褐藻胶寡糖及其衍生物在治疗血管性痴呆中的应用的制作方法

本发明涉及褐藻胶寡糖及其衍生物及其在治疗血管性痴呆方面的应用。

背景技术：

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是指由脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征。我国VD的患病率为1.1％～3.0％，年发病率在5～9/1000人。其临床主要以治疗原发性脑血管疾病，预防VD发生为主。对于VD患者，主要以维生素E、维生素C和银杏叶制剂等作一定的辅助治疗，目前尚未有良好的治疗药物。

褐藻胶是褐藻细胞壁的主要组成成分，是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸通过1,4-糖苷键连接形成的线性阴离子多糖。褐藻胶是一种高分子化合物，分子量较大，一般在几万至几百万道尔顿之间。褐藻胶来源丰富，并已广泛应用于食品、化工和医药业等。褐藻胶具有抗凝血、抗病毒、抗菌、提高免疫力、抗肿瘤和抗炎等多种生物活性。

但由于褐藻胶分子量较大，使其在药物应用方面受到一定的限 制。因此通过各种降解方法制备的褐藻胶寡糖，包括甘露糖醛酸寡糖、古罗糖醛酸寡糖、甘古糖醛酸寡糖及其衍生物，在糖化学、糖生物学、糖工程以及糖类药物等研究领域具有重要的研究价值。可以使用很多方法降解褐藻胶得到褐藻胶寡糖，包括酶解法、化学降解法和物理降解法。

技术实现要素：

本发明提供一种褐藻胶寡糖及其衍生物在治疗血管性痴呆中的用途。本发明所述褐藻胶寡糖是褐藻胶水解降解产物。优选地，本发明所述褐藻胶寡糖是分子量在300-4500Da范围内的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐。本发明所述褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐是选自β-D-甘露糖醛酸通过1，4糖苷键连接形成的甘露糖醛酸寡糖或还原端1位为羧基的甘露糖醛酸寡糖及其衍生物、或其药学上可接受的盐。优选地，本发明涉及式(I)或式(II)的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐。本发明提供在氧化剂存在下制备的还原端1位为羧基的式(II)的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐。本发明还提供所述各种褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐用于制备治疗血管性痴呆的药物中的用途。本发明还涉及用于治疗血管性痴呆的本发明所述褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐。本发明还涉及一种治疗血管性痴呆的方法，包括给予需要治疗 的患者治疗有效量的本发明所述的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐。

本发明在一个方面涉及下列结构式(I)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，

式(I)中，n表示0-20的一个或多个整数，例如n是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20的一个或多个整数。

本发明中还涉及由下列结构式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，

式(II)中，n表示0-20的一个或多个整数，例如n是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20的一个或多个整数。

上述式(I)和(II)中，优选n＝0-10，更优选n＝2-8，最优选n＝4。n＝0-10的褐藻胶寡糖(优选n＝2-8，最优选n＝4)的生物效果较佳的原因尚不清楚，可能是它们较易被机体细胞识别和接受。在一些实施方式中，n还可以是选自所述0-20范围内的一个或多个整数。

本发明所述的例如式(I)和(II)褐藻胶寡糖可以采用专利号为 ZL200580009396.5中的方法制备及进行结构鉴定。在本发明的一个较佳实施方式中，结构式(I)所示的褐藻胶寡糖的制备方法是：将含有多聚甘露糖醛酸钠盐(它是褐藻胶的一种成分并在商业上可获得，或者例如参照中国专利ZL200580009396.5进行制备)的溶液(优选水溶液)置于高压釜中，于pH2-6、温度100-120℃的条件下反应2-6小时。然后从高压釜中将反应后的溶液取出，并中和(例如使用NaOH溶液)该反应后的溶液至中性。在搅拌的情况下，将所述中性溶液缓慢加入到乙醇(例如，工业乙醇、95％乙醇或无水乙醇)中，进行醇沉。然后，过滤分离醇沉所得固体物质(例如抽滤)，优选在过滤时用乙醇(优选无水乙醇)洗涤过滤所得固体物质。将分离得到的固体物质(通常为白色)进行干燥，即为式(I)所示褐藻胶寡糖粗品混合物。优选地，可将该褐藻胶寡糖粗品混合物进一步配成溶液(优选水溶液)，然后向该溶液中加入95％乙醇，再次进行醇沉。过滤分离再次醇沉所得沉淀物并任选地用无水乙醇洗涤。分离该沉淀物并干燥，得到固体物质。将该固体物质配成溶液(优选水溶液)，用滤膜(例如3μm孔径的滤膜)过滤该溶液并收集所得滤液。将该滤液在分子排阻色谱(Bio-Gel-P6或Bio-Gel-P10凝胶柱，例如1.6×180cm或其他尺寸)上进行洗脱分离，作为流动相的洗脱液可以是NH₄HCO₃等等。使用多个容器从该色谱依次收集洗脱液，并用硫酸-咔唑法检测各容器洗脱液中的糖含量。硫酸-咔唑法检测法是使用硫酸-咔唑显色，用常规紫外光谱仪检测，结果以光密度值(OD值)表示，不同的光密度值表示糖含量不同。出于方便的目的，可将不同分子量褐藻 胶寡糖依次称为组分1、2、3……等等。根据该检测结果分别收集含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液。将含有不同分子量褐藻胶寡糖组分(例如组分1、2、3……等等)的洗脱液各自分别浓缩、除盐、并冷冻干燥，从而得到具有不同分子量的式(I)所示褐藻胶寡糖。所述具有不同分子量褐藻胶寡糖对应于式(I)所示褐藻胶寡糖中n具有不同的值。当目标产物是褐藻胶寡糖混合物时，可以通过将含有不同褐藻胶寡糖组分的洗脱液分别干燥后混合、或将含有不同褐藻胶寡糖组分的洗脱液合并后干燥，从而得到目标混合物。

