一种杀灭耐药烟曲霉的药物组合物及其方法
【专利摘要】本发明公开一种杀灭耐药烟曲霉的药物组合物及其方法，属于微生物【技术领域】。所述的药物组合物为柠檬醛和抗真菌药物，所述的抗真菌药物包括两性霉素B、伏立康唑和伊曲康唑。一种杀灭耐药烟曲霉的方法，包括制备药物、制备孢子悬液、药物MIC测定和联合药敏试验。本发明药物组合物既提高了药物对耐药菌株的抗菌效果，又降低了抗真菌药物的毒副作用，是治疗抗真菌药物耐药烟曲霉感染的一种较为理想的药物组合物。
【专利说明】[0001] 一种杀灭耐药烟曲霉的药物组合物及其方法
【技术领域】
[0002] 本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一种杀灭耐药烟曲霉的药物组合物以及杀 灭耐药烟曲霉的方法。
【背景技术】
[0003] 随着人口老龄化速度加快，恶性肿瘤、艾滋病、器官移植、糖尿病等患者急剧增加， 导致了大量介入诊疗技术开展以及广谱抗生素与糖皮质激素的使用，当前临床获得性深部 真菌感染呈现快速发展的趋势，并已成为免疫低下患者主要死因之一。由烟曲霉导致的侵 袭性肺曲霉病（invasive pulmonary aspergillosis, IPA)是恶性血液病、器官移植、艾滋 病等免疫受损患者常见且致命的机会感染性疾病，病死率高达80%，耐药是导致治疗失败的 一个重要原因。全球微生物耐药监测结果显示，将近28. 6%的烟曲霉菌株对两性霉素B耐 药，并且已经出现唑类耐药和多重耐药菌株，使临床IPA的治疗面临严峻挑战。如何控制耐 药的烟曲霉菌引起的IPA已经成为了临床难题，研发出新的有效的药物是解决这个难题的 一条途径，然而研发出新的有效药物是个过程及其漫长，难以应对目前耐药的严峻形势。如 果某种药物能协同传统抗真菌药使后者发挥更强的抑制烟曲霉作用，那么对缓解耐药压力 也将是很大的帮助，但目前还未见类似的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了解决日益严峻的曲霉病，抑制烟曲霉引起的真菌感染，提供 一种杀灭耐药烟曲霉的药物组合物及其方法。为实现本发明目的所使用的技术方案为：一 种杀灭耐药烟曲霉的药物组合物，所述的药物组合物为柠檬醛和抗真菌药物。
[0005] 以上所述的柠檬醛为60-70%反式柠檬醛和30-40%顺式柠檬醛。
[0006] 以上所述的抗真菌药物包括两性霉素B、伏立康唑、卡泊芬净和伊曲康唑。
[0007] 以上所述的药物组合物的载体包括雾化吸入剂、注射剂、皮肤洗剂和体外消毒剂。
[0008] 以上所述的两性霉素B为脱氧胆酸盐及其脂质体。
[0009] 两性霉素B、伏立康唑、卡泊芬净和伊曲康唑等抗真菌药物曾作为传统治疗IPA的 首选药物，因在临床上被广泛、长期使用，使烟曲霉对抗真菌药物耐药现象日益严重，且抗 真菌药大剂量应用会对机体产生明显的肾毒性。联合用药可作为控制和减少耐药菌株产生 的有效手段之一，柠檬醛作为毒性较低的中药单体活性成分作为抗真菌药物的增效剂，能 增加真菌对药物的敏感性，从而减少大剂量用药给机体带来的毒副作用。
[0010] 如两性霉素B的抗菌作用靶点主要是烟曲霉菌体细胞壁上的麦角固醇，而当烟曲 霉麦角固醇合成基因发生突变，导致麦角固醇缺失或在细胞壁上的位置发生改变，可造成 烟曲霉菌株对AMB耐药。柠檬醛不仅可以破坏烟曲霉菌体细胞壁和细胞膜，阻碍分生孢子 梗的形成，还能作用于细胞核等区域影响菌体DNA、RNA的合成，干扰正常的细胞周期，因此 两药联用，可使药物作用靶点增加进而增强抗菌作用。由于两性霉素B为亲水性药物，较难 透过菌体细胞膜的脂质双分子层，在作用靶位达到足够高的有效浓度。而柠檬醛为脂溶性 药物，可自由通过细胞膜，一但两药联用，两性霉素B可借助柠檬醛对细胞壁和细胞膜的破 坏作用，更容易渗透到菌体内部发挥氧化损伤作用，从而表现出协同抑菌作用。
