叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂及其制备方法，每个胶束含有质量分数0.01-30％的姜黄素或多西紫杉醇，70-99.99％的H40-聚(丙交酯-乙交酯)-MPEG/PEG-FA；H40-聚(丙交酯-乙交酯)-MPEG/PEG-FA为多聚枝脂肪酯H40与丙交酯、乙交酯的聚合产物先羧基官能化再与叶酸修饰的聚乙二醇或叶酸修饰的甲氧基聚乙二醇缩合反应制得。本发明利用自组装技术采用生物可降解的H40-聚(丙交酯-乙交酯)-MPEG/PEG-FA为载体，制成叶酸受体靶向的聚合物单分子胶束制剂，以提高抗癌药的水中溶解度，促进载药胶束对叶酸受体高表达的肿瘤细胞的靶向性，提高药物疗效，降低药物的毒副作用。
【专利说明】叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及叶酸受体介导的自组装单分子胶束，特别涉及叶酸受体介导的自组装 单分子胶束制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 现阶段多数抗癌药物在水中溶解度极低，在体内被快速代谢，口服吸收差，因此限 制了其在临床的应用。
[0003] 专利CN 102274163A公开了一种姜黄素纳米胶束制剂及其制备方法。该制剂由姜 黄素与两亲性嵌段共聚物组成，将姜黄素与两亲性嵌段共聚物混合溶解于有机溶剂中，旋 转蒸发除去有机溶剂，得到的含药物薄膜真空干燥过夜除去残留的有机溶剂后，加入水相， 超声分散并联合35C -38C恒温振荡，得到胶束溶液，高速离也后，上清即为姜黄素纳米胶 束制剂。本发明采用改良的薄膜分散法法制备姜黄素纳米胶束，提高了姜黄素在水中溶解 度，制剂载药量可达8%，胶束粒径在IOOnm W下，其结构稳定、粒径小、低毒、安全性好、体 内循环时间长、易于保存等。但是其选用的两亲性嵌段共聚物为甲氧基聚己二醇-聚乳酸 两嵌段共聚物，其形成的胶束易受体内血液的稀释，浓度会降到临界胶束浓度W下，W至于 胶束被破坏。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种叶酸受体介导的自组装单 分子胶束制剂及其制备方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0006] 叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂，每个胶束含有质量分数0. 01-30 %的姜 黄素或多西紫杉醇，70-99. 99%的H40-聚（丙交醋-己交醋）-MPEG/PEG-FA。
[0007] 所述胶束的粒径在20-200皿之间。其中H40为多聚枝脂肪醋（Bollom⑩H40,瑞 典柏斯巧精细化学品有限公司），聚（丙交醋-己交醋）分子量为500-10000。H40-聚（丙 交醋-己交醋）-MPEG/PEG-FA为多聚枝脂肪醋H40与丙交醋、己交醋的聚合产物先駿基官 能化再与叶酸修饰的聚己二醇或叶酸修饰的甲氧基聚己二醇缩合反应制得。
[0008] -种上述叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂的制备方法，步骤为：
[0009] 将药物姜黄素或多西紫杉醇与H40-聚（丙交醋-己交醋）-MPEG/PEG-FA溶于有 机溶剂中，揽拌，然后滴加到水中，揽拌、旋蒸除去有机溶剂形成胶束。所述的有机溶剂可用 丙丽，丙丽的用量为丙丽的体积（mL)与药物的质量（mg)比为0.5-100:1。
[0010] 另一种叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂的制备方法，步骤为：将药物姜黄 素或多西紫杉醇与H40-聚（丙交醋-己交醋）-MPEG/PEG-FA溶于有机溶剂中，揽拌后放入 透析袋中，用水透析除去有机溶剂，冻干，用水揽拌复溶，得胶束制剂。所述的有机溶剂可用 丙丽，丙丽的用量为丙丽的体积（mL)与药物的质量（mg)比为0.5-100:1。
