柯里拉京的提取分离方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种柯里拉京的提取分离方法及其应用。用无水丙酮处理龙眼果核粉末一次再用丙酮水溶液提取两次；将适量层析聚酰胺与丙酮水溶液提取液混匀回收丙酮后上聚酰胺层析柱，依次用纯水、不同浓度甲醇水溶液、甲醇洗脱，将40％～60％甲醇洗脱液分瓶收集浓缩分出柯里拉京晶体，再将母液和其余含柯里拉京的洗脱液合并浓缩至干后溶于甲醇上葡聚糖凝胶LH-20柱，甲醇洗脱，将洗脱物分瓶收集静置，合并有柯里拉京晶体析出的洗脱物，再静置至析出柯里拉京晶体无增加，分出柯里拉京晶体将其与层析聚酰胺柱分得的柯里拉京晶体合并，再以乙醇重结晶得高纯度的柯里拉京。本发明提取分离的柯里拉京具有抑制酪氨酸酶的作用。
【专利说明】柯里拉京的提取分离方法及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种柯里拉京的提取分离方法及其应用。
【背景技术】：
[0002] Ran址adilok N等报道干龙眼果核含柯里拉京3. 7-8. 6mg/g ;Soong和Barlow利 用HPLC-ESI-MS联用技术确定了龙眼核中含有柯里拉京（corilagin)、没食子酸（gallic acid)、稼花酸（ellagic acid)等13种酷类物质。
[0003] 柯里拉京（Corilagin)是一种没食子醜六轻基联苯化喃型葡萄糖巧化合物，属 于可水解丹宁，能溶于水、甲醇、己醇、丙丽等大极性溶剂，毒性小。早在1952年Schmi化， O.T.和Lademann，R.就发现了它是自由基强力清除剂，对许多也血管疾病包括高血压、动 脉粥样硬化、中风、充血性也衰、和缺血性也疾病有着很好的作用；对抗肿瘤、抗病毒同样有 很好的作用；它还是治疗己型肝炎的叶下珠肝片的主要成分之一。
[0004] 对于龙眼果核多酷的提取条件有文献报道。如；丙丽浓度50% (v/v)，料液比1 ; 140 (g/血)，浸提温度5(TC，浸提时间2h，超声20min，浸提立次，龙眼核多酷得率为62. Img/ g(PB法）（王志远，龙眼壳与龙眼核多分的分离纯化结构鉴定及抗氧化活性巧].厦口：厦 口大学，2007.)。提取时间106min，己醇体积分数为58%，提取温度64°C，料液比为1 : 9， 在此条件下，多酷得率为42. 690mg/g(福林酷法）（吴兰兰等。响应面法优化龙眼核多酷提 取工艺的研究[J].集美大学学报（自然科学版），15巧）；22-26)。
[0005] 大连美仑生物技术有限公司网站销售信息显示；20mg柯里拉京标准品（HPLC分析 纯度> 98% )售价960元。
[0006] 龙眼主要分布和栽培在福建、广东和广西，果肉服厚多汁、营养丰富，有很高的营 养价值和食疗价值，自古就有"强魄聪明、轻身不老、通神明"的说法，现代药理也已证明龙 眼肉提取液有抗衰老、抗癌和免疫调节与促进智力发育等功效，被人们推崇为"果中圣品"。 我国是龙眼的原产国和生产国，种植面积和产量分别占世界的70%和50% W上，是最大的 龙眼生产国。近10年来，总产量大幅度增长，由1997年的36. 53万吨增加到2006年的 110. 65万吨，增幅达202. 90%，其中2006年广东47. 56万吨，广西38. 57万吨，福建21. 28 万吨。但由于水果上市比较集中，胆运条件有限及储藏保鲜技术不足，鲜果消费受到限制， 大量的鲜果用于加工如桂圆肉、龙眼酒、龙眼糖水罐头等，所产生的果核未加W利用，造成 巨大浪费。
