生物活性移植物和复合材料的制作方法

生物活性移植物和复合材料的制作方法
【专利摘要】公开了多种生物活性移植物及其制造方法。在一个实施方案中，骨材料从供体收获。所收获的骨材料被暴露于溶解剂，溶解剂被构建成从所收获的骨材料的细胞物质中释放生长因子和生物活性材料。接着，用漂洗剂漂洗所收获的骨材料。所收获的骨材料的pH可以被基本上中和。
【专利说明】生物活性移植物和复合材料
[0001] 本申请是申请日为2009年12月13日，申请号为200980155596. X，发明名称为"生 物活性移植物和复合材料"的申请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求享有2008年12月13日提交的题目为"STIMULATIVE GROWTH AGENTS DERIVED FROM PHYSIOLOGICAL FLUIDS AND METHOD OF MAKING (从生理流体获得的刺激 生长剂及其制造方法）"的美国临时申请系列第61/201，612号的权益，该临时申请在此 通过引用以其整体并入。本申请要求享有2009年9月7日提交的题目为"BI0ACTIVE ALLOGRAFTS AND COMPOSITES(生物活性的同种异体移植物和复合材料）"的美国临时申请 系列第61/240, 283号的权益，该临时申请在此通过引用以其整体并入。
[0004] 背景
[0005] 骨移植物，无论是同种异体移植物、自体移植物还是异种移植物，它们可以被使用 在遭受疼痛或与骨架结构的不稳定或畸形有关的其他异常情形的患者体内。作为非限制 性的实例，遭受脊柱不稳定或一根或多根椎骨过度移动的患者可以用脊柱融合过程治疗， 该过程包括去除位于两根椎骨之间的椎间盘的一部分。骨移植物或脊柱植入物或两者的 组合随后可以被插入到去除的椎间盘的区域内或其周围以促进两根相邻的椎骨的融合。 这样的骨移植物或脊柱植入物可以包括所收获的由皮质骨材料、松质骨材料、皮质松质骨 (corticocancellous bone)材料或所有三种前述类型的骨材料的组合制成的骨碎片。患者 还可能遭受各种退变性症状，骨移植物的植入可以作为一种治疗而被选择用于这样的退变 性症状。


【发明内容】

[0006] 本发明提供了一种制造骨诱导性植入物的方法，包括下述步骤：从供体收获松质 骨材料；从收获的骨材料提取至少一个碎片；将所述至少一个碎片暴露于溶解剂，所述溶 解剂被构建成使生长因子和生物活性材料从所述收获的骨材料的细胞物质释放，所述溶解 剂还包括具有至少1 %的浓度和约〇. 2M至17M的摩尔浓度范围的乙酸；漂洗所述收获的骨 材料以进一步清洁所述至少一个碎片或基本上中和所述至少一个碎片的pH ;其中所述漂 洗剂是下述物质中的至少一种：水、盐水、过氧化物、醇类、类晶体、抗生素溶液、保存液和储 存剂；通过进行下述方法中的至少一种来脱水所述收获的骨材料：蒸发、真空干燥和冻干； 和通过真空密封来封装所述收获的骨材料；其中在所释放的生长因子和生物活性材料的至 少一部分结合到所述收获的骨材料之后，进行漂洗所述收获的骨材料和基本上中和所述收 获的骨材料的pH的步骤。
[0007] 本发明提供了一种制造骨诱导性植入物的方法，包括下述步骤：
[0008] 从供体收获骨材料；将收获的骨材料暴露于溶解剂，所述溶解剂被构建成使生长 因子和生物活性材料从所述收获的骨材料的细胞物质释放；和用漂洗剂漂洗所述收获的骨 材料。
[0009] 本发明的方法还可包括下述步骤：基本上中和所收获的骨的所述pH。
[0010] 本发明的方法还可包括下述步骤：将所述收获的骨材料成形为植入到身体中的形 状。
[0011] 在本发明的方法中，所述收获的骨材料可以是松质骨，所述溶解剂抑制所释放的 生长因子和生物活性材料结合到所述收获的骨材料，且将所述收获的骨材料暴露于所述溶 解剂的步骤产生包含增溶的生长因子和生物活性材料的溶解产物流体混合物。本发明的方 法还可包括下述步骤：从所述供体收获皮质骨材料；将所述溶解产物混合物与收获的皮质 骨材料组合，其中组合步骤使所述增溶的生长因子和生物活性材料结合到所述收获的皮质 骨材料；和将所述收获的皮质骨材料成形为植入到身体内的形状。本发明的方法还可包括 下述步骤：在结合所述生长因子之前或之后，使所述收获的皮质骨材料脱矿质。
[0012] 在本发明的方法中，在所释放的生长因子和生物活性材料的至少一部分结合到所 述收获的骨材料之后，可进行漂洗所述收获的骨材料和基本上中和所述收获的骨材料的pH 的步骤。
[0013] 在本发明的方法中，所述漂洗剂可以是下述物质中的至少一种：水、盐水、过氧化 物、醇类、类晶体、抗生素溶液、保存液和储存剂。在本发明的方法中，所述漂洗剂可进行基 本上中和所述收获的骨材料的pH的步骤。
[0014] 在本发明的方法中，所述溶解剂可以是下述物质中的至少一种：乙酸、盐酸、柠檬 酸、磷酸、硫酸、硝酸、羧酸或无机酸。
[0015] 在本发明的方法中，所述溶解剂可以是具有至少3 %的浓度和约0. 2M至17M的摩 尔浓度范围的乙酸。
[0016] 在本发明的方法中，所述溶解剂可允许所释放的生长因子和生物活性材料结合到 所述骨材料。