结构式(II)所示的褐藻胶寡糖的制备方法是：将上述未经分子排阻色谱分离的式(I)所示褐藻胶寡糖粗品混合物或者分离后的具有不同n值的式(I)所示褐藻胶寡糖与氧化剂在加热条件下反应，从而得到式(II)所示的褐藻胶寡糖。在一个具体实施方式中，所述氧化剂是氢氧化铜(例如通过向氢氧化钠溶液中加入硫酸铜溶液并立即混匀而得到的)。将新鲜氧化剂加入到上述未经分子排阻色谱分离的式(I)所示褐藻胶寡糖粗品混合物或者分离后的具有不同n值的式(I)所示褐藻胶寡糖制成的溶液(例如水溶液)中加热反应，直至不再有砖红色沉淀产生。将该反应体系进行离心处理以去除沉淀从而得到上清液。出于检验氧化反应是否彻底的目的，可取少许上清液再次加入所述氧化剂，检查是否还有砖红色沉淀产生。若还有砖红色沉淀产生，则将上述离心所得全部上清液与另外部分的所述氧化剂继续进行反应，直至检验时不再有砖红色沉淀产生为止。将最后得到的反应体系离心分离获得上清液。向所得上清液中加入乙醇(例如，工 业乙醇、95％乙醇或无水乙醇)进行醇沉。过滤分离醇沉所得固体物质，并用无水乙醇洗涤该固体物质。干燥所得固体物质。根据与上述结构式(I)的褐藻胶寡糖的制备方法中相同的分子排阻色谱分离方法进行分离。从而得到具有不同分子量的式(II)所示褐藻胶寡糖。所述具有不同分子量的褐藻胶寡糖对应于式(II)所示褐藻胶寡糖中n具有不同的值。当目标产物是褐藻胶寡糖混合物时，可以通过将含有不同褐藻胶寡糖组分的洗脱液分别干燥后混合、或将含有不同褐藻胶寡糖组分的洗脱液合并后干燥，从而得到目标混合物。

本发明所述式(I)或式(II)褐藻胶寡糖或其药学上可接受盐的衍生物包含一个或多个羟基被无机酸或有机酸酯化的酯。能与本发明式(I)或式(II)褐藻胶寡糖或其药学上可接受盐的一个或多个羟基形成酯的所述有机酸包括但不限于：甲酸、乙酸、草酸、羟基乙酸、丙酸、丙二酸、丁酸、丁二酸、戊酸、丙烯酸、草酸、马来酸、富马酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、甲磺酸、乳酸、水杨酸、乙酰水杨酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、羟基丁酸、己二酸、邻苯二甲酸、扁桃酸、苯甲酸、硼酸等。能与本发明式(I)或式(II)褐藻胶寡糖或其药学上可接受盐的一个或多个羟基形成酯的所述无机酸包括但不限于：硫酸、亚硫酸、磷酸、偏磷酸、亚磷酸、次磷酸、焦磷酸、多聚磷酸等。

本发明所述式(I)或式(II)寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐包含：无机盐，如锂盐、钠盐、钾盐、铍盐、镁盐、钙盐、铁盐、锌盐、硒盐、钒盐、锡盐、硅盐、锶盐，或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨 酸等碱性氨基酸形成的碱性加成盐，其中优选钠盐。所述药用盐可用常规方法制得。

本发明所述用于治疗血管性痴呆的药物包含所述式(I)或式(II)褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受载体。本发明所述药物可以是片剂、硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊、微囊剂、颗粒剂、糖浆剂、注射剂、颗粒剂、乳剂、悬浮液、溶液和用于口服或非口服给药的缓释制剂的形式。