[0011] 烟曲霉可在体外形成生物被膜结构，在胞外基质包被状态下，菌体的耐药性相对 其浮游状态而言会明显升高，同时MDR4等外排泵基因的表达明显上调，可增强菌体对药物 的外排作用。柠檬醛不但可以抑制和破坏白色念珠菌生物被膜形成，减弱屏障作用，还具有 药物外排泵抑制活性，可使抗菌药物易于渗入菌体内部并达到有效的蓄积量，增强其杀菌 作用。
[0012] 一种杀灭耐药烟曲霉的方法，使用以上所述的两性霉素B药物组合物，包括制备 药物、制备孢子悬液、药物MIC测定和联合药敏试验，具体检测步骤如下 ： 1) 制备药物将两性霉素B和柠檬醛，分别二甲亚砜溶解，并将溶液配成浓度为 3. 2-6. 4mg/L 和 700-819. 2 mg/L，于-90~-70°C 储存； 2)制备孢子悬液收集烟曲霉菌株接种到PDA培养皿上，置于35~37°C生化培养箱进 行复苏，后转至另一PDA培养皿并置于35~37°C生化培养箱活化3~5天后，用含0. 025% 吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗斜面表面收集孢子，用MOPS缓冲后pH为7. 0的RPMI-1640 重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，血细胞计数板调节使悬液中孢子终浓度为 (1-10) X 104CFU/mL ; 3)药物MIC测定将步骤1)制备的两性霉素B和柠檬醛分别置于无菌的2个96孔细 胞培养板的第1至第10孔，第1孔加入量为IOOu 1，第2~10孔依次以二倍稀释法至终浓 度，再将步骤2)制备的孢子悬液加入滴1至第10孔，每孔加入量为lml，第11孔为步骤2) 制备孢子悬液的生长对照孔，第12孔为RPMI-1640液体培养基，静置于35~37°C培养48h， 分别获得两性霉素B和柠檬醛的最低抑菌浓度MIC ; 4)联合药物试验在无菌96孔细胞培养板上加入两性霉素B和柠檬醛，前8列加入两 性霉素B和柠檬醛，加入两性霉素B的浓度为1/32~4MIC，添加的量为50iil，加入柠檬醛的 浓度为1/32~4MIC，添加的量各为50iU，第9列为IOOiU步骤2)制备孢子悬液的生长对 照孔，第10列为无菌对照孔，再将步骤2)制备的孢子悬液加入到96孔板的第1~10列，每 孔加入量为IOOu 1，后静置于35~37°C培养48~50h，观察。
[0013] 根据以上任一项所述药物组合物在预防或杀灭烟曲霉的药物中的应用。
[0014] 本发明突出的实质性进步和显著的特点是： 柠檬醛具有单体成分具有毒副作用少，来源广，价格低廉，不易诱导耐药等优点，柠檬 醛在体外能增强抗真菌药物的抗烟曲霉活性，逆转耐药菌株的耐药性。两种药物的MICGfiffi 较MICGi^S著降低，且联用的浓度-累积抑菌百分率曲线相对单用时明显左移，即同一药 物在同一浓度下，联合应用比单用抑菌能力更强，仅需低于4~8倍MIC的两种药物联用即可 达到与单药MIC相同的抑菌效果。可见由柠檬醛与抗真菌药物联合产生的协同作用，既提 高了药物对耐药菌株的抗菌效果，又降低了抗真菌药物的毒副作用，是治疗抗真菌药物耐 药烟曲霉感染的一种较为理想的药物组合物。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是本发明实施例2柠檬醛与两性霉素B联合作用的MIC等效曲线。
[0016] 图2是本发明实施例2柠檬醛和两性霉素B单用与联用对7株两性霉素B耐药烟 曲霉菌的浓度-累积抑菌百分率曲线。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1耐药烟曲霉药物组合物试验 (1)菌株来源收集2013年9月至2014年12月从广西医科大学第一附属医院临床 送检标本中分离的7株烟曲霉(编号分别为A^15, A^17, A^18, J/26, J/32 ;其中 痰标本5株，肺泡灌洗液I株，伤口分泌物I株)，经乳酸酚棉兰染色形态学及48°C温度试 验鉴定为经典烟曲霉，本院临床微生物检验中心进彳丁药物敏感性试验证实均为两性霉素B (Amphotericin B，AMB)耐药菌株。质控菌株选用CLSI M38-A2指南指定的近平滑念珠菌 ATCC22019。