【发明内容】
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[0007] 本发明的第一个目的是提供一种柯里拉京的提取分离方法。
[0008] 本发明的柯里拉京的提取分离方法，其特征在于，包括W下步骤：
[0009] (1)、柯里拉京的提取：先将龙眼果核粉末按照一定的质量体积比加入无水丙丽， 室温揽拌进行预处理，静置析出上层液，弃该上层液；再将龙眼果核粉末按照一定的质量 体积比第二次加入丙丽水溶液，控制温度进行揽拌，静置析出上层液并过滤，得到第二次滤 液；最后将龙眼果核粉末按照一定的质量体积比第H次加入丙丽水溶液，操作同第二次，得 到第H次滤液；合并第二、H次滤液，得到提取液，该提取液用于下一步分离；
[0010] (2)、提取液分离制备柯里拉京；取经预处理的层析聚醜胺上层析柱，再取经预 处理的层析聚醜胺于步骤（1)所得的提取液中混匀，得到混合物，回收丙丽并蒸发水分至 混合物成粘稠状，之后将混合物加至聚醜胺层析柱，依次用纯水、5%?15%甲醇、25%? 35%甲醇、40%?60%甲醇、无水甲醇进行洗脱，将40 %?60%甲醇洗脱液分瓶收集浓缩 并检验柯里拉京洗脱情况（因为在此梯度洗脱体系中，柯里拉京不会被体积分数小于35% 的甲醇水溶液洗出，而且用体积分数40%?60%甲醇能完全洗出，因此只需对此部分进行 后续处理），将该分瓶收集浓缩的洗脱物中柯里拉京固体含量大于等于60%的洗脱物合并 浓缩后有柯里拉京晶体析出，滤出晶体后将母液和其他经检测含柯里拉京的洗脱物合并浓 缩至干，再溶于无水甲醇后上葡聚糖凝胶柱，用无水甲醇进行洗脱，将洗脱物分瓶收集，静 置，合并有柯里拉京晶体析出的洗脱物，再静置至析出柯里拉京晶体无增加，分出柯里拉京 晶体，将其与层析聚醜胺柱40%?60%甲醇洗脱分得的柯里拉京晶体合并，再W无水己醇 重结晶，最终得到高纯度的柯里拉京。
[0011] 所述的龙眼果核粉末，其制备方法为：在龙眼果场收集龙眼加工丢弃的果核，自然 晒干，粉碎过20目筛得龙眼果核粉末。
[0012] 优选，步骤（1)中先将龙眼果核粉末按照质量体积比为1 ;15加入无水丙丽。
[0013] 优选，步骤（1)中再将龙眼果核粉末按照质量体积比为1 ;15第二次加入80%丙 丽水溶液，控制温度为55C进行揽拌化，静置析出上层液并0. 04?0. 05MPa真空过滤。
[0014] 优选，步骤（1)中最后将龙眼果核粉末按照质量体积比为1 ;15第H次加入60% 丙丽水溶液。
[0015] 步骤（2)中所述的取经预处理的层析聚醜胺上层析柱，所取的经预处理的层析聚 醜胺与步骤（1)中被提取的龙眼果核粉末的质量比（w/w)优选为0.8:1 ;所述的再取经预 处理的层析聚醜胺于步骤（1)所得的提取液中混匀，所再取的取经预处理的层析聚醜胺与 步骤（1)中被提取的龙眼果核粉末的质量比（w/w)优选为0.2:1 ;所述的预处理，具体方法 为：取聚醜胺W 90?95% (V)己醇浸泡，不断揽拌，除去气泡后装入柱中，用3?4BV的 90?95% (V)己醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣（或极少残渣），再依次用2? 2. 5BV 5% (W)化0H水溶液、1BV的蒸觸水、2?2. 5BV的10% (W)醋酸水溶液洗脱，最后用 蒸觸水洗脱至中性。
[0016] 步骤（2)中所述的回收丙丽，优选为常压旋转蒸发回收丙丽，所述的蒸发水分，优 选为减压旋转蒸发水分。