本发明所述药学上可接受载体是指本领域技术人员熟知的药学上可接受的载体，本发明的药学上可接受载体包括但不限于：填充剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、助流剂、掩味剂、表面活性剂、防腐剂等。填充剂包括但不限于乳糖、微晶纤维素、淀粉、糖粉、糊精、甘露醇、硫酸钙等。润湿剂与黏合剂包括但不限于羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。崩解剂包括但不限于羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素等。润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇、月桂醇硫酸镁等。粘合剂包括但不限于阿拉伯胶、藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸铝镁、麦芽糖糊精、甲基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、预明胶化淀粉、藻酸钠、山梨醇、淀粉、糖浆和黄蓍胶。 助流剂包括但不限于胶体二氧化硅、粉状纤维素、三硅酸镁、二氧化硅和滑石粉。掩味剂包括但不限于阿斯巴坦、甜菊苷、果糖、葡萄糖、糖浆、蜂蜜、木糖醇、甘露醇、乳糖、山梨醇、麦芽糖醇、甘草甜素。表面活性剂包括但不限于吐温-80、泊洛沙姆。防腐剂包括但不限于尼泊金酯、苯甲酸钠、山梨酸钾等。

制备各种含有各种比例活性成分的药物组合物的方法是已知的，或根据本发明的公开内容对于本领域技术人员是显而易见的。如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,Martin,E.W.,ed.,Mack Publishing Company,19th ed.(1995)所述。制备所述药物组合物的方法包括掺入适当的药学赋形剂、载体、稀释剂等。

以已知的方法制造本发明的药物制剂，包括常规的混合、溶解或冻干方法。

本发明的药物以适于选定的施用方式的各种途径施用，例如口服或肠胃外(通过静脉内、肌内、局部或皮下途径)。

因此，本发明的药物以适当的药学上可以接受的载体(如惰性稀释剂或可食用的载体)可以全身施用，例如，口服。它们可以封闭在硬或软壳的明胶胶囊中，可以压为片剂。对于口服治疗施用，活性化合物可以结合一种或多种赋形剂，并以可吞咽的片剂、颊含片剂、含片、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆、圆片等的形式使用。这种制剂应该包含至少0.1％的活性化合物。这种制剂中活性化合物的比例当然可以变化，可以占给定的单位剂型重量的大约0.01％至大约99％。在这种治疗有用的药物制剂中，活性化合物的量使得能够获得有效剂量水 平。

片剂、含片、丸剂、胶囊剂等也可以包含：粘合剂，如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸氢二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；和甜味剂，如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦；或调味剂，如薄荷、冬青油或樱桃香味。当单位剂型是胶囊时，除了上面类型的材料，它还可以包含液体载体，如植物油或聚乙二醇。各种其他材料可以存在，作为包衣，或以其他方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆或酏剂可以包含活性化合物，蔗糖或果糖作为甜味剂，对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯作为防腐剂，染料和调味剂(如樱桃香料或桔子香料)。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应该是药学上可以接受的且以应用的量为无毒。此外，活性化合物可以掺入缓释制剂和缓释装置中。

活性化合物也可以通过输注或注射到静脉内或腹膜内施用。可以制备活性化合物或其盐的水溶液，任选可混和的无毒的表面活性剂。也可以制备在甘油、液体聚乙二醇、甘油三乙酸酯及其混合物以及油中的分散剂。在普通的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。

适于注射或输注的药物剂型可以包括包含适于无菌的可注射或可输注的溶液或分散剂的即时制剂的活性成分(任选封装在脂质体中)的无菌水溶液或分散剂或无菌粉末。在所有情况下，最终的剂型在生产和储存条件下必须是无菌的、液体的和稳定的。液体载体可以 是溶剂或液体分散介质，包括，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒的甘油酯及其合适的混合物。可以维持合适的流动性，例如，通过脂质体的形成，通过在分散剂的情况下维持所需的粒子大小，或通过表面活性剂的使用。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)产生预防微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，如糖、缓冲剂或氯化钠。通过使用延缓吸收剂的组合物(例如，单硬脂酸铝和明胶)可以产生可注射的组合物的延长吸收。

通过将合适的溶剂中的需要量的活性化合物与需要的上面列举的各种其他成分结合，然后进行过滤灭菌，制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这会产生活性成分加上任何另外需要的无菌过滤溶液中存在的成分的粉末。

有用的固体载体包括粉碎的固体(如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等)。有用的液体载体包括水、乙醇或乙二醇或水-乙醇/乙二醇混合物，本发明的组合药物可以任选在无毒的表面活性剂的帮助下以有效含量溶解或分散在其中。可以加入佐剂(如香味)和另外的抗微生物剂来优化对于给定用途的性质。

增稠剂(如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性无机材料)也可和液体载体用于形成可涂覆的糊剂、凝胶、软膏、肥皂等，直接用于使用者的皮肤上。

化合物或其活性盐或衍生物的治疗需要量，不仅取决于选择的特 定的盐，而且取决于施药方式、待治疗的疾病的本质和患者的年龄和状态，最终取决于在场医师或临床医生的决定。

上述制剂可以以单位剂型存在，该单位剂型是含有单位剂量的物理分散单元，适于向人体和其它哺乳动物体给药。单位剂型可以是胶囊或片剂，或是很多胶囊或片剂。根据所涉及的具体治疗，活性成分的单位剂量的量可以在大约0.01到大约1000毫克或更多之间进行变化或调整。