[0011] 上述的H40-聚（丙交醋-己交醋）-MPEG/PEG-FA的制备方法为：
[0012] (I)将丙交醋、己交醋、H40及适量催化剂辛化亚锡，于高温120-14(TC、N2保护下， 揽拌反应22-2化，得H40-聚（丙交醋-己交醋）-OH ;
[001引 似将所得的H40-聚（丙交醋-己交醋）-0H、玻巧酸酢及DMAP于溶剂中，室温揽 拌22-2化，即得H40-聚（丙交醋-己交醋）-COOH ;
[0014] 0)叶酸、DCC饥N' -二环己基碳二亚胺）与N服(N-轻基玻巧醜亚胺）加入到 DMSO(二甲基亚讽）中，于室温下避光揽拌1她，即叶酸活性醋溶液；
[0015] (4) PEG与叶酸活性醋在溶剂DMSO中，通过形成醜胺键结合成阳G-FA ;
[0016] (5)将一定比例的册-PEG-FA或MPEG-OH与H40-聚（丙交醋-己交醋）-COOH 在催化剂DCC作用下，于二氯甲焼中，室温避光反应22-2化，得到H40-聚（丙交醋-己交 醋）-MPEG/PEG-FA。
[0017] 上述步骤（1)所述的原料重量份比为丙交醋50-99份、己交醋50-99份、H40为 1-10份，催化剂辛化亚锡质量为丙交醋、己交醋总重的0. 01-0. 05%。
[001引步骤（2)中H40-聚（丙交醋-己交醋）-0H、玻巧酸酢及DMAP的摩尔比例为 0.2-0. 4 :0.8-1. 2 :0.8-1. 2。溶剂为四氨巧喃，用量为四氨巧喃的体积（mL)与H40-聚（丙 交醋-己交醋）-OH的质量（mg)比为2-4 :15-25。
[001引步骤（3)叶酸、DCC与N服的摩尔比为1:1-2:1-2。DMSO的用量为DMSO的体积 (血）与叶酸的质量（g)比为35-50 ;1。
[0020] 步骤（4)阳G、叶酸活性醋摩尔比为1 ;1-2。DMSO的体积与阳G的质量比为1-2 ; 40 (ml/mg)。
[0021] 步骤巧)册-PEG-FA/M阳G-0H、H40-聚（丙交醋-己交醋）-COOH及催化剂的摩尔 比为15-25 ;1 ;15-25。二氯甲焼的用量为二氯甲焼的体积（mL)与H40-聚（丙交醋-己交 醋）-COOH的质量（g)比为3-5:1-2。
[0022] 其中H40为多聚枝脂肪醋；聚（丙交醋-己交醋）分子量为500-10000, MPEG或 PEG是分子量为400-5000的聚己二醇；FA为叶酸祀向分子。
[0023] 本发明利用自组装技术采用生物可降解的H40-聚（丙交醋-己交醋）-MPEG/ PEG-FA为载体，制成叶酸受体祀向的聚合物单分子胶束制剂，W提高抗癌药的水中溶解度， 促进载药胶束对叶酸受体高表达的肿瘤细胞的祀向性，提高药物疗效，降低药物的毒副作 用。
[0024] 本发明的有益效果是，采用自组装可降解高分子材料H40-聚（丙交醋-己交 醋）-MPEG/PEG-FA为载体材料，增加了药物的水中溶解度。同时，制剂在体外可持续释放1 天、3天或6天左右，达到了缓释的目的，减少了用药次数，提高了生物利用度。同时，解决了 现有普通胶束在体内易分解的问题，增加了制剂的体内稳定性，降低了制剂的全身毒副作 用。
【专利附图】
【附图说明】
[00幼图1自组装材料H40-聚（丙交醋-己交醋）-MPEG/PEG-FA合成路线图。
[0026] 图2 (a)为自组装材料H40-聚（丙交醋-己交醋）的核磁（雨1时图谱。
[0027] 图2化）为自组装材料H40-聚（丙交醋-己交醋）-MPEG/PEG-FA的核磁（Hnmr)图 谱。
[0028] 图3为叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂的粒径分布图。
[0029] 图4A为叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂的外观图；B为自制姜黄素十二焼 基賴酸轴混息液的外观照片。