[0017] 优选，步骤（2)中依次用纯水3BV、5%?15%甲醇48￥、25%?35%甲醇48￥、 40%?60%甲醇48￥、无水甲醇88￥进行洗脱，洗脱流速为0.58￥/11。
[0018] 步骤（2)中所述的将40%?60%甲醇洗脱液分瓶收集浓缩，优选为将40%? 60%甲醇洗脱液按1/9BV分瓶收集浓缩。
[0019] 优选，步骤（2)中滤出晶体后将母液和其他经检测含柯里拉京的洗脱物合并浓缩 至干，再W质量体积比（g/ml)为1:5溶于无水甲醇后上葡聚糖凝胶柱，所述的葡聚糖凝胶 柱为葡聚糖凝胶LH-20柱，上样量与葡聚糖凝胶LH-20的质量体积比（g/ml)为1:100,用 4BV无水甲醇进行洗脱，洗脱流速为Iml/min，将洗脱液分瓶收集，优选为按1/5BV分瓶收 集。
[0020] 本发明的柯里拉京的提取分离方法，采用步骤（1)中的方法在龙眼果核中提取柯 里拉京的得率是7. Img/g干果核。本发明采用RP-HPLC法测定从龙眼果核中提取柯里拉京 的得率和跟踪提取物分离制备柯里拉京的情况，并评价柯里拉京抑制酪氨酸酶的作用。
[0021] W 1. Ommol/L的kDOPA为底物，先将1. 0血3mol/L kDOPA溶液（溶液为抑= 6. 8的磯酸盐缓冲溶液）置于比色杯中，加入0. 85血抑=6. 8的磯酸盐缓冲溶液，在3(TC 恒温水浴中恒温lOmin，加入1. 0血柯里拉京溶液（溶液为抑=6. 8的磯酸盐缓冲溶液中） 和0. 15mL 0. 15g/L酪氨酸酶水溶液，测定0〇475。此测活体系中，酶的终质量浓度为7. 5mg/ L。对酶的相对抑制率（I)可W定义为式：
[0022] / = (i-S^)xi〇〇%
[0023] 式中；ODi是指含有底物、酪氨酸酶、柯里拉京的测活体系的吸光度值；0化是指含 有底物、酪氨酸酶，但不含柯里拉京的测活体系的吸光度值；〇〇3是指含有底物、柯里拉京， 但不含酪氨酸酶的测活体系的吸光度值；〇〇4是指含有底物，但不含酪氨酸酶、柯里拉京的 测活体系的吸光度值。
[0024] 结果是0. 5mg/mU〇. 79mmol/L)柯里拉京对酪氨酸酶的抑制率是51. 38%。而化妆 品美白添加剂熊果巧的酪氨酸酶的ICw值是5. 3mmol/L。
[0025] 因此，本发明的第二个目的是提供柯里拉京在抑制酪氨酸酶方面的应用，该应用 可用于制备美白化妆品。
[0026] 本发明的技术效果；采用丙丽水溶液提取，提取效果好，柯里拉京的得率在6mg/g 干果核W上，溶剂易于回收，采用无水丙丽预处理龙眼果核粉末不但可W获得精油（另作 处理）而且还能减少提取液中的油溶性组分因此可简化处理步骤，提取物不需用常规方法 处理即W不同极性溶剂分别萃取而直接上聚醜胺层析柱，一次柱层析就能得到高纯柯里拉 京，柯里拉京晶体的纯度达到98% W上，操作简单，同时为柯里拉京提供了一个新的应用， 也为龙眼果核的开发应用提供了一条有效途径。通过本发明的方法提取分离得到的柯里拉 京对酪氨酸酶有明显的抑制作用，可用于制备美白化妆品。
【具体实施方式】：
[0027] W下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。其他没有详细说 明的技术步骤均为本领域人员所熟知的方法。
[0028] 实施例1 :