在一些实施方式中，本发明还涉及用于治疗血管性痴呆的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐，所述用于治疗血管性痴呆的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐选自β-D-甘露糖醛酸通过1，4糖苷键连接形成的甘露糖醛酸寡糖或还原端1位为羧基的甘露糖醛酸寡糖及其衍生物、或其药学上可接受的盐。在一些优选的方面，所述用于治疗血管性痴呆的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐选自下列结构式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，

其中，式(I)或式(II)中各自的n是选自0-20的一个或多个整 数。所述用于治疗血管性痴呆的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐还可以选自式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，并且n是选自0-10的一个或多个整数。所述用于治疗血管性痴呆的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐还可以选自式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，并且n是选自2-8的一个或多个整数。所述用于治疗血管性痴呆的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐还可以选自式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，并且n是4。

在一些实施方式中，本发明还涉及一种治疗血管性痴呆的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的根据本发明所述的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐。在一些实施方式，所述治疗血管性痴呆的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的根据本发明所述的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐，其中所述褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐选自β-D-甘露糖醛酸通过1，4糖苷键连接形成的甘露糖醛酸寡糖或还原端1位为羧基的甘露糖醛酸寡糖及其衍生物、或其药学上可接受的盐。在一些实施方式，所述治疗血管性痴呆的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的根据本发明所述的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受 盐，其中所述褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐选自下列结构式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，

其中，式(I)或式(II)中各自的n是选自0-20的一个或多个整数。在一些实施方式，所述治疗血管性痴呆的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的根据本发明所述的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐，其中所述褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐选自式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，并且n是选自0-10的一个或多个整数。在一些实施方式，所述治疗血管性痴呆的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的根据本发明所述的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐，其中所述褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐选自式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，并且n是选自2-8的一个或多个整数。在一些实施方式，所述治疗血管性痴呆的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的根据本发明所述的褐藻胶寡 糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐，其中所述褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐选自式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，并且n是4。

本文使用的术语“治疗”一般是指获得需要的药理和/或生理效应。该效应根据完全或部分地预防疾病或其症状，可以是预防性的；和/或根据部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用，可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖了对患者疾病的任何治疗，包括：(a)预防易感染疾病或症状但还没诊断出患病的患者所发生的疾病或症状；(b)抑制疾病的症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病的症状，即，导致疾病或症状退化。

在本发明全部实施方式中，本发明所述的褐藻胶寡糖及其衍生物还包括包含所述一种或多种褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐的混合物。例如，n还可以是选自各自所述数值范围内的多个整数。

另一方面，在本发明的全部实施方式中，本发明所述数值范围意在涵盖所述范围内的任意整数。例如，在本发明的全部实施方式中，式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐中n可以是0-20范围内的任意整数，比如n可以是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的一个或多个整数。除非特别指定，本发明所述的百分含量是指重量百分含量。

下面，本发明将通过实施例展示本发明的有益效果。本领域技术人员会知道，这些实施例是示例性的，而不是限制性的。这些实施例不会以任何方式限制本发明的范围。

附图说明

图1：式(I)所示褐藻胶寡糖柱分离图。A：P6柱分离图；B：P10柱分离图。

图2：式(II)所示褐藻胶寡糖柱分离图。A：P6柱分离图；B：P10柱分离图。

图3：褐藻胶寡糖对BCCAo所致血管性痴呆小鼠Morris水迷宫实验逃避潜伏期的作用。^#p<0.05，^##p<0.01vs假手术组；^*p<0.05vs 30min BCCAo组(n＝10,)。

图4：褐藻胶寡糖对BCCAo所致血管性痴呆小鼠Morris水迷宫实验中第一次到达原平台时间的作用。^##p<0.01vs假手术组；^*p<0.05vs 30min BCCAo组(n＝10,)。

图5：褐藻胶寡糖对BCCAo所致血管性痴呆小鼠Morris水迷宫实验穿越原平台次数的作用。^##p<0.01vs假手术组，^**p<0.05vs 30min BCCAo组(n＝10,)。

图6：褐藻胶寡糖对BCCAo所致血管性痴呆小鼠大脑海马CA1区石蜡切片HE染色的照片及完整神经细胞统计结果。^**p<0.01vs假手术组；^#p<0.05,^##p<0.01vs 30minBCCAo组，切片厚度5μm。

具体实施方式

实施例一褐藻胶寡糖的制备

称取1g多聚甘露糖醛酸钠盐(重均分子量8235Da，上海绿谷制药有限公司提供)，加入适量蒸馏水配成1％(重量百分比)的多聚甘露糖醛酸钠水溶液。用盐酸将所述1％的多聚甘露糖醛酸钠水溶液的pH值调节为4，然后将该水溶液置于高压釜中。在110℃温度下加热反应4小时。从高压釜中取出该反应后的溶液并使其冷却。冷却后，用NaOH溶液调节该反应后溶液的pH值得到中性液体。在搅拌条件下，将所述中性液体缓慢加入到该液体体积4倍体积量的乙醇中，进行醇沉并静置过夜。过滤分离醇沉所得固体物质，并在过滤分离时用无水乙醇洗涤过滤分离所得固体物质，最终得到白色滤饼。将该滤饼置于60℃烘箱中干燥，得褐藻胶寡糖粗品。

