一种免疫修复15肽、其制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种免疫修复15肽、其制备方法及其应用。本发明提供的免疫修复15肽，具有免疫调节活性和机体保护作用。本发明提供的化学合成法简便易行，能够满足药学、临床前和临床研究的需要。同时满足了大规模工业化生产的需要。
【专利说明】一种免疫修复15肽、其制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种免疫修复15肽、其制备方法及其应用。具体而言，本发明提供了 具有免疫调节活性和/或机体保护作用的免疫修复15肽、其制备方法及其在制备药物或保 健品中的应用。
【背景技术】
[0002] 现代营养学研究发现，人类摄食蛋白质经消化道的酶作用后，大多以低肽形式被 吸收，以游离氨基酸形式吸收的比例很小。进一步的试验证实了肽比游离氨基酸消化更快、 吸收更多，表明肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高。目前已经确认在多肽中以大 ?多肤的吸收率最商。
[0003] 大豆多肽于70年代在美国研究出，之后Deltowm Species公司建成了年产5000Τ 的食用蛋白肽工厂，日本也于80年代开始将大豆多肽应用于食品工业。如今，仅日本运动 员食用的大豆多肽食品年销售额就高达30亿日元，且仍呈上升趋势，我国近年才开始大豆 多肽应用的研究，并取得了一定进展。
[0004] 大豆多肽是营养价值很高的植物高级蛋白质，有极佳的生理功能和加工特性，是 一种非常有前途的功能性食品原料。大豆多肽的氨基酸组成几乎与大豆蛋白质完全一样。 必需氨基酸平衡良好，含量也丰富。但是，目前生产的大豆多肽多为混合物，活性成分不明， 不利于大豆多肽的进一步研究和开发。
[0005] 另外，目前大豆多肽的生产主要是以大豆或豆柏作为原料，利用化学方法或酶法 将大豆蛋白质水解而成。化学方法是采用酸水解，但氨基酸会受到损害降低其营养价值，已 很少采用。酶水解法能很好的保有氨基酸的营养价值，工艺成熟，已被广泛采用。
[0006] 但是,酶法生产大豆多肽尚存在以下问题：大豆中的脂肪氧化酶氧化大豆不饱和 脂肪酸后可生成多种低分子醇、醛和酮等挥发性成份，从而产生令人难以接受的豆腥味；大 豆蛋白质被酶解成肽后，往往产生不同程度的苦涩味，苦味成分主要是亮氨酸、蛋氨酸等 疏水性氨基酸及其衍生物和低分子苦味肽。这些疏水氨基酸，平常被掩蔽在蛋白质中，在酶 解过程中，蛋白质被水解而使这类氨基酸暴露出来，并随水解程度而苦味加重。
[0007] 鉴于此，本发明鉴别出一种有免疫调节活性和机体保护作用的多肽（下文中称为 免疫修复15肽），并摒弃了传统的酶法生产，采用化学合成法，具体而言Fmoc-固相多肽合 成法来合成该免疫修复15肽，并进一步对传统的仅适用于实验室生产的Fmoc-固相多肽合 成法进行了改进，从而提供了一种可用于大规模工业化生产的制备方法。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个目的在于提供一种免疫修复15肽，所述肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0009] 本发明的另一目的在于提供上述免疫修复15肽的制备方法，所述方法包括根据 Fmoc-固相多肽合成法合成粗品多肽，优选的是，所述方法还包括使用反相高效液相色谱对 所述粗品多肽进行纯化。
[0010] 优选的是，所述Fmoc-固相多肽合成法中，以Rink-Amide-MBHA树脂为固相载体， HOBt (1-羟基-苯并-三氮唑）/TBTU (苯并三唑四甲基四氟硼酸）/DIEA (N，Ν' -二异丙基乙 胺））为催化剂，二甲基甲酰胺DMF为溶剂和清洗剂，三氟乙酸TFA/H20为切割剂，进行所述 粗品多肽的合成，其中所述TFA/H 20中TFA与H2O的体积比优选为95:5。
[0011] 在所述 Fmoc-固相多肤合成法中使用 Fmoc-Asp (Otbu)-OH、Fmoc-Lys (Boc)-OH 和 Fmoc-Glu (Otbu) -OH作为合成氨基酸来分别将Asp、Lys和Glu偶联到肽链上。
[0012] 具体而言，所述Fmoc-固相多肽合成的步骤包括：
[0013] a.用二甲基甲酰胺DMF浸泡所述Rink-Amide-MBHA树脂以将其活化；