[0029] (1)、柯里拉京的提取；先在龙眼果场收集龙眼加工丢弃的果核，自然晒干，粉碎过 20目筛得龙眼果核粉末，取龙眼果核粉末lOOg于2000血H 口烧瓶中，再加入1500血无水 丙丽，安装带密封的揽拌装置，其余两口塞紧，室温揽拌进行预处理比，静置比，析出上层 液（基本澄清），弃该上层液；第二次加入1500mL 80%丙丽水溶液，并安装温度计和回流装 置，置于水浴锅加热并控制溶液温度为55C，揽拌化，之后静置比，析出上层液并0. 04? 0. 05M化真空过滤，得到第二次滤液；第H次加入1500血60%丙丽水溶液，操作同第二次， 得到第H次滤液；合并第二、H次滤液，得到提取液，该提取液用于下一步分离；
[0030] (2)、提取液分离制备柯里拉京；按规定的方法预处理层析聚醜胺巧0-100目），具 体方法为：取聚醜胺W90?95% (V)己醇浸泡，不断揽拌，除去气泡后装入柱中，用3? 4BV的90?95% (V)己醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣（或极少残渣），再 依次用2?2. 5BV5% (W)化OH水溶液、1BV的蒸觸水、2?2. 5BV的10% (W)醋酸水溶液 洗脱，最后用蒸觸水洗脱至中性。取经预处理的层析聚醜胺80g湿法装柱，层析柱规格为 〇30X300mm，再取经预处理的层析聚醜胺20g于步骤（1)所得的提取液中混匀，得到混合 物，再常压旋转蒸发回收丙丽接着减压旋转蒸发水分至混合物成粘稠状，之后将混合物加 至聚醜胺层析柱，次用纯水3BV、10%甲醇4BV、30%甲醇4BV、50%甲醇4BV、无水甲醇8BV 进行洗脱，洗脱流速为0. 5BV/h，将50 %甲醇洗脱液按1/9BV分瓶收集浓缩并分别W薄层 聚醜胺板（W氯仿；甲醇；水=15 ;3 ;1为展开剂，柯里拉京的Rf值是0. 23)辅W RP-HPLC 法（色谱条件；Ine;rtsil ODS-3Ci8反相色谱柱（4. 6mmX250mm，5]im，日本岛津），流动相： 己膳-体积分数〇.1%磯酸水溶液，梯度洗脱程序为〇?1〇1111115%?11%，10?35111山 11%?13%，35?4511111113%?16%，流速；1.011117111111，检测波长 280皿，柱温301：，流速 l.OmL/min，柯里拉京保留时间为32. 17min)检验洗脱物中柯里拉京含量情况，将该分瓶收 集浓缩的洗脱物中柯里拉京固体含量> 60%的洗脱物合并浓缩后有柯里拉京晶体析出，滤 出晶体后将母液和其他经检测含有柯里拉京的洗脱物合并浓缩至干，得到118. 4mg物质， 再溶于ImL无水甲醇后上葡聚糖凝胶LH-20柱，葡聚糖凝胶LH-20柱规格为〇 10 X 200mm， 用无水甲醇进行洗脱，洗脱流速为ImL/min，将洗脱物每2mL分瓶收集一个流份，静置1天， 第44?49流份有柯里拉京晶体析出，合并有柯里拉京晶体析出的洗脱物，再静置至析出柯 里拉京晶体无增加，分出柯里拉京晶体，将其与层析聚醜胺柱50%甲醇洗脱分得的柯里拉 京晶体合并，再W无水己醇重结晶得83. 6mg柯里拉京晶体。
[0031] 经本实施例步骤（1)中的方法提取的柯里拉京的得率是7. Img/g干果核，再通过 步骤（2)的分离纯化后，经RP-HPLC法分析所得到的柯里拉京晶体的纯度为98. 32%。
[0032] W 1. Ommol/L的kDOPA为底物，先将1. 0血3mol/L kDOPA溶液（溶液为抑= 6. 8的磯酸盐缓冲溶液）置于比色杯中，加入0. 85血抑=6. 8的磯酸盐缓冲溶液，在3(TC 恒温水浴中恒温lOmin，加入1. 0血柯里拉京溶液（溶液为抑=6. 8的磯酸盐缓冲溶液中） 和0. 15mL 0. 15g/L酪氨酸酶水溶液，测定0〇475。此测活体系中，酶的终质量浓度为7. 5mg/ L。对酶的相对抑制率（I)可W定义为式：