取上述褐藻胶寡糖粗品1g，配成10％的水溶液，用95％乙醇溶液再次进行醇沉。过滤分离再次醇沉所得沉淀物用无水乙醇洗涤该沉淀物。分离该沉淀物并干燥，得到固体物质。将该固体物质配成5％(重量百分比)的水溶液，用3μm孔径膜过滤该水溶液并收集滤液。将该滤液在分子排阻色谱Bio-Gel-P6凝胶柱(1.6×180cm，购自Bio-Rad公司)上进行洗脱分离，作为流动相的洗脱液为0.2mol·L^-1NH₄HCO₃。依次使用多个5毫升试管从该柱色谱收集洗脱液，然后用硫酸-咔唑法检测所述各试管中洗脱液的糖含量。根据该检测结果分别收集含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液。将含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液各自分别减压浓缩并冷冻干燥，弃去组分1，得到分别具 有不同分子量的式(I)所示褐藻胶寡糖组分2-12(根据后续检测可知，n分别具有0-10的值)(图中的Volume表示以试管数目表示的洗脱液体积)(图lA)。将Bio-Gel-P6凝胶柱难以分离的组分继续用Bio-Gel-P10凝胶柱(1.6×180cm，购自Bio-Rad公司)洗脱分离，作为流动相的洗脱液为0.2mol·L^-1NH₄HCO₃。依次使用多个5毫升试管收集洗脱液，然后用硫酸-咔唑法检测所述各试管中洗脱液的糖含量。根据该检测结果分别收集含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液。将含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液各自分别减压浓缩并冷冻干燥，而得到分别具有不同分子量的式(I)所示褐藻胶寡糖组分13-24(根据后续检测可知，n分别具有11-22的值)(图中的Volume表示以试管数目表示的洗脱液体积)(图lB)。所述Bio-Gel-P6柱和P10柱是两种具有排阻不同分子大小的聚丙烯酰胺微球，分子量在3000Dalton以下的褐藻胶寡糖可以在P6柱上得到较好的分离，分子量在3000-6000Dalton的褐藻胶寡糖可以在P10柱上得到较好的分离。经与已有对照品比较，紫外光谱分析、红外光谱分析、¹H-NMR光谱分析、¹³C-NMR光谱分析以及质谱分析后可知，在P6柱图(图1A)和P10柱图(图1B)中，分别得到组分2-24，其分别为n是0-22的式(I)所示褐藻胶寡糖化合物。根据谱图结果，合并n＝2-8的式(I)所示褐藻胶寡糖洗脱液并干燥，然后得到n＝2-8的式(I)所示褐藻胶寡糖混合物。

实施例二褐藻胶寡糖氧解产物的制备

取5g上述未经分子排阻色谱分离的褐藻胶寡糖粗品配成5％(重 量百分比)的水溶液。通过向50ml的10％(重量百分比)氢氧化钠溶液中加入25ml的5％(重量百分比)的硫酸铜溶液并立即混匀制备得到新鲜氧化剂氢氧化铜。将该新鲜氧化剂氢氧化铜立即加入到40ml上述5％(重量百分比)的褐藻胶寡糖溶液中，同时通过沸水浴进行加热，直至不再有砖红色沉淀产生。将该反应体系进行离心处理以去除沉淀从而得到上清液。取少许上清液再次加入所述氧化剂，检查是否还有砖红色沉淀产生。若还有砖红色沉淀产生，则将上述离心所得全部上清液与另外部分的所述氧化剂继续进行反应，直至检验不再有砖红色沉淀产生为止。将最后得到的反应体系离心分离获得上清液。向上清液中加入4倍体积量的95％乙醇进行醇沉，并静置过夜。过滤分离醇沉所得固体物质，并用无水乙醇洗涤该固体物质。将所得固体物质置于60℃烘箱中烘干，得到式(II)所示褐藻胶寡糖粗品。