[0017] 在本发明的方法还可包括下述步骤：将所述收获的骨材料暴露于机械溶解条件以 使生长因子和生物活性材料从所述收获的骨材料的细胞物质释放。在本发明的方法中，所 述机械溶解条件可进一步包括下述中的至少一种：热分解、微流体、超声、电击、研磨、珠磨、 均化、离心、弗氏压碎、碰撞、剪切、压力和真空力。
[0018] 本发明的方法还可包括下述步骤：使所述收获的骨材料脱水。
[0019] 在本发明的方法中，脱水步骤还可包括下述中的至少一种：蒸发、真空干燥和冻 干。
[0020] 本发明提供了一种骨植入物，其由包括下述步骤的方法制造：从供体收获骨材料； 将收获的骨材料暴露于溶解剂，所述溶解剂被构建成使生长因子和生物活性材料从所述收 获的骨材料的细胞物质释放，所述溶解剂还被构建成允许所释放的生长因子和生物活性材 料的至少一部分结合到所述收获的骨材料；用漂洗剂漂洗所述收获的骨材料；和基本上中 和所述收获的骨材料的pH。
[0021] 附图简述
[0022] 参考下面的附图可以更好地理解本公开内容的许多方面。附图中的部件并不一定 按比例绘制，而是将重点放在清楚地阐释了本公开内容的原理。此外，在附图中，相同的参 考数字指代整个若干幅图中的相应部件。
[0023] 图1是阐释了根据本公开内容的一个实施方案的流程图。
[0024] 图2是阐释了根据本公开内容的一个实施方案的流程图。
[0025] 图3是阐释了根据本公开内容的一个实施方案的流程图。
[0026] 图4是阐释了根据本公开内容的一个实施方案的流程图。
[0027] 图5是阐释了根据本公开内容的一个实施方案的流程图。
[0028] 图6是阐释了根据本公开内容的一个实施方案的流程图。
[0029] 图7是阐释了根据本公开内容的一个实施方案的流程图。
[0030] 图8是阐释了根据本公开内容的一个实施方案的流程图。
[0031] 图9是阐释了根据本公开内容的一个实施方案的流程图。
[0032] 图10是阐释了根据本公开内容的一个实施方案的流程图。
[0033] 图11是阐释了根据本公开内容的一个实施方案的流程图。
[0034] 详述
[0035] 本公开内容的多个实施方案涉及刺激组织生长的生物活性因子。正如可以理解 的，这些生物活性因子可以从包含细胞的生理溶液得到。生理溶液可以以体内天然的溶液 存在或可以源自于提取细胞时的组织。包含细胞的任何组织可以是生理流体的来源，诸如， 如中胚层组织、内胚层组织和外胚层组织。这些组织的实例包括骨髓、血液、脂肪、皮肤、肌 肉、脉管系统、软骨、韧带、腱、筋膜、心包、神经和头发。这些组织还可以包括器官，诸如胰 脏、心脏、肾脏、肝脏、肠、胃和骨。在由本发明处理之前，可以浓缩细胞。
[0036] 本公开内容的一个实施方案涉及由细胞骨组织制成的骨诱导性植入物以及制造 骨诱导性植入物的方法。由细胞骨组织制成的植入物可以包括骨诱导性和/或骨传导性材 料以促进植入物插入区域内或其周围的融合和/或新骨的生长。因此，根据一个实施方案， 松质骨、皮质松质骨和/或皮质骨的一部分或其任意组合可以从供体收获。在一个实施方 案中，所收获的材料可以以使所收获的样品中保留尽可能多的骨髓的方式来收获。
[0037] 所收获的样品可以暴露于溶解条件和/或溶解剂以促进其内细胞的溶解以释放 样品内包含的生长因子和营养物。换句话说，所收获的样品可以被暴露于溶解所收获的样 品内的细胞的溶解剂。一旦溶解了细胞组分后，它们释放生长因子和/或生物活性材料，诸 如细胞因子和营养物，以刺激生长、分化和修复。这些生长剂可以是细胞因子，诸如蛋白、激 素或糖蛋白，包括TGF-β家族（包括骨形态发生蛋白）的成员、白细胞介素、干扰素、淋巴 因子、趋化因子、血小板衍生生长因子、VEGF和促进生长、修复组织或再生组织的其他刺激 剂。
[0038] 在其他实施方案中，来自其他组织的细胞可以被溶解以释放可以结合到所收获的 样品的生长剂并被进一步处理成植入物。溶解条件本质上可以是机械的，诸如热分解、微流 体、超声、电击、研磨、珠磨、均化、弗氏压碎（french press)、碰撞、过度剪切、压力、真空力 及其组合。过度剪切可以通过下述方式产生：迅速地移液穿过小孔，以过多的每分钟转数离 心，产生高的重力。温度、压力或流量的快速变化也可以用于溶解细胞组分。溶解条件可以 包括热分解技术，热分解技术可以包括冷冻、冻-融循环和加热以破坏细胞壁。溶解条件还 可以包括微流体技术，该微流体技术可以涉及细胞溶解或皱缩的渗透冲击技术。
[0039] 溶解条件还可以包括施加超声技术，超声技术包括但不限于，声处理、声孔效应、 声化学、声致发光和声空化。溶解条件还可以包括电击技术，例如电穿孔和暴露于高压和/ 或高电流源。溶解条件可以进一步包括研磨或珠磨技术，此技术物理碰撞或研磨细胞，以便 使细胞膜破裂，释放包含在其内的刺激剂。
[0040] 通过将所收获的样品的细胞暴露于溶解剂也可以实现溶解，溶解剂可以促进刺激 生长剂的释放，包括因 pH不平衡、暴露于洗涤剂、酶、病毒、溶剂、表面活性剂、溶血素及其 组合引起的溶解。因 pH不平衡引起的化学导致的细胞溶解可以涉及所收获的样品的细胞 暴露于溶解剂，以便破坏细胞壁并释放可溶的生长因子。在一些实施方案中，溶解剂可以包 括一种或多种酸和/或碱。