[0033] / = (1-造5競)> 100%
[0034] 式中；ODi是指含有底物、酪氨酸酶、柯里拉京的测活体系的吸光度值；0化是指含 有底物、酪氨酸酶，但不含柯里拉京的测活体系的吸光度值；〇〇3是指含有底物、柯里拉京， 但不含酪氨酸酶的测活体系的吸光度值；〇〇4是指含有底物，但不含酪氨酸酶、柯里拉京的 测活体系的吸光度值。
[00巧]结果是0. 5mg/mU〇. 79mmol/L)柯里拉京对酪氨酸酶的抑制率是51. 38%。
[003引 实施例2 :
[0037] (1)、柯里拉京的提取；先在龙眼果场收集龙眼加工丢弃的果核，自然晒干，粉碎过 20目筛得龙眼果核粉末，取龙眼果核粉末lOOg于2000血H 口烧瓶中，再加入1500血无水 丙丽，安装带密封的揽拌装置，其余两口塞紧，室温揽拌进行预处理比，静置比，析出上层 液（基本澄清），弃该上层液；第二次加入1500mL 80%丙丽水溶液，并安装温度计和回流装 置，置于水浴锅加热并控制溶液温度为55°C，揽拌化，之后静置比，析出上层液并0. 04? 0. 05MPa真空过滤，得到第二次滤液；第H次加入1500血60%丙丽水溶液，操作同第二次， 得到第H次滤液；合并第二、H次滤液，得到提取液，该提取液用于下一步分离；
[0038] (2)、提取液分离制备柯里拉京；按规定的方法预处理层析聚醜胺巧0-100目），具 体方法为：取聚醜胺W90?95% (V)己醇浸泡，不断揽拌，除去气泡后装入柱中，用3? 4BV的90?95% (V)己醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣（或极少残渣），再 依次用2?2. 5BV5% (W)化0H水溶液、1BV的蒸觸水、2?2. 5BV的10% (W)醋酸水溶液 洗脱，最后用蒸觸水洗脱至中性。取经预处理的层析聚醜胺80g湿法装柱，层析柱规格为 〇30X300mm，再取经预处理的层析聚醜胺20g于步骤（1)所得的提取液中混匀，得到混合 物，再常压旋转蒸发回收丙丽接着减压旋转蒸发水分至混合物成粘稠状，之后将混合物加 至聚醜胺层析柱，次用纯水3BV、5%甲醇4BV、25%甲醇4BV、40%甲醇4BV、无水甲醇8BV 进行洗脱，洗脱流速为0. 5BV/h，将40 %甲醇洗脱液按1/9BV分瓶收集浓缩并分别W薄层 聚醜胺板（W氯仿；甲醇；水=15 ;3 ;1为展开剂，柯里拉京的Rf值是0. 23)辅W RP-HPLC 法（色谱条件；Inedsil 0DS-3Ci8反相色谱柱（4. 6mmX250mm，5]im，日本岛津），流动相： 己膳-体积分数〇.1%磯酸水溶液，梯度洗脱程序为〇?1〇1111115%?11%，10?35111山 11%?13%，35?4511111113%?16%，流速；1.011117111111，检测波长 280皿，柱温301：，流速 l.OmL/min，柯里拉京保留时间为32. 17min)检验洗脱物中柯里拉京含量情况，将该分瓶收 集浓缩的洗脱物中柯里拉京固体含量> 60%的洗脱物合并浓缩后有柯里拉京晶体析出，滤 出晶体后将母液和其他经检测含有柯里拉京的洗脱物合并浓缩至干，得到113. 8mg物质， 再溶于ImL无水甲醇后上葡聚糖凝胶LH-20柱，葡聚糖凝胶LH-20柱规格为〇10X200mm， 用无水甲醇进行洗脱，洗脱流速为ImL/min，将洗脱物每2mL分瓶收集一个流份，静置1天， 第44?49流份有柯里拉京晶体析出，合并有柯里拉京晶体析出的洗脱物，再静置至析出柯 里拉京晶体无增加，分出柯里拉京晶体，将其与层析聚醜胺柱50%甲醇洗脱分得的柯里拉 京晶体合并，再W无水己醇重结晶得80. 3mg柯里拉京晶体。