取上述褐藻胶寡糖粗品1g，配成10％(重量百分比)的水溶液，用95％乙醇溶液再次进行醇沉，过滤分离再次醇沉所得沉淀物并任选地用无水乙醇洗涤。分离该沉淀物并干燥，得到固体物质。将该固体物质配成5％(重量百分比)的水溶液，用3μm孔径膜过滤该水溶液并收集滤液。将该滤液在分子排阻色谱Bio-Gel-P6凝胶柱(1.6×180cm，购自Bio-Rad公司)上进行洗脱分离，作为流动相的洗脱液为0.2mol·L^-1NH₄HCO₃。依次使用多个5毫升试管从该柱色谱收集洗脱液，然后用硫酸-咔唑法检测所述各集液管中洗脱液的糖含量。根据该检测结果分别收集含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液。将含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液各自分别减压浓缩并冷冻干 燥，弃去组分1，得到分别具有不同分子量的式(II)所示褐藻胶寡糖组分2-12(根据后续检测可知，n分别具有0-10的值)(图中的Volume表示以试管数目表示的洗脱液体积)(图2A)。将Bio-Gel-P6凝胶柱难以分离的组分继续用Bio-Gel-P10凝胶柱(1.6×180cm，购自Bio-Rad公司)洗脱分离，作为流动相的洗脱液为0.2mol·L^-1NH₄HCO₃。依次使用多个5毫升试管收集洗脱液，然后用硫酸-咔唑法检测所述各试管中洗脱液的糖含量。根据该检测结果分别收集含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液。将含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液各自分别减压浓缩并冷冻干燥，而得到分别具有不同分子量的式(II)所示褐藻胶寡糖组分13-23(根据后续检测可知，n分别具有11-21的值)(图中的Volume表示以试管数目表示的洗脱液体积)(图2B)。所述Bio-Gel-P6柱和P10柱是两种具有排阻不同分子大小的聚丙烯酰胺微球，分子量在3000Dalton以下的褐藻胶寡糖可以在P6柱上得到较好的分离，分子量在3000-6000Dalton的褐藻胶寡糖可以在P10柱上得到较好的分离。经与已有对照品比较，紫外光谱分析、红外光谱分析、¹H-NMR光谱分析、¹³C-NMR光谱分析以及质谱分析后可知，在P6柱图(图2A)和P10柱图(图2B)中，分别得到组分2-23，其分别为n是0-21的式(II)所示褐藻胶寡糖化合物。根据谱图结果，收集并合并n＝2-8的式(II)所示褐藻胶寡糖洗脱液并干燥，然后得到n＝2-8的式(II)所示褐藻胶寡糖混合物。

实施例三褐藻胶寡糖对双侧颈总动脉结扎(BCCAo)致血管性痴呆小鼠的作用

1实验材料

1.1试验药物

按照实施例二的方法制备得到式(II)褐藻胶寡糖(n＝2-8，即图中的组分4-10)混合物。该混合物为类白色粉末，易溶于水；尼莫地平由山东健康药业有限公司生产。

1.2实验仪器

Morris水迷宫由中国医学科学院药物研究所设计制作；

脑立体定位仪是日本Narishige公司产品；

避暗测试仪由中国医学科学院药物研究所设计制作。

1.3实验动物

C57BL/6小鼠，雄性，体重22±2g，由北京医学科学院实验动物中心提供。

2实验方法

2.1动物分组与给药

双侧颈总动脉结扎(BCCAo)模型是经全脑缺血再灌注建立的本领域常用的血管性痴呆模型。取C57BL/6小鼠，随机分为假手术组、30分钟双侧颈总动脉结扎(Bilateral Common Carotid Artery occlusion，BCCAo)模型组(简称30min BCCAo组)、褐藻胶寡糖组及阳性药尼莫地平组(简称nimo组)，每组10只小鼠。动物分组后，假手术组和30min BCCAo组小鼠灌胃蒸馏水，每天灌胃1次，连续灌胃5天后，进行BCCAo手术。褐藻胶寡糖组及阳性药尼莫地平组小鼠分别灌胃给予相应药物，每天灌胃给药1次，连续给药5天后，进行 BCCAo手术。所述BCCAo手术是先以戊巴比妥钠麻醉各组小鼠；将模型组、褐藻胶寡糖组及阳性药尼莫地平组中小鼠双侧颈总动脉分离并结扎30分钟，然后去除结扎并缝合颈部伤口；将假手术组中小鼠双侧颈总动脉分离后不结扎，直接缝合颈部切口。BCCAo后24小时，各组小鼠按所述术前给药方案分别继续灌胃给予相应药物或蒸馏水，再各自连续给药23天。BCCAo后第7天进行避暗实验的测试，第13天开始Morris水迷宫测试，评价褐藻胶寡糖对于小鼠学习记忆能力的改善作用。行为学测试结束后，处死小鼠，脑组织固定，通过HE染色等方法，评价小鼠经BCCAo后海马区神经细胞损伤情况及褐藻胶寡糖对于受损神经元的保护作用。

2.2避暗实验测试

避暗实验箱是利用小鼠具有趋暗避明的习性设计的装置，一半是暗室，一半是明室，中间有一小洞相连，暗室底部铺有通电的铜栅，动物进入暗室即受到电击而逃回明室。将动物训练24小时后，再进行测试，从动物放入明室至首次进入暗室的时间即为避暗实验潜伏期。避暗实验潜伏期越长，表明动物记忆力越好。