[0041] 在暴露于溶解剂之后，所收获的样品可以被暴露于缓冲剂或其他溶液以基本上中 和生长因子和溶解剂的混合物的pH。在一些实施方案中，可以期望pH是酸性（如，pH低于 7)或碱性（如，pH高于7)以保留特定生长因子或生物活性剂的溶解度。例如，骨形态发生 蛋白（尤其是81^-2、81^-4、81^-6、81^-7、81^-9、81^-14和其他骨形态发生蛋白1-30)在 低于7的酸性pH值下比在中性pH或碱性pH下易溶解。
[0042] 在其他实施方案中，溶解剂可以包括挥发性酸或碱，诸如乙酸或氨，而细胞物质在 暴露于溶解剂之后可以通过干燥技术被中和或部分中和，干燥技术诸如蒸发、真空干燥、冻 干、冷冻干燥、升华、沉淀和类似的过程，正如能够了解的。在另外其他的实施方案中，溶解 剂可以包括洗涤剂，洗涤剂可以破坏细胞壁并去除可能围绕细胞的任何脂质屏障。酶、病 毒、溶剂、表面活性剂和溶血素也可以帮助裂开或去除外部的细胞膜，释放其内包含的生物 活性生长剂。
[0043] 使用这些溶解剂和/或将所收获的样品暴露于溶解条件可以跟着是如上所述的 中和，和/或去除任何不期望的残余物的另外的第二过程。可以将溶解过程释放的生长剂、 营养物等添加到载体，诸如合成的支架、生物支架和自体移植物、同种异体移植物、异种移 植物组织。在另外其他的实施方案中，作为载体的所收获的样品可以被暴露于溶解条件和 /或溶解剂，且由溶解过程释放的生长因子可以被结合到样品的至少一部分。换句话说，由 细胞物质的溶解释放的生长剂可以立即用于自体移植应用。在其他实施方案中，所释放的 生长剂可以被储存用于同种异体移植应用。储存技术可以包括冷冻或冻干以保持生物活 性。生长因子和营养物还可以在所选择的载体上被冷冻或冻干以允许刺激剂完全结合到载 体并允许通过外科医生立即使用。冻干还允许更长的室温贮藏寿命和浓缩成较小体积的机 会。
[0044] 本发明的另一个实施方案涉及从含有细胞的生理溶液获得特定组的生长因子和 营养物。在此实施方案中，细胞如上所述地被溶解且溶解产物溶液经受具有带电表面的材 料，该材料包括但不限于，色谱树脂、陶瓷、矿化组织、脱矿质的组织、软组织以及具有电荷 的其他材料。带电的表面吸引某些刺激生长剂和分子，从溶解产物溶液去除它们。剩余的 生长剂随后可以被用于再生或修复期望的组织类型。类似于前述实施方案，生长剂溶液可 以被进一步浓缩和冷冻或冻干以便延长贮藏寿命。
[0045] 本公开内容的另一个实施方案包括选择性地漂洗、溶解或去除某些细胞组分，同 时保留其他细胞组分。选择性的溶解或去除可以通过上述方法以物理方式来实现。正如能 够了解的，某些细胞可能对不同的溶解机制具有抵抗性。举个非限制性的实例，间充质干细 胞（MSC)是耐细胞溶解和渗透溶解的，这是因为它们抵抗性的细胞壁和不足的细胞体积。 因此，为了实现选择性溶解，渗透溶解可以用于溶解血液或骨髓中的红细胞和白细胞。一旦 非抵抗性的细胞被溶解，所得到的溶液是富集MSC种群的。接着，可以通过离心、荧光激活 细胞分选（FACS)、过滤、磁珠选择和损耗（magnetic bead selection and depletion)和 / 或重力沉降来进一步浓缩溶液。对同种异体移植来说，FACS以及磁珠选择和损耗可用于去 除将造成来自植入物患者的免疫反应的任何剩余的细胞。一旦被植入后，细胞可以以均匀 的方式起作用且按照期望的表型分化。
[0046] 本公开内容的另一个实施方案包括前面两个实施方案的组合。生理溶液可以通过 选择性的溶解被富集且进一步通过离心、FACS、磁珠选择和损耗和/或重力沉降被进一步 浓缩。将富集的生理溶液添加到已经按照前述方法溶解的生理溶液中以便帮助诱导细胞分 化成期望的表型。这些细胞随后可以按期望的方式起作用以再生并修复组织。
[0047] 在另一个实施方案中，松质骨可以被暴露于仅部分溶解存在的细胞种群的弱溶解 剂（诸如，但不限于，小于1M的乙酸）。在此实施方案中，部分溶解释放生长因子并将它们 结合到骨，而其他细胞，诸如间充质干细胞和祖细胞可能仍保持活力并附着到骨。
[0048] 在另一个实施方案中，松质骨可以被暴露于弱溶解剂（诸如水），且然后经受前述 的机械溶解条件（诸如热分解、高/低压力、声处理、离心等）。一旦已经溶解细胞，从含有 生长因子的溶液中去除骨、细胞碎片和碎屑。接着，通过添加酸或另外的质子供体流体可以 使溶液变成带正电的。溶液中的生长因子随后可以使用所描述的技术而被进一步浓缩，冷 冻或冻干成可溶的粉末。在将可溶的粉末在手术期间添加到植入物中之前，可以用流体重 新构建可溶的粉末，或在植入之前，可溶的粉末以干粉末形式被添加到植入物。
[0049] 在另一个实施方案中，骨诱导性生长因子可以由含有细胞的生理流体形成。这些 细胞被按照前述方式溶解且可以被装载到来自与细胞是相同的组织供体的自体移植物骨 上。刺激生长剂可以在冻干或冷冻之前被装载到骨。可以在装载刺激生长剂之前，对骨进 行矿化或脱矿质以允许刺激生长剂更完全地结合。还可以在装载刺激生长剂之前或之后使 骨颗粒化，允许其用在可流动的组合物中。
