一种3D的组织工程支架及其制备方法与流程

本发明涉及组织工程支架领域，具体地，涉及一种3D的组织工程支架及其制备方法。

背景技术：

每年都有着数以万计的患者因为缺乏合适的供体和有效的器官替代物而死亡，同时各类的外科修复手术费用高达百亿美元。组织工程就是在这种大背景下应运而生的新兴交叉学科，结合生命科学与工程学的基本理论，解决组织或器官缺损所致的功能障碍或丧失的治疗问题，提高人类的生存质量。组织工程学的基本原理和方法是将在体外培养、扩增的正常组织细胞种植到具有良好生物相容性且在体内可逐步降解吸收的组织工程多孔支架上，形成细胞-支架复合物，细胞在支架上增殖、分化，然后将此复合物植入机体组织病损部位，在体内继续增殖并分泌细胞外基质，伴随着材料的逐步降解，形成新的与自身功能和形态相适应的组织或器官，从而达到修复病损组织或器官的目的。

组织工程支架是组织工程的最基本构架，构筑具有特定物理、机械及生物性能的组织工程支架是组织工程的关键问题之一。理想的组织工程支架应符合以下条件：1、良好的生物相容性：使细胞可黏附和增殖，无明显的细胞毒性、炎症反应和免疫排斥，不会因邻近组织的排异反应而影响新组织的功能；2、可降解性及合适的降解速率：当移植的细胞或组织在受体内存活时，支架材料可自行降解，降解吸收速率能与细胞、组织生长速率相匹配；3、合适的孔尺寸、高的孔隙率和相连通的孔形态：以利于大量细胞的种植、细胞和组织的生长、细胞外基质的形成、氧气和营养的传输、代谢物的排泄以及血管和神经的长入；4、高的表面积、合适的表面理化性质和良好的细胞界面关系：以利于细胞黏附、增殖、分化以及负载生长因子等生物信号分子；5、与植入部位组织的力学性能相匹配的结构强度：以在体内生物力学微环境中保持结构稳定性和完整性，并为植入细胞提高合适的微应力环境；6、便于加工成理想的二维或三维结构，可以获得所需的组织或器官形状，易于重复制作，而且移植到体内后能保持原有形状(Prog.Polym.Sci.2012,37:237-280)。

生物3D打印技术是把三维快速成型技术与组织工程技术相结合，打印出具有良好生物相容性、优异力学性能、理想三维微观结构及可控宏观外形的支架的一种新兴技术。利用3D打印技术则可以根据不同患者的CT、磁共振成像(MRI)等成像数据，快速制造个性化的组织工程支架材料，甚至可以携带细胞对组织缺损部位进行原位细胞打印，该技术不仅能实现材料与患者病变部位的完美匹配，而且能在微观结构上调控材料的结构，以及细胞的排列，更有利于促进细胞的生长与分化，获得理想的组织修复效果(Materials Today,2013,16:496-504)。

用于生物3D打印的具有一定机械强度的可降解生物材料中，比较普遍应用的是基于酯基、酰胺和酸酐基团的可水解降解合成生物高分子，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)等。打印后的三维多孔支架在体外缓冲溶液中或在体内体液环境中能够缓慢被水渗透，并发生水解降解。然而现有研究中缺乏对3D打印组织工程支架降解的有效调控。

光降解调控技术是基于光降解材料基础上的，主要指聚合物在光照下受到光氧作用吸收光能(主要为紫外光能)而发生光引发断链反应和自由基氧化断链反应即Norrish光化学反应而降解成对环境安全的低分子量化合物。然而现有对于光降解调控技术的研究中，主要集中于合成光降解型交联剂并用于交联水/微凝胶以及合成光降解型嵌段共聚物并自组装形成纳米粒子的研究(Macromolecules,2012,45:1723-1736)，这些光降解型交联剂以及嵌段共聚物都不适用于生物3D打印技术制备组织工程支架。

因此，本领域迫切需要开发一种适用于3D打印、并且能够调控光降解速率的组织工程支架。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种适用于3D打印、并且能够调控光降解速率的组织工程支架。

本发明的第一方面提供了一种3D的组织工程支架，所述组织工程支架包括以下组分：

(i)可光降解的聚合物；和

(ii)可生物降解的聚合物。

在另一优选例中，所述可光降解的聚合物为含硝基苯酯基团的聚酯类聚合物(PESNB)，其结构如式I所示，

其中，R＝(OCH(CH₃)CO)_m OC_xH_2x、(OCH(CH₃)CO)_l(OCH₂CO)_pOC_xH_2x、(OCH₂CO)_qOC_xH_2x或(O(CH₂)₅CO)_rOC_xH_2x；n＝1～10的整数，m＝10～40的整数，l＝1～40的整数，p＝1～60的整数，l+p＝13～61的整数，q＝15～60的整数，r＝5～30的整数，x＝2～6的整数。