[0039] 经本实施例步骤（1)中的方法提取的柯里拉京的得率是6.8mg/g干果核，再通过 步骤（2)的分离纯化后，经RP-HPLC法分析所得到的柯里拉京晶体的纯度为98. 20%。
[0040] W 1. Ommol/L的kDOPA为底物，先将1. 0血3mol/L kDOPA溶液（溶液为抑= 6. 8的磯酸盐缓冲溶液）置于比色杯中，加入0. 85血抑=6. 8的磯酸盐缓冲溶液，在3(TC 恒温水浴中恒温lOmin，加入1. 0血柯里拉京溶液（溶液为抑=6. 8的磯酸盐缓冲溶液中） 和0. 15mL 0. 15g/L酪氨酸酶水溶液，测定0〇475。此测活体系中，酶的终质量浓度为7. 5mg/ L。对酶的相对抑制率（I)可W定义为式：
[0041] / = (1-鮮S)xi〇〇〇'/。
[0042] 式中；ODi是指含有底物、酪氨酸酶、柯里拉京的测活体系的吸光度值；0化是指含 有底物、酪氨酸酶，但不含柯里拉京的测活体系的吸光度值；〇〇3是指含有底物、柯里拉京， 但不含酪氨酸酶的测活体系的吸光度值；〇〇4是指含有底物，但不含酪氨酸酶、柯里拉京的 测活体系的吸光度值。
[0043] 结果是0. 5mg/mU〇. 79mmol/L)柯里拉京对酪氨酸酶的抑制率是51. 21%。
[0044] 实施例3 :
[0045] (1)、柯里拉京的提取；先在龙眼果场收集龙眼加工丢弃的果核，自然晒干，粉碎过 20目筛得龙眼果核粉末，取龙眼果核粉末lOOg于2000血H 口烧瓶中，再加入1500血无水 丙丽，安装带密封的揽拌装置，其余两口塞紧，室温揽拌进行预处理比，静置比，析出上层 液（基本澄清），弃该上层液；第二次加入1500mL 80%丙丽水溶液，并安装温度计和回流装 置，置于水浴锅加热并控制溶液温度为55C，揽拌化，之后静置比，析出上层液并0. 04? 0. 05MPa真空过滤，得到第二次滤液；第H次加入1500血60%丙丽水溶液，操作同第二次， 得到第H次滤液；合并第二、H次滤液，得到提取液，该提取液用于下一步分离；
[0046] (2)、提取液分离制备柯里拉京；按规定的方法预处理层析聚醜胺巧0-100目），具 体方法为：取聚醜胺W90?95% (V)己醇浸泡，不断揽拌，除去气泡后装入柱中，用3? 4BV的90?95% (V)己醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣（或极少残渣），再 依次用2?2. 5BV5% (W)化0H水溶液、1BV的蒸觸水、2?2. 5BV的10% (W)醋酸水溶液 洗脱，最后用蒸觸水洗脱至中性。取经预处理的层析聚醜胺80g湿法装柱，层析柱规格为 〇30X300mm，再取经预处理的层析聚醜胺20g于步骤（1)所得的提取液中混匀，得到混合 物，再常压旋转蒸发回收丙丽接着减压旋转蒸发水分至混合物成粘稠状，之后将混合物加 至聚醜胺层析柱，次用纯水3BV、15%甲醇4BV、35%甲醇4BV、60%甲醇4BV、无水甲醇8BV 进行洗脱，洗脱流速为0. 5BV/h，将60%甲醇洗脱液按1/9BV分瓶收集浓缩并分别W薄层 聚醜胺板（W氯仿；甲醇；水=15 ;3 ;1为展开剂，柯里拉京的Rf值是0. 23)辅W RP-HPLC 法（色谱条件；Ine;rtsil 0DS-3Ci8反相色谱柱（4. 