[0018] (2)活化菌株与制备孢子悬液将7株AMB耐药烟曲霉临床株复苏并转种于 PDA斜面，35-37 °C孵育3-5d，用含0.025%吐温20的PBS液冲洗斜面表面收集孢子，经 MOPS缓冲后pH为7. 0的RPMI-1640重悬孢子，血细胞计数板调节使悬液中孢子终浓度为 2 X 104CFU/mL。
[0019] (3)配制药物柠檬醛和AMB均用二甲亚砜（DMSO)溶解，分别配制成浓度为819. 2 mg/L和3. 2mg/L的储存液，用0. 22 ii m针头滤器滤过除菌后，分装并储存于-80°C待用。
[0020] (4)测定柠檬醛及AMB单用的MIC 参照CLSI M38-A2指南，将受试药物储存液 用RPMI-1640液体培养基稀释为2倍工作浓度(其中柠檬醛的工作浓度范围为4~2048 ii g/ 1^，41^为0.03125~161^/11^)，分别取1001^加入第1至第10列，第11列为不含药物 的生长对照孔，第12列为不含药物且不含孢子的无菌对照孔。再往第1至第11列各孔加 入100 ii L制备好的孢子悬液。将完成加样的96孔板静置于35°C恒温培养箱孵育48h后 判读结果，并计算两种药物单用对7株受试烟曲霉的MIC几何均数(minimum inhibitory concentration geometric mean，MICG)，以 MICGjll用表不。实验独立重复 3 次。
[0021] (5)柠檬醛与AMB联合药敏试验用RPMI-1640液体培养基将受试药物储存液稀 释为4倍工作浓度，并根据测得两种药物单用的MIC值配制棋盘式微量液基稀释法药敏孔 板，药物工作浓度范围为受试菌株的1/32XMIC~4XMIC。将不同浓度的柠檬醛和AMB两两 组合加入96孔板，每种药物加入50 ii L，再将制备好的孢子悬液100 ii L加入各孔中，并按上 述方法设置生长对照孔和无菌对照孔。将完成加样的96孔板置于35°C恒温培养箱孵育48h 后判读结果，并计算两种药物联合应用对7株受试烟曲霉的MICG s^，实验独立重复3次。
[0022] (6)MIC值的判定将96孔板置于酶标仪，在405nm波长处测定各孔的光密度 (optical density，0D)值。真菌生长百分率（％)=(各孔OD值一无菌对照孔OD值)/ (生 长对照孔OD值一无菌对照孔OD值)X100%，抑菌百分率=1 一生长百分率。取抑菌百分率 在90%以上的最低药物浓度为MIC值。
[0023] (7)评价柠檬醛与AMB联合的作用效果本实验采用FICI对棋盘式微量液基稀 释法的测得的结果进行评价：选择两种药物联合产生最佳抑菌效应时各自的MIC值作为各 自的MIC联合，计算出部分抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index， FICI )，FICI的计算公式：FICI=甲药MIC联合/甲药MIC单用+乙药MIC联合/乙药MIC单用。FICI > 2. O表示有拮抗作用，I. O < FICK 2. O表示为无关作用，0. 5 < FICI < I. O表示为相 加作用，FICI <0.5表示为协同作用，且FICI越小，其协同作用越强。将棋盘法测得两种 药物对各个菌株的MIC结果绘制成等效线图，根据等效曲线的形状可以判断协同（凹形)、拮 抗（凸形)、无关(直线）。
[0024] 分别统计柠檬醛、AMB单用和联合应用时对所有受试AMB耐药烟曲霉各个浓度点 的抑菌率，以浓度作为横坐标，以抑菌率作为纵坐标，绘制浓度-累积抑菌百分率曲线。
[0025] (8)统计学分析用SPSS 16. 0统计软件，通过Wilcoxon符号秩检验方法比较药 物的MICG_与MICGs^，以产< 0. 05为差异有统计学意义。