[0014] b.根据Fmoc-固相多肽合成法，以Rink-Amide-MBHA树脂为固相载体，用哌啶脱去 树脂上的Fmoc-基团，使树脂上的氨基游离出来，恢复反应活性；
[0015] c.可选地对树脂进行茚三酮显色检测，以鉴别Fmoc-基团是否脱除
[0016] d.洗涤后用以H0BT\TBTU\DIEA为催化剂，DMF为溶剂及清洗剂，连接第一个氨基 酸；
[0017] e用哌啶脱去Fmoc-基团，使第一个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性；
[0018] f.可选地对树脂进行茚三酮显色检测，以鉴别Fmoc-基团是否脱除以及氨基酸的 连接是否完全；
[0019] g.洗涤后用以H0BT\TBTU\DIEA为催化剂，DMF为溶剂及清洗剂，连接第二个氨基 酸；
[0020] h.以同样方法连接其他的氨基酸；可选的是连接完每个氨基酸后都进行茚三酮 显色检测，并且结果呈阴性时才可进行下步反应；
[0021] i.连接完所有氨基酸后洗涤；
[0022] j.对免疫修复15肽进行乙酰化修饰；
[0023] L用切割试剂将肽从树脂上切割下来；
[0024] 1.将切下的肽再在冷乙醚中沉淀、洗涤、离心；
[0025] m.冻干机中冻干获得粗品。
[0026] 其中，所述反相高效液相色谱条件为：
[0027] 以水-乙腈为二元梯度洗脱流动相，流动相A为0. 1体积％三氟乙酸的水溶液，流 动相B为0. 1体积％三氟乙酸的乙腈溶液，色谱柱为C18反相色谱柱，50*250mm，紫外检测 波长215nm，流速10ml/min，进样量20ml ;
[0028] 线性洗脱梯度及柱处理：
[0029] B:5% -55% 60分钟（制备纯化）
[0030] B:55% -90% 10 分钟（柱冲洗）
[0031] B:90% 10分钟（柱冲洗）
[0032] B:5% 10分钟（柱平衡）。
[0033] 本发明的制备方法获得的粗品多肽的纯度为85%以上，优选87%以上。经过所述 反相高效液相色谱纯化后的产品的纯度为98%以上。
[0034] 本发明的又一目的在于提供上述免疫修复15肽在制备具有免疫调节活性和/或 机体保护作用的药物或保健品、特别是运动营养保健品中的应用。
[0035] 本发明提供的免疫修复15肽，具有免疫调节活性和机体保护作用。对各种条件 引起的消化道粘膜、肝脏和胰腺损伤具有明显的保护作用；可促创伤伤口的愈合；促进骨 折愈合；同时具有抑制炎性反应等作用。免疫修复15肽具有良好的稳定性，抗胃酶消化、 抗酸，注射和口服具有同样的效果；对胃酸和胃酶分泌无抑制作用；在极低剂量（IOyg和 10ng/kg)、单次用药就具有明显的保护作用。其毒性剂量明显高于有效剂量，具有广泛的 药理作用和高度的安全范围，同时具有优良的药代动力学特性。
[0036] 此外，本发明提供的化学合成法独具优势。该工艺简便易行，能够满足药学、临床 前和临床研究的需要。同时满足了大规模工业化生产的需要。
【专利附图】
【附图说明】
[0037] 图1 :聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂载带多肽图。
[0038] 图 2 :Boc_ 和 Fmoc-结构图
[0039] 图3 :小试粗品液相图
[0040] 图4 :小试粗品质谱图
[0041] 图5 :小试主峰质谱图
[0042] 图6 :小试纯品液相图
[0043] 图7:优化切割粗品液相图
[0044] 图8 :优化切割主峰质谱图
[0045] 图9 :HPLC分析免疫修复15肽保留时间（tK)图
[0046] 图10 :HPLC分析免疫修复15肽提高分离效果图
[0047] 图11 :HPLC分析免疫修复15肽优化程序图
[0048] 图12 :合成工艺流程图
[0049] 图13 :纯化工艺流程图
[0050] 图 14 :Fmoc_Val-〇H 中 Fmoc 脱除原理
[0051] 图15 :讳三酮氧化性向还原性转化方程式
[0052] 图16 :茚三酮显色原理方程式 图17 :免疫修复15肽合成工艺线路 图18 :实验室小试免疫修复15肽制备工艺流程
【具体实施方式】
[0053] 以下通过实施例更为详细地说明本发明，但这并不意味着本发明的保护范围受这 些实施例限制。
[0054] 实施例1