6mmX250mm，5]im，日本岛津），流动相： 己膳-体积分数0. 1%磯酸水溶液，梯度洗脱程序为0?lOmin 5%?11%，10?35min 11%?13%，35?4511111113%?16%，流速；1.011117111111，检测波长 280皿，柱温301：，流速 1. OmL/min，柯里拉京保留时间为32. 17min)检验洗脱物中柯里拉京含量情况，将该分瓶收 集浓缩的洗脱物中柯里拉京固体含量> 60%的洗脱物合并浓缩后有柯里拉京晶体析出，滤 出晶体后将母液和其他经检测含有柯里拉京的洗脱物合并浓缩至干，得到115. 2mg物质， 再溶于ImL无水甲醇后上葡聚糖凝胶LH-20柱，葡聚糖凝胶LH-20柱规格为〇10X200mm， 用无水甲醇进行洗脱，洗脱流速为ImL/min，将洗脱物每2mL分瓶收集一个流份，静置1天， 第44?49流份有柯里拉京晶体析出，合并有柯里拉京晶体析出的洗脱物，再静置至析出柯 里拉京晶体无增加，分出柯里拉京晶体，将其与层析聚醜胺柱50%甲醇洗脱分得的柯里拉 京晶体合并，再W无水己醇重结晶得81. 4mg柯里拉京晶体。
[0047] 经本实施例步骤（1)中的方法提取的柯里拉京的得率是6.9mg/g干果核，再通过 步骤（2)的分离纯化后，经RP-HPLC法分析所得到的柯里拉京晶体的纯度为98. 26%。
[0048] W 1. Ommol/L的kDOPA为底物，先将1. 0血3mol/L kDOPA溶液（溶液为抑= 6. 8的磯酸盐缓冲溶液）置于比色杯中，加入0. 85血抑=6. 8的磯酸盐缓冲溶液，在3(TC 恒温水浴中恒温lOmin，加入1. 0血柯里拉京溶液（溶液为抑=6. 8的磯酸盐缓冲溶液中） 和0. 15mL 0. 15g/L酪氨酸酶水溶液，测定0〇475。此测活体系中，酶的终质量浓度为7. 5mg/ L。对酶的相对抑制率（I)可W定义为式：
[004引 / = 哉)xioo%
[0050] 式中；ODi是指含有底物、酪氨酸酶、柯里拉京的测活体系的吸光度值；0化是指含 有底物、酪氨酸酶，但不含柯里拉京的测活体系的吸光度值；〇〇3是指含有底物、柯里拉京， 但不含酪氨酸酶的测活体系的吸光度值；〇〇4是指含有底物，但不含酪氨酸酶、柯里拉京的 测活体系的吸光度值。
[0051] 结果是0. 5mg/mU〇. 79mmol/L)柯里拉京对酪氨酸酶的抑制率是51. 29%。
【权利要求】
1. 一种柯里拉京的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 、柯里拉京的提取：先将龙眼果核粉末按照一定的质量体积比加入无水丙酮，室温 搅拌进行预处理，静置析出上层液，弃该上层液；再将龙眼果核粉末按照一定的质量体积比 第二次加入丙酮水溶液，控制温度进行搅拌，静置析出上层液并过滤，得到第二次滤液；最 后将龙眼果核粉末按照一定的质量体积比第三次加入丙酮水溶液，操作同第二次，得到第 三次滤液；合并第二、三次滤液，得到提取液，该提取液用于下一步分离； (2) 、提取液分离制备柯里拉京：取经预处理的层析聚酰胺上层析柱，再取经预处理的 层析聚酰胺于步骤（1)所得的提取液中混匀，得到混合物，回收丙酮并蒸发水分至混合物 成粘稠状，之后将混合物加至聚酰胺层析柱，依次用纯水、5%?15%甲醇、25%?35%甲 醇、40%?60%甲醇、无水甲醇进行洗脱，将40%?60%甲醇洗脱液分瓶收集浓缩并检验 柯里拉京洗脱情况，将该分瓶收集浓缩的洗脱物中柯里拉京固体含量>60%的洗脱物合并 浓缩后有柯里拉京晶体析出，滤出晶体后将母液和其他经检测含有柯里拉京的洗脱物合并 浓缩至干，再溶于无水甲醇后上葡聚糖凝胶柱，用无水甲醇进行洗脱，将洗脱物分瓶收集， 静置，合并有柯里拉京晶体析出的洗脱物，再静置至析出柯里拉京晶体无增加，分出柯里拉 京晶体，将其与层析聚酰胺柱40%?60%甲醇洗脱分得的柯里拉京晶体合并，再以无水乙 醇重结晶，最终得到高纯度的柯里拉京。