2.3 Morris水迷宫行为测定

Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)实验是一种强迫实验动物游泳，学习寻找隐藏在水中平台的一种实验，主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感(空间定位)的学习记忆能力。小鼠Morris水迷宫主要由一直径80cm、高70cm的圆柱型水池和一直径8cm的可移动位置的平台组成，水池上空通过一个数字摄相机与计算机相连 接。实验前预先在水池中注入清水，水深15cm，水面高出平台表面0.5cm，加入牛奶使池水变为不透明，实验过程保持平台位置不变。Morris水迷宫行为包括如下两项测试指标。

(1)定位航行实验(place navigation)，用于测量小鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力。实验自BCCAo后第13天开始，历时4天，上、下午各训练小鼠1次，共计8次。训练时小鼠入池位置为西象限1/2弧度处，头朝池壁入水。120秒内未找到站台者，实验人员将其引至站台，放置30秒，引导其学习和记忆。实验观察和记录小鼠寻找并爬上平台的路线图及所需时间，即记录其Morris水迷宫实验逃避潜伏期和游泳速度。所述Morris水迷宫实验逃避潜伏期是指从小鼠入水至找到站台的时间。Morris水迷宫实验逃避潜伏期越短，表明动物记忆力越好。

(2)空间搜索实验(spatial probe test)，用于测量小鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的保持能力。定位航行实验结束后，间隔1天，撤去平台，将小鼠从同一个入水点放入水中，测其第一次到达原平台位置的时间、穿越原平台的次数。数据采集和处理由图像自动监视和处理系统完成。

3统计学处理

对结果进行统计分析，结果以“均值±标准误”(mean±SE)表示，采用方差分析(ANOVA)进行比较。以p<0.05为差异有显著意义，p<0.0l为差异有极显著意义。

4实验结果

4.1避暗实验测试结果

避暗实验用于检测小鼠空间辨别的学习记忆能力，空间定位的记忆障碍只有在海马或海马周围区域受到损伤的情况下才会出现。结果表明，各组小鼠在进行避暗实验的潜伏期比较时，各组间的避暗实验潜伏期有差异(表1)。假手术组、30min BCCAo组及褐藻胶寡糖组的避暗实验结果相比较，30min BCCAo组小鼠与假手术组小鼠相比避暗实验潜伏期缩短，说明BCCAo小鼠记忆能力明显下降，而褐藻胶寡糖组小鼠避暗实验潜伏期高于30min BCCAo组，表明褐藻胶寡糖可明显改善血管性痴呆小鼠的学习记忆能力。

表1褐藻胶寡糖对BCCAo致小鼠避暗实验潜伏期测试结果(n＝10)

^##p<0.01vs假手术组；^*p<0.05，^**p<0.01vs 30min BCCAo组

4.2 Morris水迷宫测试结果

由图3可以看出，30min BCCAo组与假手术组相比，小鼠的Morris水迷宫实验逃避潜伏期明显延长(p<0.05)，说明BCCAo致小鼠血管性痴呆模型建立成功。随着训练时间的延长，小鼠的Morris水迷宫 实验逃避潜伏期逐渐缩短。并且从第6次开始，30min BCCAo组与假手术组相比，小鼠的Morris水迷宫实验逃避潜伏期延长，说明BCCAo小鼠学习能力明显下降，而褐藻胶寡糖可缩短Morris水迷宫实验逃避潜伏期，表明褐藻胶寡糖可明显改善血管性痴呆小鼠的学习能力。

水迷宫定位航行实验4天后，撤去平台进行空间探索实验，结果如图4、5所示，30min BCCAo组与假手术组相比，小鼠穿越原平台的次数明显减少以及第一次达到原平台所在位置的时间明显延长，说明BCCAo小鼠记忆能力明显下降，而褐藻胶寡糖给药组和阳性药Nimo组小鼠第一次达到原平台所在位置的时间明显缩短、穿越原平台的次数增加，表明褐藻胶寡糖可明显改善血管性痴呆小鼠的记忆能力。

4.3 HE染色结果观察

苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)，简称HE染色法，是组织学、胚胎学、病理学中最基本、使用最广泛的技术方法，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色，细胞质和细胞外基质中的成分着红色。HE染色结果显示(图6)，假手术组未见明显病理改变，海马区神经细胞形态正常，结构完整，核仁清晰，海马CA1区锥体细胞排列整齐，400倍高倍显微镜下可见锥体细胞核大而圆；30min BCCAo组，观察到神经细胞出现水肿现象，海马锥体细胞排列散乱，大量核出现固缩深染，甚至缺失，说明双侧颈总动脉结扎后可造成小鼠脑组织神经细胞损伤；尼莫地平组海马区神经细胞多数形态较正常，结构较为完整，CA1区锥体细胞排列较整齐，400倍 高倍显微镜下可见锥体细胞结构相对清楚，细胞间隙较大，但也存有固缩细胞；褐藻胶寡糖组海马区细胞结构与尼莫地平组相似，完整细胞数也相差不大。负责学习和记忆功能的海马CA1区完整细胞数见柱状图。图6表明褐藻胶寡糖和尼莫地平均具有保护脑组织神经细胞免受血管性痴呆损伤的作用。