[0030] 图5为姜黄素单分子胶束制剂的体外释放曲线。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅 是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
[0032] 实施例1
[0033] 自组装材料H40-聚（丙交醋-己交醋）-MPEG/PEG-FA合成：
[0034] 1、H40-聚（己交醋-D, k丙交醋）的合成
[003引于25ml的圆底烧瓶中，加入SOOmg的H40,丙交醋、己交醋（丙交醋、己交醋投料 质量比为65/35)，共含30mmol的駿基），W及适量催化剂辛酸亚锡溶液（用量为H40质 量的1% )，混合均匀，旋蒸除去有机溶齐U。在12(TC、馬保护、转速为50化pm条件下，反应 2化。用二氯甲焼溶解所得产物，除去不溶物，W甲醇重结晶，真空干燥，得H40-聚（己交 醋-D, k丙交醋）。
[0036] 2、H40-聚（己交醋-D，k丙交醋）-COOH的合成
[0037] 将所得产物H40-聚（己交醋-D，k丙交醋）1. 5g，玻巧酸酢47mg，及57mg DMAP 加入到含55mg H己胺和IOml四氨巧喃的50ml圆底烧瓶中，室温揽拌2化即得。
[0038] 3、册-PEG-FA 的合成 [003引叶酸活性醋的合成
[0040] 将8ml二甲基亚讽与625 U 1 H己胺混合均匀，避光揽拌过夜（1化）。将200mg FA、 94mg DCC和52mg N服加入到上述混合溶液中，于室温下避光揽拌1她，经0. 22um的微孔滤 膜，得澄清液，即叶酸活性醋溶液。
[0041] 册-PEG-FA 的合成
[004引 将所得叶酸活性醋溶液486 U l、42mg册-PEG-NH2、1. 5ml二甲基亚讽及Iml H己 胺，置于IOml安流瓶中，室温反应16h。将所得溶液于透析袋（截留分子量为1，000)中用 水透析2d,贸也除去不溶物，冻干，即得册-PEG-FA。
[004引 4、H40-聚（己交醋-D，k丙交醋）-PEG-FA材料的合成
[0044] 将所得H40-聚（己交醋-D，k丙交醋）-C00H溶液IOml与62mg DCC、37mg DMAP，溶 于6ml无水二氯甲焼中，得混合溶液。取570mg mPEG和52mg册-PEG-FA,溶于3ml无水二氯 甲焼中，混合均匀，将其逐滴滴加到上述混合溶液中，室温避光揽拌2化。离也，取上清，旋蒸 除去有机溶剂。二甲基亚讽复溶，除去不溶物，于透析袋（截留分子量为8, 000-14, 000)中 用二甲基亚讽透析2d后，换水透析2d，冻干，即得H40-聚（己交醋-D，k丙交醋）-PEG-FA
[0045] 实施例2 :
[0046] 溶剂挥发法制备叶酸受体介导的自组装单分子胶束
[0047] 将2mg姜黄素或多西紫杉醇与上述自组装的H40-聚（丙交醋-己交醋）-MPEG/ PEG-FA约IOmg溶于2ml丙丽中，揽拌化后，滴加入2ml水中，揽拌2化，除去有机溶剂溶剂 形成胶束。
[004引 实施例3 :
[0049] 透析法制备叶酸受体介导的自组装单分子胶束
[0050] 将2mg姜黄素或多西紫杉醇与IOmg自组装的H40-聚（丙交醋-己交醋）-MPEG/ PEG-FA溶于5ml二甲基甲醜胺中，揽拌化后，放入透析袋中，用水透析除去有机溶剂，冻干， 复溶，得胶束制剂。
[00川效果测试
[00閲 1、H40-聚（己交醋-D，k丙交醋）-PEG-FA的核磁共振谱图表征
[0053] 使用C"二甲基亚讽（DMS0-d6)或気代二甲基亚讽（DMS0-d6)为溶剂，完全溶 解待测样品H40-聚（己交醋-D，k丙交醋）或H40-聚（己交醋-D，k丙交醋）-MPEG/ PEG-FA5-10mg，加入核磁管内约4cm的高度，300MHz核磁共振波谱仪炬ruker)进行扫描，其 结果如图2所示。
[0054] 2、单分子胶束粒径是通过W下实验测定的：
[0055] 用贝克曼粒径测定仪测微球的粒径大小及其分布，观察其粒径分布情况。
[005引 （1)实验样品
[0057] 根据本发明实施例2-3方法制备的胶束。
[00则 似实验仪器
[0059] 贝克曼粒径测定仪。.