2. -种权利要求1所述的柯里拉京的提取分离方法，其特征在于，步骤（1)中先将龙眼 果核粉末按照质量体积比为1 :15加入无水丙酮。
3. -种权利要求1所述的柯里拉京的提取分离方法，其特征在于，步骤（1)中再将龙眼 果核粉末按照质量体积比为1 :15第二次加入80%丙酮水溶液，控制温度为55°C进行搅拌 2h，静置析出上层液并0. 04?0. 05MPa真空过滤。
4. 一种权利要求1所述的柯里拉京的提取分离方法，其特征在于，步骤（1)中最后将龙 眼果核粉末按照质量体积比为1 :15第三次加入60%丙酮水溶液。
5. -种权利要求1所述的柯里拉京的提取分离方法，其特征在于，步骤（2)中所述的取 经预处理的层析聚酰胺上层析柱，所取的经预处理的层析聚酰胺与步骤（1)中被提取的龙 眼果核粉末的质量比为0.8:1 ;所述的再取经预处理的层析聚酰胺于步骤（1)所得的提取 液中混匀，所再取的取经预处理的层析聚酰胺与步骤（1)中被提取的龙眼果核粉末的质量 比为0. 2:1 ;所述的预处理，具体方法为：取聚酰胺以体积分数为90?95%的乙醇浸泡，不 断搅拌，除去气泡后装入柱中，用3?4BV的体积分数为90?95 %的乙醇洗脱，洗至洗脱液 透明并在蒸干后无残渣或极少残渣，再依次用2?2. 5BV质量分数5 %的NaOH水溶液、1BV 的蒸馏水、2?2. 5BV的质量分数为10%的醋酸水溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至中性。
6. -种权利要求1所述的柯里拉京的提取分离方法，其特征在于，步骤（2)中所述的回 收丙酮为常压旋转蒸发回收丙酮，所述的蒸发水分为减压旋转蒸发水分。
7. -种权利要求1所述的柯里拉京的提取分离方法，其特征在于，步骤（2)中依次用纯 水3BV、5 %?15 %甲醇4BV、25 %?35 %甲醇4BV、40 %?60 %甲醇4BV、无水甲醇8BV进行 洗脱，洗脱流速为〇. 5BV/h。
8. -种权利要求1所述的柯里拉京的提取分离方法，其特征在于，步骤（2)中所述的 将40 %?60%甲醇洗脱液分瓶收集浓缩，为将40 %?60%甲醇洗脱液按1/9BV分瓶收集 浓缩。
9. 一种权利要求1所述的柯里拉京的提取分离方法，其特征在于，步骤（2)中滤出晶体 后将母液和其他分瓶收集浓缩的洗脱物合并浓缩至干，再以质量体积比为1:5溶于无水甲 醇后上葡聚糖凝胶柱，所述的葡聚糖凝胶柱为葡聚糖凝胶LH-20柱，上样量与葡聚糖凝胶 LH-20的质量体积比为1:100,用4BV无水甲醇进行洗脱，洗脱流速为lml/min，将洗脱液分 瓶收集，为将洗脱液按1/5BV分瓶收集。
10. 通过权利要求1的方法提取分离的柯里拉京在抑制酪氨酸酶方面的应用。
【文档编号】A61K8/60GK104447896SQ201410637490
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月12日 优先权日:2014年11月12日
【发明者】郑公铭, 李忠军, 刘纲勇, 邹颖楠, 王永丽, 傅中, 张显策, 王如意, 黄海潮, 付晓春 申请人:广东食品药品职业学院