分别以式(I)或式(II)中各自n为选自0-20的单个整数的褐藻胶寡糖或其药学上可接受盐对双侧颈总动脉结扎(BCCAo)致血管性痴呆小鼠进行试验，也得到了类似的结果。

实施例四褐藻胶寡糖对大脑中动脉结扎(MCAO)致血管性痴呆大鼠的作用

1实验材料

1.1试验药物

按照实施例二的方法制备得到式(II)褐藻胶寡糖(n＝2-8，即图中的组分4-10)混合物。该混合物为类白色粉末，易溶于水。

1.2实验仪器

Morris水迷宫由中国医学科学院药物研究所设计制作。

1.3实验动物

Wistar雄性大鼠，体重300～400g，由北京医学科学院实验动物中心提供。

2实验方法

2.1动物分组与给药

大脑中动脉结扎(MCAO)模型是经局灶性脑缺血建立的本领域常用的血管性痴呆模型。取雄性Wistar大鼠，随机分为空白组、假手术组、模型组(简称MCAO组)、褐藻胶寡糖12.5、25、50、100、200mg/kg组，每组10只动物。空白组、假手术组、MCAO组动物口服给予蒸馏水，褐藻胶寡糖组均口服给予所述相应剂量的褐藻胶寡糖。各组连续给药7天后，除空白组大鼠外，其余组中大鼠经水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，左侧卧位固定于鼠板上，于手术显微镜下沿外耳道与眼眦连线中点切开皮肤，暴露出颧弓，用小牵张器将磷状骨和下颌骨间距撑开，于颅骨底开一2mm×2mm的骨窗，撕开硬脑膜，暴露出大脑中动脉，用高频电刀电凝阻断一侧大脑中动脉造成局部脑缺血(假手术组动物仅暴露大脑中动脉，不进行电凝阻断)，逐层缝合切口。术中术后室温严格控制在24～25℃。术后各组继续依照各自术前给药方案给药或给予蒸馏水，术后第11天各组均进行Morris水迷宫实验。

在该实验中，各组大鼠每天训练1次，连续训练5天，即定位航行实验，记录动物找到平台所用时间(即Morris水迷宫实验逃避潜伏期)。约120秒未找到站台者，引导其按直线方向游向平台并在平台上站立30秒，诱导其学习记忆。定位航行实验结束后，间隔1天，撤去平台，将大鼠从入水点放入水中，记录第一次到达原平台时间以及穿越原平台的次数，即空间搜索实验。评价动物的学习记忆功能。所述Morris水迷宫实验逃避潜伏期是指从大鼠入水至找到平台的时 间。Morris水迷宫实验逃避潜伏期越短，表明动物记忆力越好。

3试验结果

(1)定位航行实验

大鼠连续给药18天后开始定位航行实验，连续测试5天，记录在120秒内找到平台的时间(Morris水迷宫实验逃避潜伏期)，评价大鼠的学习能力。实验结果见表2，随着训练时间延长，各组大鼠到达平台的Morris水迷宫实验逃避潜伏期逐渐缩短，从训练第4天开始，MCAO组大鼠的Morris水迷宫实验逃避潜伏期与空白组大鼠相比明显延长，表现出了明显统计学意义，表明MCAO大鼠学习能力明显下降。褐藻胶寡糖25、50、100、200mg/kg连续给药后，均在训练第2或4天开始，与MCAO组动物出现明显统计学差异，Morris水迷宫实验逃避潜伏期明显缩短，表明褐藻胶寡糖可明显改善血管性痴呆小鼠的学习能力。

表2.Morris水迷宫测试褐藻胶寡糖对MCAO致血管性痴呆大鼠学习能力的作用(mean±SE，n＝10)

^##p<0.01vs假手术组；^*p<0.05，^**p<0.01vs MCAO组

(2)空间探索实验

定位航行实验结束后，间隔1天，进行空间探索试验，测定大鼠第一次到达原平台所在位置的时间及2分钟内穿越原平台所在象限的次数，评价大鼠的记忆能力。结果见表3。与空白组动物相比，MCAO组大鼠第一次到达原平台所在位置的时间明显延长，2分钟内穿越原平台所在象限的次数明显减少，表明大脑中动脉结扎可导致大鼠记忆能力明显下降。与MCAO组动物比较，褐藻胶寡糖25、50、100、200mg/kg组大鼠第一次到达原平台所在位置的时间均明显缩短，2分钟内穿越原平台所在象限的次数均明显增加，表明褐藻胶寡糖可明显改善血管性痴呆小鼠的记忆能力。

表3.Morris水迷宫测试褐藻胶寡糖对MCAO致血管性痴呆大鼠记忆能力的作用(mean±SE，n＝10)

^#p<0.05^###p<0.001vs假手术组；^*p<0.05，^**p<0.01vs MCAO组

分别以式(I)或式(II)中各自n为选自0-20的单个整数的褐藻胶寡糖或其药学上可接受盐对大脑中动脉结扎(MCAO)致血管性痴呆大鼠进行试验，也得到了类似的结果。