[0060] 做实验方法
[0061] 取样品适量，稀释到适合的浓度，用贝克曼粒径测定仪测胶束的粒径大小及其分 布，观察其粒径分布情况，结果如图3所示。
[0062] 3、胶束的体外释放曲线的测定：
[006引 （1)实验样品
[0064] 根据本发明实施例2-3方法制备的胶束。
[00财 似实验试剂
[0066] 含0. 1 %吐温80的生理盐水。
[0067] (3)实验仪器
[006引恒温振荡仪、离也机、高相液相色谱仪。
[0069] (4)实验条件
[0070] 温度；37°C，转速；100巧m。
[00川 妨实验方法
[0072] 取含药胶束Iml置10血离也管中，加入适量含0. 1 %吐温80的生理盐水，置于恒 温水浴摇床中，在37C、IOOrpm振荡速度下进行胶束的体外释放度测定，图5是实施例2所 得姜黄素单分子胶束制剂的体外释放曲线。
[0073] 4、溶血性考察
[0074] 取新鲜Wista大鼠血浆，加入肝素抗凝，于1，O(K)巧m离也IOmin收集红细胞，弃去 上清并用生理盐水洗涂沉淀的红细胞，至上清不显红色为止，并用生理盐水配置成2% (V/ V)的红细胞混息液（4C保存，并限当日使用）。
[00巧]取2. 5mL的红细胞息液，加入2. 5mL不同自组装材料浓度梯度的空白单分子胶束 巧惊U，所得混合物37C恒温振荡水浴中赔育比后，4, 000巧m离也lOmin，取上清液在541皿 处测定吸光度值。另取2. 5血红细胞息液，加入同样体积的生理盐水和蒸觸水，分别做为阴 性对照和阳性对照，W下式计算溶血率，其结果见表1。
[0076] 表1红细胞中血红素释放百分比
【权利要求】
1. 叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂，其特征是，每个胶束含有质量分数 0. 01-30 %的姜黄素或多西紫杉醇，70-99. 99 %的H40-聚（丙交酯-乙交酯）-MPEG/ PEG-FA。
2. 根据权利要求1所述的叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂，其特征是，H40-聚 (丙交酯-乙交酯）-MPEG/PEG-FA为多聚枝脂肪酯H40与丙交酯、乙交酯的聚合产物先羧基 官能化再与叶酸修饰的聚乙二醇或叶酸修饰的甲氧基聚乙二醇缩合反应制得。
3. 根据权利要求1所述的叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂，其特征是，所述胶 束的粒径在20-200nm之间。
4. 一种叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂的制备方法，其特征是，步骤为： 将药物姜黄素或多西紫杉醇与H40-聚（丙交酯-乙交酯）-MPEG/PEG-FA溶于有机溶 剂中，搅拌，然后滴加到水中，搅拌、旋蒸除去有机溶剂形成胶束； 或者将药物姜黄素或多西紫杉醇与H40-聚（丙交酯-乙交酯）-MPEG/PEG-FA溶于有机 溶剂中，搅拌后放入透析袋中，用水透析除去有机溶剂，冻干，用水搅拌复溶，得胶束制剂； 姜黄素或多西紫杉醇与H40-聚（丙交酯-乙交酯）-MPEG/PEG-FA的质量比为0.01-30 : 70-99. 9。
5. 根据权利要求4所述的叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂的制备方法，其特征 是，H40-聚（丙交酯-乙交酯）-MPEG/PEG-FA的制备步骤为 ： (1) 将丙交酯、乙交酯、H40及适量催化剂辛化亚锡，于高温120-140°C、N2保护下，搅拌 反应22-24h，得H40-聚（丙交酯-乙交酯）-OH ; (2) 将所得的H40-聚（丙交酯-乙交酯）-0H、琥珀酸酐及DMAP于溶剂中，室温搅拌 22-24h，即得H40-聚（丙交酯-乙交酯）-COOH ; ⑶叶酸、DCC与NHS加入到DMSO中，于室温下避光搅拌18h，即叶酸活性酯溶液； (4) PEG与叶酸活性酯在溶剂DMSO中，通过形成酰胺键结合成PEG-FA ; (5) 将HO-PEG-FA或MPEG-OH与H40-聚（丙交酯-乙交酯）-COOH在催化剂DCC作用 下，于二氯甲烷中，室温避光反应22-24h，得到H40-聚（丙交酯-乙交酯）-MPEG/PEG-FA。
6. 根据权利要求5所述的叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂的制备方法，其特征 是，步骤（1)所述的原料重量份比为丙交酯50-99份、乙交酯50-99份、H40为1-10份，催 化剂辛化亚锡质量为丙交酯、乙交酯总重的0. 01-0. 05%。
7. 根据权利要求5所述的叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂的制备方法，其特征 是，步骤⑵中H40-聚（丙交酯-乙交酯）-0H、琥珀酸酐及DMAP的摩尔比例为0. 2-0.4: 0. 8-1. 2 ：0. 8-1. 2〇
8. 根据权利要求5所述的叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂的制备方法，其特征 是，步骤⑶叶酸、DCC与NHS的摩尔比为1:1-2:1-2。
9. 根据权利要求5所述的叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂的制备方法，其特征 是，步骤⑷PEG、叶酸活性酯摩尔比为1 :1-2。
10. 根据权利要求5所述的叶酸受体介导的自组装单分子胶束制剂的制备方法，其特 征是，步骤（5) H0-PEG-FA/MPEG-0H、H40-聚（丙交酯-乙交酯）-COOH及催化剂的摩尔比为 15-25 ：1 ：15-25〇
【文档编号】A61P35/00GK104224714SQ201410483558
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】翟光喜, 杨春芬, 赵丽艳 申请人:山东大学