[0055] 该实施例为说明免疫修复15肽的制备方法的实施例。在建立了免疫修复15肽实 验室固相化学合成工艺的基础上，优化并建立了中试规模的合成和制备工艺。
[0056] 第一部分免疫修复15肽合成工艺的实验室研究
[0057] -、合成工艺整体思路和合成原理
[0058] 1.合成工艺整体思路
[0059] 结合免疫修复15肽的特点及一般肽合成的原则，设计了免疫修复15肽合成工艺 线路，如图17所示：
[0060]
[0061] 2.合成工艺选择依据
[0062] 多肽固相方法以快速简便的操作和高产率显示了无可比拟的优越性。其基本原理 是按照要求序列顺序将氨基酸的C末端固定在不溶性聚合物载体上，然后依次缩合氨基 酸，延长肽链的过程。在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的。完 成合成后，将肽链从固相载体上切割，进行纯化等后处理过程，即可获得多肽目标产品。常 用的多肽合成方法包括Boc法（叔丁氧羰基）和Fmoc固相法（9-芴甲氧羰基）。
[0063] 2· 1合成用树脂的选择依据
[0064] 固相多肽合成的高分子载体多采用聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂，它能起到支撑 和载带多肽的作用（图1)。但它并不能直接连上（第一个）氨基酸，必须要在苯环上导入 反应基团（接头）。由于苯环对位上碳原子相对活跃，可进行多种反应，从而可连接上各类 活性集团（Linker)。可与多肽的第一个氨基酸的羧基相连接使其锚定在载体上，启动肽链 在载体上的延伸。使用不同的Linker，可以用来合成肽氨、肽酸、肽醇、肽酯等不同多肽。 [0065] 免疫修复15肽为羧酸型多肽，其碳末端要进行酰胺化修饰，故应采用 Rink-Amide-MBHA树脂，Rink-Amide-MBHA树脂和第一个氨基酸的羧基形成的结构对酸不 稳定，可以用三氟乙酸将其重新打断，在合成完成时可用三氟乙酸将肽链从树脂上切割下 来，达到肽链和树脂的分离。
[0066] 2. 2氨基酸连接工艺的选择依据
[0067] 在多肽合成时，首先将氨基酸的α-氨基用适当的基团进行保护，以封闭其活性， 使羧基处于游离状态，第一个氨基酸的羧基与树脂的Linker连接，以锚定肽链，脱去α -氨 基的保护基团，使氨基酸重新游离出来，以后形成肽键的反应只能在前一个氨基酸的氨基 和后一个氨基酸的羧基之间进行。每次偶联一脱保护可使肽链延伸一个氨基酸，不断重复 偶联一脱保护过程，即可完成一个多肽的合成。三功能团氨基酸的侧链也要进行保护，以免 副反应的发生。
[0068] 固相多肽合成中的氨基酸保护策略分Boc-和Fmoc-两种（图2)
[0069] Boc合成法是采用TFA(三氟乙酸）可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采 用HF(氢氟酸）可脱除的苄醇类。合成时将一个Boc-氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用 TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc (二环己基碳二亚胺）活化、偶 联下一个氨基酸，最终采用HF或TFMSA (三氟甲磺酸）将多肽从树脂上切割下来。
[0070] Fmoc合成法采用了碱可脱除的Fmoc为α -氨基的保护基，侧链的保护采用TFA 可脱除的叔丁氧基等，合成时将一个Fmoc-氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用哌啶脱 除Fmoc，然后通过H0Bt(l-羟基-苯并-三氮唑）/TBTU(苯并三唑四甲基四氟硼酸）/ DIEA(Ν，Ν' -二异丙基乙胺）/催化、偶联下一个氨基酸，最终采用TFA将多肽从树脂上切 割下来，避免了强酸处理所起侧链的一些副反应，故近年来各种多肽的合成大多数采用 Fmoc-法。
[0071] 我们采用Fmoc法合成免疫修复15肽的固相，所选氨基酸的a-氨基均采用对 弱酸敏感的Fmoc-基团保护，用弱碱性物质一哌啶脱保护，侧链活性基团用对弱酸敏感的 (Trt、tB U、B〇C、OtBu、Pbf)基团保护，其特点是再合成过程中，肽链只经受弱碱处理，而侧链 保护基团一直处于稳定状态，在合成结束时用TFA -次将侧链保护基团和第一个氨基酸与 树脂之间的连接键打断。
[0072] 二、Fmoc-法固相免疫修复15肽合成工艺研究
