次1小时，每次乙醇溶液用量为银杏叶的8倍；2) 回收提取液至黑色黏稠状浸膏；3)浸膏冷却至室温后，用4?25°C水浸提8?24h，水的用 量为浸膏的6倍；4)浸提液过滤，滤液用HPD417大孔树脂吸附，水洗后，用50% (v/v)乙醇 洗脱，获得洗脱液；5)洗脱液干燥后即得银杏叶提取物。
6. 根据权利要求5所述的一种银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，步骤2)中回收 提取液至黑色黏稠状浸膏，该黑色黏稠状浸膏在50°C时，相对密度为1. 25?1. 30。
7. 根据权利要求1或2或3所述的一种银杏叶提取物，其可用于制备预防或治疗神经 系统疾病的保健食品或药品。
8. 根据权利要求1或2或3所述的一种新银杏叶提取物，其可用于制备预防或治疗糖 尿病性白内障、糖尿病性视神经病变或糖尿病性视网膜脂血症的食品、保健食品或药品。
【文档编号】A61P27/12GK104147054SQ201410389198
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月8日 优先权日:2014年8月8日
【发明者】乔洪翔, 王如伟, 胡江宁, 陈琳, 何厚洪, 瞿伟, 陈玲芳, 吕丽丽 申请人:浙江康恩贝制药股份有限公司, 浙江康恩贝药品研究开发有限公司