[0050] 在另一个实施方案中，可以从活体供体、尸体供体或以自体方式收获诸如滑液的 含有细胞的生理流体。流体可以经受所述的机械或化学溶解条件以便增溶生长因子。一旦 从细胞释放生长因子，那么可以通过所述的过程，诸如过滤、离心或重力沉降来去除固体物 质（诸如细胞碎片、碎屑或血小板）。一旦去除了固体物质，那么随后通过添加酸或另外的 质子供体流体可以使溶液变成带正电的。溶液中的生长因子随后可以使用所描述的技术而 被进一步浓缩，冷冻或冻干成可溶的粉末。在将可溶的粉末在手术期间添加到植入物中之 前，可以用流体重新构建可溶的粉末，或在植入之前，可溶的粉末以干粉末形式被添加到植 入物。可选择地，具有或不具有滑液的软骨可以按类似的方式被制备以便修复和再生软骨 或椎间盘。此外，其他组织，诸如肌肉、脂肪、神经、皮肤、心脏组织、血管组织、髓核组织、纤 维环组织或其他固体组织可以按照此方式被制备以用于帮助修复或再生组织。
[0051] 刺激生长剂可以从各种细胞溶液获得。这些溶液可以包括培养的细胞和/或未受 培养的细胞，且来源可以是自体移植的、同种异体移植的或异种移植的。如果细胞来源是同 种异体移植的或异种移植的，那么可以按照前述方法施行至少部分溶解或免疫细胞损耗， 使得刺激生长剂不会引起患者的免疫反应。可选择地，在使用之前，可以去除免疫反应剂， 诸如CD45+细胞和其他白细胞，以减轻或消除免疫反应。这些免疫反应剂可以通过本公开 内容中前述的选择性溶解被去除。
[0052] 本文所述的系统和方法可以用于手术环境，其中期望刺激生长剂植入患者内。虽 然本公开内容描述了用于产生刺激生长剂，尤其是从含有细胞的生理流体或细胞组织得到 的刺激生长剂的方法和系统，但是应理解，方法和系统可以适用于多种医疗应用，包括涉及 以下的医疗应用：再生或修复骨、软骨、肌肉、腱、韧带、脉管系统、脂肪、纤维环、髓核、皮肤、 头发、血液、淋巴结、筋膜、神经、心脏、胰脏、肝脏、眼睛、牙齿、消化组织、呼吸组织、生殖组 织和其他软组织应用，诸如再生性医疗和组织工程。
[0053] 现在参考图1，图1描绘了根据本公开内容的一个实施方案的方法。在图1所阐释 的实施方案中，显示了可适于骨应用的植入物。在图1的实施方案中，在框102中，从尸体、 活体供体回收松质骨，或以自体方式从患者收获松质骨。所收获的松质骨可以被研磨或切 割成期望的形状和构型，正如能够了解的。在收获和切割操作过程中，小心地保留骨内的一 些细胞物质、骨髓和/或血液。在现有技术的植入物中，可以从所收获的骨样品系统性地去 除和/或清洁骨内的骨髓和/或血液。在本公开内容的实施方案中，松质骨可以具有皮质 骨部分，诸如在髂嵴、椎体、髁等中。因此，在一些实施方案中，根据特定应用的需要，松质骨 可以在进一步处理之前使皮质部分被去除。
[0054] 接着，在框104中，将松质骨暴露于乙酸，乙酸起到如上所述的溶解剂的作用。在 一个实施方案中，乙酸浓度可以大于1 %，在〇. 2M-17M的摩尔浓度范围内。乙酸溶解剂用于 溶解保留在松质骨的多孔骨结构内的和骨表面上的细胞。细胞的溶解释放并增溶细胞物质 内包含的生长因子和生物活性材料。乙酸溶解剂还允许增溶的生物活性物结合到骨。在框 106中，在暴露于乙酸溶解剂之后且在生长因子和/或生物活性材料结合到骨之后，可以借 助漂洗剂进一步漂洗并清洁骨。进行漂洗是为了去除多余的乙酸、细胞碎片、脂质和/或碎 屑。另外，在框108中，可以基本上中和所收获的骨的pH。在一些实施方案中，在框106中， 可以通过漂洗剂和漂洗步骤来中和所收获的骨的pH。在其他实施方案中，可以不需要pH中 和。在框110中，可以通过蒸发、真空干燥或冻干进行脱水来将乙酸溶解剂降至微量并使植 入物达到更中性的pH来实现所收获的骨的进一步的pH中和。
[0055] 漂洗溶液可以是水、盐水（NaCl、PBS等）、过氧化物、醇类（异丙醇、乙醇等）、类 晶体、消毒液（抗生素，诸如庆大霉素、万古霉素、杆菌肽、多粘菌素、两性霉素、氨苄西林、 阿米卡星、替考拉宁等）、保存液（DMEM、DMS0、甘露醇、蔗糖、葡萄糖等）、储存剂和/或处理 同种异体移植物时使用的其他流体。所得到的产物得到具有增强的生物活性的松质骨植入 物。在一些实施方案中，可以形成具有增强的生物活性的研磨的粒状填料植入物以及结构 性松质骨植入物。现在参考图2,图2描绘了本公开内容的可选择的实施方案。所描绘的流 程图阐释了形成植入物的方法，植入物由具有来自结合到皮质骨材料的所收获的松质骨的 生物活性物和生长因子的所收获的皮质骨制备。在所描绘的实施方案中，在框202中，从尸 体、活体供体收获皮质骨，和/或以自体方式从患者收获皮质骨。在框204中，也从同一供 体收获松质骨。所收获的皮质骨可以被研磨或切割成期望的形状和构型，这取决于期望的 特定应用。可以清洁并脱矿质皮质骨（如，用盐酸洗涤和/或用柠檬酸处理）以除去其矿 物质成分。所收获的松质骨也可以被研磨或切割成特定的形状或构型，这取决于期望的应 用。在收获和切割操作期间，同样小心地保留松质骨内的骨髓和血液。松质骨可以具有皮 质骨部分，诸如在髂嵴、椎体、髁等中。
[0056] 因此，在一些实施方案中，根据植入物的应用，松质骨可以在进一步处理之前使皮 质部分被去除。接着，在框206中，将松质骨暴露于作为溶解剂的盐酸（如，0. 1M-16M)以溶 解保留在多孔骨结构内的和骨表面上的细胞。细胞的溶解释放和/或增溶细胞物质内包含 的生长因子和生物活性材料。与上面公开的图1中的实施方案相比，盐酸可以被用作溶解 齐IJ，所述溶解剂限制增溶的生长因子和生物活性物结合到松质骨，但它们存在于盐酸和溶 解产物混合物中。接着，在框208中，将溶解产物混合物中的增溶的生长因子和生物活性物 添加到从同一供体收获的皮质骨中。