[0073] L试验材料
[0074]
【权利要求】
1. 一种免疫修复15肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 权利要求1所述的免疫修复15肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括根据 Fmoc-固相多肽合成法合成粗品多肽，优选的是，所述方法还包括使用反相高效液相色谱对 所述粗品多肽进行纯化。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Fmoc-固相多肽合成法中，以 Rink-Amide-MBHA树脂为固相载体，HOBt (1-羟基-苯并-三氮唑）/TBTU (苯并三唑四甲基 四氟硼酸）/DIEA (N，N' -二异丙基乙胺）为催化剂，二甲基甲酰胺DMF为溶剂和清洗剂，三 氟乙酸TFA/H20为切割剂，进行所述粗品多肽的合成。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Fmoc-固相多肽合成法中使用 Fmoc-Asp (Otbu) -OH、Fmoc-Lys (Boc) -OH 和 Fmoc-Glu (Otbu) -OH 作为合成氨基酸来分别将 Asp、Lys和Glu偶联到肽链上。
5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Fmoc-固相多肽合成的步骤包括： a. 用二甲基甲酰胺DMF浸泡所述Rink-Amide-MBHA树脂以将其活化； b. 根据Fmoc-固相多肽合成法，以Rink-Amide-MBHA树脂为固相载体，用哌啶脱去树脂 上的Fmoc-基团，使树脂上的氨基游离出来，恢复反应活性； c. 可选地对树脂进行茚三酮显色检测，以鉴别Fmoc-基团是否脱除； d. 洗涤后用以HOBT\TBTU\DIEA为催化剂，DMF为溶剂及清洗剂，连接第一个氨基酸； e. 用哌啶脱去Fmoc-基团，使第一个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性； f. 可选地对树脂进行茚三酮显色检测，以鉴别Fmoc-基团是否脱除以及氨基酸的连接 是否完全； g. 洗涤后用以HOBT\TBTU\DIEA为催化剂，DMF为溶剂及清洗剂，连接第二个氨基酸； h. 以同样方法连接其他的氨基酸；可选的是连接完每个氨基酸后都进行茚三酮显色 检测，并且结果呈阴性时才可进行下步反应； i. 连接完所有氣基酸后洗漆； j. 对免疫修复15肽进行乙酰化修饰； k. 用切割试剂将肽从树脂上切割下来； l. 将切下的肽再在冷乙醚中沉淀、洗涤、离心； m. 冻干机中冻干获得粗品。
6. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱条件为： 以水-乙腈为二元梯度洗脱流动相，流动相A为0. 1体积％三氟乙酸的水溶液，流动相 B为0. 1体积％三氟乙酸的乙腈溶液，色谱柱为C18反相色谱柱，50*250mm，紫外检测波长 215nm，流速 10ml/min，进样量 20ml ; 线性洗脱梯度及柱处理： B:5% -55% 60分钟（制备纯化） B:55% -90% 10分钟（柱冲洗） B:90% 10分钟（柱冲洗） B:5% 10分钟（柱平衡）。
7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述粗品多肽的纯度为85%以上，优选87% 以上。
8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱纯化后的产品的纯 度为98%以上。
9. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述TFA/H20中TFA与H2O的体积比95:5。
10. 权利要求1所述的免疫修复15肽在制备具有免疫调节活性和/或机体保护作用的 药物或保健品、特别是运动营养保健品中的应用。
【文档编号】A61P17/02GK104311640SQ201410568457
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】曹珉, 杨赛, 陈五岭, 张英起, 王越 申请人:上海弭阳生物技术有限公司