[0026] 实施例2药物组合物试验结果 (1)质控标准每次独立实验所测得质控菌株ATCC22019对AMB的MIC值为Iiig/mL，在CLSIM38-A2指南规定的参考范围之内，且生长对照孔菌株生长良好，药敏试验结果 可靠。
[0027] (2 )柠檬醛与AMB单用及联用的MIC按照CLSI推荐的ECVs标准判断受试烟曲 霉对AMB的敏感性，以AMB的MIC彡Iiig/mL为敏感，>Iiig/mL为耐药。AMB单用时对受 试菌株MIC范围在2~4iig/mL，即本实验7株受试烟曲霉均对AMB耐药。柠檬醛单用的MIC 值为256~512iig/mL。具体见表1。
[0028] 表1柠檬醛与AMB单用或联合作用于7株AMB耐药烟曲霉的MIC值
【权利要求】
1. 一种杀灭耐药烟曲霉的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为柠檬醛和抗 真菌药物。
2. 根据权利要求1所述的杀灭耐药烟曲霉的药物组合物，其特征在于，所述的柠檬醛 为60-70%反式柠檬醛和30-40%顺式柠檬醛。
3. 根据权利要求1所述的杀灭耐药烟曲霉的药物组合物，其特征在于，所述的抗真菌 药物包括两性霉素 B、伏立康唑、卡泊芬净和伊曲康唑。
4. 根据权利要求1所述的杀灭耐药烟曲霉的药物组合物，其特征在于，所述的药物组 合物的载体包括雾化吸入剂、注射剂、皮肤洗剂和体外消毒剂。
5. 根据权利要求3所述的杀灭耐药烟曲霉的药物组合物，其特征在于，所述的两性霉 素 B为脱氧胆酸盐及其脂质体。
6. -种杀灭耐药烟曲霉的方法，其特征在于，使用权利要求3所述的两性霉素 B药物组 合物，包括制备药物、制备孢子悬液、药物MIC测定和联合药敏试验，具体检测步骤如下： 1) 制备药物将两性霉素 B和柠檬醛，分别二甲亚砜溶解，并将溶液配成浓度为 3. 2-6. 4mg/L 和 700-819. 2 mg/L，于-90~-70°C 储存； 2) 制备孢子悬液收集烟曲霉菌株接种到PDA培养皿上，置于35~37°C生化培养箱进行 复苏，后转至另一 PDA培养皿并置于35~37°C生化培养箱活化3~5天后，用含0. 025%吐温20 的磷酸盐缓冲液冲洗斜面表面收集孢子，用MOPS缓冲后pH为7. 0的RPMI-1640重悬孢子， 用血细胞计数板调整孢子浓度，血细胞计数板调节使悬液中孢子终浓度为1-10 X 104CFU/ mL ； 3) 药物MIC测定将步骤1)制备的两性霉素 B和柠檬醛分别置于无菌的2个96孔细 胞培养板的第1至第10孔，第1孔加入量为100 U 1，第2~10孔依次以二倍稀释法至终浓 度，再将步骤2)制备的孢子悬液加入滴1至第10孔，每孔加入量为lml，第11孔为步骤2) 制备孢子悬液的生长对照孔，第12孔为RPMI-1640液体培养基，静置于35~37°C培养48h， 分别获得两性霉素 B和柠檬醛的最低抑菌浓度MIC ; 4) 联合药物试验在无菌96孔细胞培养板上加入两性霉素 B和柠檬醛，前8列加入两 性霉素 B和柠檬醛，加入两性霉素 B的浓度为1/32~4MIC，添加的量为50iil，加入柠檬醛的 浓度为1/32~4MIC，添加的量各为50iU，第9列为lOOiU步骤2)制备孢子悬液的生长对 照孔，第10列为无菌对照孔，再将步骤2)制备的孢子悬液加入到96孔板的第1~10列，每 孔加入量为100U 1，后静置于35~37°C培养48~50h，观察。
7. 根据权利要求1-5任一项所述药物组合物在预防或杀灭烟曲霉的药物中的应用。
【文档编号】A61K31/496GK104474550SQ201410839171
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月30日 优先权日:2014年12月30日
【发明者】陈一强, 罗劲, 孔晋亮 申请人:广西医科大学