[0057] 盐酸混合物中的生长因子和生物活性物易于结合到矿化的和/或脱矿质的皮质 骨（如，1分钟一 50小时的结合时间）。在框210中，在结合之后，可以进一步漂洗并清洁皮 质骨以除去多余的盐酸、细胞碎片、脂质和/或碎屑。漂洗溶液可以是水、盐水、过氧化物、 醇类、类晶体、消毒液、保存液、储存剂或处理同种异体移植物中使用的其他流体。在框212 中，皮质骨随后可以经历pH中和，在214中，通过脱水可以实现pH中和，正如上面在一些实 施方案中指明的。还可以通过其他化学剂或物理处理来实现pH中和，正如能够了解的。因 此，可以按此方式制备具有增强的生物活性的研磨的粒状填料植入物以及结构性皮质骨植 入物。
[0058] 现在参考图3,图3描绘了本公开内容的可选择的实施方案。在框302中，从尸体、 活体供体收获和/或回收皮质骨和松质骨，或以自体方式从患者收获皮质骨和松质骨。如 果特定的植入物应用需要的话，那么松质骨和/或皮质骨可以被研磨或切割成期望的形状 和构型。在收获和切割操作过程中，同样小心地保留骨内的细胞物质、骨髓和/或血液。在 图3的实施方案中，在框304中，所收获的松质骨和所收获的皮质骨被研磨，且然后被混合 以产生大体均匀的混合物。如果期望的话，在与松质骨混合之前，可以使用如上所述的盐酸 洗涤技术对皮质骨进行脱矿质。
[0059] 通过与另一种流体（诸如水）混合可以进一步均匀化松质骨和皮质骨混合物，使 得生长因子可以更均匀地分布遍及混合物。接着，在框306中，将包含骨的溶液暴露于作为 溶解剂的乙酸（如，0.1M-17M浓度）以溶解保留在多孔骨结构内的和骨表面上的细胞。细 胞的溶解释放并增溶细胞物质内包含的生长因子和生物活性材料。乙酸还允许增溶的生物 活性物结合到皮质骨和松质骨混合物。可以期望进一步的酸洗涤以对骨进行进一步的脱矿 质，以降低其模量和/或使其更像海绵。任何类型的酸，包括乙酸、盐酸、柠檬酸、磷酸等，可 以用于对骨进行进一步的脱矿质。
[0060] 在框308中，在结合之后可以进一步漂洗并清洁骨以除去多余的酸、细胞碎片、月旨 质和/或碎屑。在一些实施方案中，在框310和312中，骨可以通过蒸发、真空干燥或冻干 进行脱水以除去任何残余的乙酸并中和皮质骨和松质骨混合物的pH。漂洗溶液可以包括 水、盐水、过氧化物、醇类、类晶体、消毒液、保存液、储存剂或处理同种异体移植物中使用的 其他流体。因此，可以按此方式制备具有增强的生物活性的研磨的粒状填料植入物以及结 构性皮质松质骨植入物。
[0061] 现在参考图4,图4描绘了本公开内容的可选择的实施方案。在框402中，从尸体、 活体供体回收松质骨，或以自体方式从患者收获松质骨。如果特定的植入物应用需要，那么 所收获的松质骨可以被研磨或切割成期望的形状和构型。在收获和切割操作过程中，同样 小心地保留骨内的细胞物质、骨髓和/或血液。松质骨可以具有皮质骨部分，诸如在髂嵴、 椎体、髁等中。因此，可以从松质骨去除松质骨的皮质部分。在框404中，松质骨随后可以被 暴露于作为溶解剂的乙酸（如，0.1M-17M)以溶解保留在多孔骨结构内的和骨表面上的细 胞。细胞的溶解释放并增溶细胞物质内包含的生长因子和生物活性材料。乙酸还允许增溶 的生物活性物结合到骨。在框408中，可以使用任何酸来进行至少一次脱矿质洗涤而进一 步使松质骨脱矿质，以改变骨的机械特性并去除矿物质成分，酸包括但不限于，乙酸、盐酸、 柠檬酸、磷酸等。
[0062] 在框410中，在脱矿质洗涤之间可以进行压缩测试以确定给定应用中，骨的柔性 和压缩性水平是否是可接受的。如果骨对期望的应用来说太硬的话，那么可以进行进一步 的脱矿质洗涤。在框411中，一旦达到期望的柔性，那么在结合之后，可以进一步漂洗和清 洁骨以去除多余的乙酸、细胞碎片、脂质或碎屑。在一些实施方案中，在框412和414中，可 以通过蒸发、真空干燥或冻干对骨进行脱水以去除任何残留的乙酸并使植入物达到更中性 的pH。应理解，通过化学试剂或不同于脱水的物理过程可以实现pH中和。漂洗溶液可以是 水、盐水、过氧化物、醇类、类晶体、消毒液、保存液、储存剂或处理同种异体移植物中使用的 其他流体。因此，可以按此方式制备具有增强的生物活性的研磨的粒状填料植入物以及结 构性但柔性/可压缩的松质骨植入物。
[0063] 现在参考图5,图5描绘了本公开内容的可选择的实施方案。在框502中，从尸体、 活体供体收获皮质骨，或以自体方式从患者收获皮质骨。根据植入物的应用，皮质骨可以被 研磨或切割成期望的形状和构型。因此，在框504中，还从与皮质骨的供体相同的供体收获 松质骨。松质骨可以根据植入物的应用被研磨或切割成特定的形状或构型。在收获和切割 操作过程中，同样小心地保留骨内的细胞物质、骨髓和/或血液。松质骨可以具有皮质骨部 分，诸如在髂嵴、椎体、髁等中。因此，在进一步处理之前，松质骨可以具有去除的皮质骨。在 框506中，松质骨被暴露于溶解剂，以溶解保留在多孔骨结构内的和骨表面上的细胞，溶解 剂诸如但不限于，盐酸。
[0064] 在框510和框512中，可以清洁并脱矿质所收获的皮质骨以去除其矿物质成分，矿 物质成分包括但不限于，钙盐。此脱矿质过程可以涉及浸泡在酸中和/或将酸循环真空灌 注到骨的孔内。
[0065] 作为非限制性的实例，采用真空辅助的循环脱矿质方法可以缩短所要求的脱矿质 时间1分钟到59分钟。真空辅助的循环脱矿质循环可以促进基本上均匀地去除整个植入 物的，而不仅仅是表面上的钙矿物质。如果通过将皮质骨浸泡在酸中来施行脱矿质步骤，那 么可能发生非均匀地去除钙矿物质。非均匀地去除钙矿物质可以导致遍布植入物的不同部 分的变化的钙浓度梯度。
[0066] 相比于将样品浸泡在酸中，采用真空辅助的循环脱矿质可以导致更均匀的钙浓 度，得到具有更好的韧性和弹性的更结实的植入物。另外，此过程可以用于降低骨的模量以 更好地匹配患者的手术植入部位处存在的天然机械性能。这对骨质疏松的、骨质减少的患 者、或具有低的骨密度或骨矿物质密度的患者来说可能是有优势的。而且，此均匀降低的模 量在植入部位被去皮质的手术部位方面是有优势的。均匀地去除钙矿物质还可以降低脊柱 融合术中的下沉速率。此外，使用真空辅助的循环脱矿质可以在皮质骨内得到更好的生长 因子保留。
[0067] 在框514中，如果确定皮质骨的模量水平是可接受的，那么此降低模量的皮质骨 或皮质松质骨也可以被制成具有结合的生长因子和/或生物活性材料。溶解所收获的松质 骨的细胞释放并增溶细胞物质内包含的生长因子和生物活性材料。盐酸还限制增溶的生物 活性物和生长因子结合到松质骨。在框515中，将盐酸中增溶的生长因子和生物活性物添 加至从同一供体收获的皮质骨。生长因子和生物活性物易于结合到矿化或脱矿质的皮质 骨。
[0068] 在框516中，在结合之后，可以进一步漂洗和清洁骨以去除过量的盐酸、细胞碎 片、脂质和/或碎屑等。漂洗溶液可以是水、盐水、过氧化物、醇类、类晶体、消毒液、保存液、 储存剂或处理同种异体移植物中使用的其他流体。另外，如果进一步使植入物脱矿质，那么 在结合生物活性物和/或生长因子之前或之后，可以将植入物制成柔性的。因此，可以按此 方式制备具有增强的生物活性的降低模量的结构性骨植入物。
[0069] 现在参考图6,图6描绘了本公开内容的可选择的实施方案。在框602中，从尸体、 活体供体收获骨髓或以自体方式从患者收获骨髓。如果使用尸体供体，那么可以通过在进 行任何骨截取之前收获髓来获得更高量的髓。在一些实施方案中，使用附接至真空线的管 状钻来收获髓也将增大来自尸体供体的骨髓的收率。管状钻的末端在松质骨内分开，允许 真空将髓牵拉通过管进入收集室。
[0070] 在从生命支撑物去除供体之前，从活体供体收获髓也可以被用作髓收获技术，这 是因为随着髓被去除，由生理循环产生的血流将额外的骨髓物质冲到用于进一步抽吸的区 域内。在框406中，在收获髓之后，特定的细胞类型（诸如间充质干细胞、成骨细胞、骨细胞 或其他祖细胞）可以通过过滤、离心、磁珠结合、荧光激活细胞分选（FACS)和/或正如能够 了解的其他细胞分选或浓缩技术来进行浓缩以增大细胞浓度、分级细胞类型或消除溶液中 特定的细胞类型。在框606中，一旦获得期望的细胞种群，可以将细胞种群暴露于前述溶解 技术，诸如暴露于乙酸。
[0071] 一旦将乙酸添加到细胞之后，给予它们时间溶解且生长因子和其他生物活性物被 增溶。可以离心或过滤溶液以消除任何细胞碎片或细胞碎屑。溶液可以经历第二次过滤步 骤以去除其他固体沉淀物，诸如沉淀的血红蛋白。溶液可以经历第三次过滤步骤以浓缩溶 液中的生长因子和其他生物活性物。溶液随后通过诸如冻干的前述方法进行脱水。在框610 中，使溶液成为水溶性的粉末且在框612中，可以在真空下进行密封以增加贮藏寿命。还可 以冷冻该溶液来增加贮藏寿命。此粉末可以富集大量的生物活性分子和/或生长因子，包 括但不限于，BMP-2、VEGF、aFGF、FGF-6、TGF-B1和正如能够了解的其他物质。
[0072] 现在参考图7,图7描绘了本公开内容的可选择的实施方案。在所描绘的实施方案 中，在框702中，从尸体、活体供体回收松质骨，或以自体方式从患者收获松质骨。如果特定 的植入物应用需要，那么所收获的松质骨可以被研磨或切割成期望的形状和构型。在收获 和切割操作过程中，同样小心地保留骨内的骨髓和血液。松质骨可以具有皮质骨部分，诸如 在髂嵴、椎体、髁等中。因此，在进一步处理之前，松质骨可以具有去除的皮质骨。在框704 中，松质骨被暴露于诸如水的溶解剂，以溶解松质骨内包含的细胞。如果诸如肝素的特定 抗凝血剂被用作溶解剂，那么通过溶解细胞释放的生长因子将在溶液中被增溶。如果不使 用抗凝血剂，或如果使用不同的抗凝血剂，诸如柠檬酸钠，那么细胞将被溶解并释放生长因 子，但它们在流体中将不会被充分增溶。
[0073] 在此情形中，在框706中，从流体随后去除骨并在框708中，将诸如酸的增溶剂添 加到流体中以增溶生长因子和其他生物活性物。在框710中，一旦增溶生长因子和其他生 物活性物之后，可以中和和/或冻干流体。如果乙酸被用作增溶剂，那么可能不需要中和， 因为相当大量的乙酸在冻干期间将蒸发。可选择地，其他溶解剂和增溶剂可以用于溶解细 胞并增溶生长因子，防止生长因子和生物活性材料结合到从其收获细胞的松质骨。
[0074] 现在参考图8,图8描绘了本公开内容的可选择的实施方案。在所描绘的实施方案 中，在框802中，从尸体、活体供体回收松质骨，或以自体方式从患者收获松质骨。如果特定 的植入物应用需要，那么松质骨可以被研磨或切割成期望的形状和构型。在收获和切割操 作过程中，同样小心地保留骨内的骨髓和血液。松质骨可以具有皮质骨部分，诸如在髂嵴、 椎体、髁等中。因此，所收获的松质骨的皮质部分可以被去除。在框804中，所收获的松质 骨被暴露于水以选择性地溶解不期望的细胞类型，诸如红细胞、白细胞等。在一些实施方案 中，可以采用1份骨对1份水以及1份骨对200份水的范围的骨对水的比率。未被附着到 骨的任何剩余的有活力的细胞可以按此方式被漂洗掉。另外，使用弱溶解剂（诸如小于1M 的乙酸）可以导致增溶的生长因子结合到骨，但仍保持附着到骨的有活力的祖细胞。
[0075] 诸如间充质干细胞、骨髓基质细胞、祖细胞等的期望的细胞在多孔的骨结构内和 骨表面上仍保持活力。其他前述机械溶解技术，诸如声处理、搅拌引起的剪切、热分解等可 以与水浴结合使用以促进细胞物质的溶解。在溶解时间（如，1分钟-50小时）过去之后， 在框806中添加盐水以使溶液的同渗浓度恢复至生理水平（如约0. 9%的盐）。在溶液恢 复至等渗条件之后，在框808中倾析流体，剩下骨。有效的漂洗也促进未附着到松质骨的不 期望的细胞的去除且在倾析步骤中丢弃它们。
[0076] 在框810中可以将抗生素应用至骨以帮助降低生物负荷水平。可选择地，在一些 实施方案中，在溶解步骤之前，可以将抗生素施用至所收获的松质骨。可以使用的一些抗生 素包括庆大霉素、万古霉素、两性霉素、前面提到的或正如能够了解的其他抗生素，或可以 被用于降低同种异体移植物组织的生物负荷的各种抗生素。在降低生物负荷之后，在框812 中，骨可以被暴露于储存流体或保存液，诸如DMEM、DMS0、蔗糖、甘露醇、葡萄糖等。随后冷 冻骨，直到被融化使用在手术过程中以修复骨骼缺陷。在一些实施方案中，可以在_40°C或 低于-40°C的温度下冷冻骨。
[0077] 现在参考图9,图9描绘了本公开内容的可选择的实施方案。在所描绘的实施方 案中，在脱水之前，可以将上面参考图6和/或图7所描述的实施方案（作为非限制性的实 例）中获得的生长因子和生物活性物添加到可生物降解的或可吸收的聚合物中。因此，在 框902中收获的骨髓可以在框904中经受至少一次过滤过程，正如上面参考图6描述的。在 框906中，所收获的骨髓可以经受溶解剂，也正如上面描述的。
[0078] 在此实施方案中，按照前面的描述收获生长因子和生物活性物并与诸如酸的常用 溶剂一起添加到聚合物中。可生物降解的聚合物可以是蛋白或多糖，诸如胶原、透明质烷、 壳聚糖、明胶等以及两种或更多种聚合物的组合。在框910中，在生长因子和生物活性物被 添加到聚合物之后，混合以获得基本上均匀的溶液。然后可以从基本上均匀的溶液中去除 任何气泡或杂质。如果期望其他物质（例如但不限于，磷酸钙、脱矿质的骨、羟基磷灰石、肝 素、硫酸软骨素等）被嵌入到植入物中，用于生长因子附着、产物降解、和/或机械增强，那 么它们还可以被添加到混合物中。
[0079] 在框912中，在一些实施方案中，可以在_200°C到0°C的范围内的温度下冷冻混合 物，以使混合物内包含的水成核成冰以及将聚合物/生物活性物混合物冷凝成多孔结构。 可以将混合物冷冻成任何几何形状，包括球形、圆柱形、矩形、片形式、管形式等。植入物将 往往保持其形状，且聚合物的形状记忆特性将给予在体内膨胀的余地。可以升高温度以产 生更大的孔或降低温度以产生小的孔。可以通过将冷温度源定位成基本上垂直于孔的期望 方向来定向制造孔。一旦以期望的温度和孔方向冷冻混合物，那么在框914中冻干和/或 脱水植入物以基本上消除其内包含的水。如果乙酸或另外的挥发性物质被用作溶剂，那么 通过冻干也将基本上消除溶剂。
[0080] 在框915中，在冻干循环结束后，支架可以在乙醇、盐水、碱或缓冲剂中被基本上 中和，这取决于用作溶解剂的溶剂。在乙酸溶剂的情形中，在框916中，冻干的植入物可以 在乙醇中，然后在盐水或其他漂洗剂中被漂洗。在盐水漂洗后，植入物可以用水漂洗成不含 盐并真空干燥或冻干以延长贮藏寿命。在框918中，脱水的植入物可以在真空下被封装或 被密封在真空密封瓶中。在冷冻或冻干之前或中和和冻干之后，还可以压缩植入物以产生 紧凑的支架，当暴露于流体时，该支架膨胀。当暴露于流体时，这样的植入物膨胀到基本上 近似于最初的支架尺寸。延迟的膨胀可以通过压缩中和的支架并干燥而不冷冻来实现。
[0081] 现在参考图10,图10描绘了本公开内容的可选择的实施方案。在所描绘的实施方 案中，可以将参考图6和图7所讨论的实施方案（作为非限制性的实例）中获得的生长因 子和/或生物活性物添加到可生物降解的或可吸收的聚合物中以产生可流动的流体和/或 凝胶。在此实施方案中，按照前面的描述收获生长因子和生物活性物并与诸如酸的常用溶 剂一起添加到聚合物中。因此，在框1002中收获的骨髓可以在框1004中经受至少一次过 滤过程，正如上面参考图6描述的。在框1006中，所收获的骨髓可以经受溶解剂，也正如上 面描述的。
[0082] 可生物降解的聚合物可以是蛋白或多糖，诸如胶原、透明质烷、壳聚糖、明胶等以 及两种或更多种聚合物的组合。在框1010中，在生长因子和生物活性物被添加到聚合物之 后，混合以获得基本上均匀的溶液。可以去除任何气泡或杂质。如果期望其他物质（包括 但不限于，磷酸钙、脱矿质的骨、羟基磷灰石、肝素、硫酸软骨素等）被嵌入到植入物中，用 于生长因子附着、产物降解、和/或机械增强，那么它们还可以被添加到混合物中。
[0083] 可以选择身体完全耐受的溶解剂。例如，可以将生长因子和生物活性物添加到壳 聚糖中和乙酸溶液（0.01M-17M)中。也可以将脱矿质的骨添加到溶液中。混合溶液，且可 以通过施加真空或离心去除气泡。在框1012中，凝胶可以被封装在注射器中且被冷冻和/ 或保持在环境温度下。一旦注射入和/或植入身体内，凝胶结合到组织。生理流体可以缓 冲凝胶以中和pH并使凝胶原位凝固。一旦凝胶凝固，期望的治疗植入物保持在预期的手术 部位中且使移动最少。
[0084] 现在参考图11，图11描绘了本公开内容的可选择的实施方案。可以使用诸如真空 干燥、溶剂蒸发等技术对参考图10讨论的上述实施方案中的描述获得的凝胶进行脱水，以 使凝胶变成半刚性的膜和/或丸。因此，在框1102中收获的骨髓可以在框1104中经受至 少一次过滤过程，正如上面参考图6描述的。在框1106中，所收获的骨髓可以经受溶解剂， 也正如上面描述的。
[0085] 在框1112中按照上面的描述使凝胶脱水。在框1114中，丸可以被进一步研磨或 切割成期望的粒径，这取决于期望的植入物应用。一旦暴露于流体并植入手术部位中，丸和 /或由研磨的丸产生的粉末形成也可以被结合到组织的粘性油灰。此结合特性使油灰基本 上保持在被植入时的手术部位处的位置。此油灰可以被用作生物活性物手术粘合剂。当与 使用在手术过程中的自体移植物材料，诸如使用在脊柱融合程序中的自体移植物骨一起使 用时，应用这样的油灰也可以是有优势的，这是因为油灰可以有益于帮助使自体移植物保 持成粘合块且使移动最少。
[0086] 虽然在所包括的附图中描绘的流程图显示了各种步骤的具体施行顺序，但是应理 解，施行顺序可以不同于所描述的施行顺序。例如，两个或更多个框中的施行顺序可以相对 于所显示的顺序被扰乱。而且，按顺序显示的两个或更多个框可以同时施行或部分同时发 生。应该强调，本公开内容的上述实施方案仅仅是为清楚地理解本公开内容的原理而提出 的施行的可能的实例。可以对上述实施方案做出许多变化和修改而基本上并不偏离本公开 内容的精神和原理。所有这样的修改和变化预期被包括在此处的本公开内容的范围内且由 下面的权利要求保护。
【权利要求】
1. 一种制造骨诱导性植入物的方法，包括下述步骤： 对收获的骨髓施行过滤以去除不期望的细胞种群； 将所收获的骨髓暴露于乙酸溶解剂； 基本上中和所收获的骨髓的pH ; 使所溶解的骨髓脱水成粉末形式； 真空密封所溶解的骨髓。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述粉末富集生物活性分子和/或生长因子。
3. 如权利要求2所述的方法，其中所述生物活性分子和/或生长因子包括BMP-2、 VEGF、aFGF、FGF-6 或 TGF-B1。
4. 一种制造骨诱导性植入物的方法，包括下述步骤： 对收获的骨髓施行过滤； 将所收获的骨髓暴露于乙酸溶解剂； 混合可生物降解的聚合物与所收获的骨髓以形成基本上均匀的混合物； 冷冻髓一聚合物混合物； 使髓一聚合物混合物脱水成粉末形式； 基本上中和髓一聚合物混合物的pH ; 用漂洗剂漂洗髓一聚合物混合物； 真空密封髓一聚合物混合物。
5. 如权利要求4所述的方法，其中所述可生物降解的聚合物是蛋白或多糖。
6. 如权利要求5所述的方法，其中所述可生物降解的聚合物是胶原、透明质烷、壳聚 糖、明胶以及两种或更多种聚合物的组合。
7. 如权利要求4所述的方法，其中从所述基本上均匀的混合物中去除气泡或杂质。
8. 如权利要求4所述的方法，其中磷酸钙、脱矿质的骨、羟基磷灰石、肝素或硫酸软骨 素被添加到所述混合物中。
9. 如权利要求4所述的方法，其中在-200°C到0°C的范围内的温度下冷冻所述混合物。
10. -种制造骨诱导性植入物的方法，包括下述步骤： 对收获的骨髓施行过滤； 将所收获的骨髓暴露于乙酸溶解剂； 混合可生物降解的聚合物与所收获的骨髓以形成基本上均匀的凝胶混合物； 封装髓一聚合物凝胶。
11. 如权利要求10所述的方法，其中所述可生物降解的聚合物是蛋白或多糖。
12. 如权利要求11所述的方法，其中所述可生物降解的聚合物是胶原、透明质烷、壳聚 糖、明胶以及两种或更多种聚合物的组合。
13. 如权利要求10所述的方法，其中磷酸钙、脱矿质的骨、羟基磷灰石、肝素或硫酸软 骨素被添加到所述混合物中。
14. 一种制造骨诱导性植入物的方法，包括下述步骤： 对收获的骨髓施行过滤； 将所收获的骨髓暴露于乙酸溶解剂； 基本上中和所收获的骨的pH ; 混合可生物降解的聚合物与所收获的骨髓以形成基本上均匀的凝胶混合物； 使髓一聚合物凝胶脱水以形成髓一聚合物丸； 将髓一聚合物丸成形为期望的植入形状。
15. -种通过权利要求1-14中任一项所述的方法制备的骨植入物。
【文档编号】A61L27/36GK104208752SQ201410413348
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2009年12月13日 优先权日:2008年12月13日
【发明者】艾米特·普拉卡什·高维尔 申请人:先进生物制品有限责任公司