在另一优选例中，所述可生物降解的聚合物为聚酯类聚合物。

在另一优选例中，所述聚酯类聚合物选自下组：聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、或其组合。

在另一优选例中，所述(i)可光降解的聚合物与所述(ii)可生物降解的聚合物的重量比为0.8-1.2:0.1-100，较佳地，1:0.2-80，更佳地，1:0.2-60，更佳地，1:0.2-20，最佳地，1:0.2-10。

在另一优选例中，所述(i)可光降解的聚合物与所述(ii)可生物降解的聚合物在所述组织工程支架中占的重量比为20％-100％，较佳地，50％-100％，更佳地，80％-100％，最佳地，90％-100％。

在另一优选例中，所述可光降解的聚合物的重均分子量为1000-100000，较佳地，5000-80000，更佳地，8000-40000。

在另一优选例中，所述可光降解的聚合物的数均分子量为1000-40000，较佳地，5000-40000，更佳地，8000-40000。

在另一优选例中，所述可生物降解的聚合物的重均分子量为0.5～100万，较佳地，1～50万，更佳地，2～10万。

在另一优选例中，所述可生物降解的聚合物的数均分子量为0.3～50万，较佳地，0.8～30万，更佳地，2～10万。

在另一优选例中，所述组织工程支架为多孔结构。

在另一优选例中，所述组织工程支架为三维多孔结构。

在另一优选例中，所述组织工程支架的孔径为10-1000μm，较佳地，50-800μm，更佳地，100-500μm。

在另一优选例中，所述组织工程支架的纤维直径为20-1000μm，较佳地，50-800μm，更佳地，100-300μm。

在另一优选例中，所述组织工程支架的形状选自下组：立方体、圆柱体、 组织器官形态(如下颌骨组织)、或其组合。

在另一优选例中，所述组织工程支架为多层纤维结构。

在另一优选例中，所述组织工程支架的纤维夹角为30°、45°、60°、75°或90°。

在另一优选例中，所述组织工程支架的第n+2层与第n层的纤维错开100～300μm。

在另一优选例中，所述组织工程支架为固化的。

在另一优选例中，所述组织工程支架具有以下一种或多种特性：

(i)光降解特性，当用光强30mW/cm²的紫外光照射15min，所述支架的质量损失≥0.2％，较佳地，≥0.5％；

(ii)机械性能，压缩模量大于0.1Mpa。

本发明第二方面提供了一种适用于3D打印的打印混合物，包括：

(i)可光降解的聚合物；和

(ii)可生物降解的聚合物。

在另一优选例中，所述可光降解的聚合物为含硫的芳基酯类聚合物。

在另一优选例中，所述可光降解的聚合物为含硝基苯酯基团的聚酯类聚合物(PESNB)，其结构如式I所示，

其中，R＝(OCH(CH₃)CO)_m OC_xH_2x、(OCH(CH₃)CO)_l(OCH₂CO)_pOC_xH_2x、(OCH₂CO)_qOC_xH_2x或(O(CH₂)₅CO)_rOC_xH_2x；n＝1～10的整数，m＝10～40的整数，l＝1～40的整数，p＝1～60的整数，l+p＝13～61的整数，q＝15～60的整数，r＝5～30的整数，x＝2～6的整数。

在另一优选例中，所述可生物降解的聚合物为聚酯类聚合物。

在另一优选例中，所述聚酯类聚合物选自下组：聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、或其组合。

在另一优选例中，所述(i)可光降解的聚合物与所述(ii)可生物降解的聚合物的重量比为0.8-1.2:0.1-100，较佳地，1:0.2-80，更佳地，1:0.2-60，更佳地，1:0.2-20，最佳地，1:0.2-10。

在另一优选例中，所述(i)可光降解的聚合物与所述(ii)可生物降解的 聚合物的重量占所述打印混合物总重量的100％。

本发明第三方面提供了一种组织工程支架的制法，包括步骤：

(a)提供一个本发明第二方面所述的打印混合物；

(b)将上述打印混合物用于3D打印，形成未固化(凝胶状)的组织工程支架；

(c)使得步骤(b)所得到的未固化(凝胶状)的组织工程支架固化或硬化，形成本发明第一方面所述的3D的组织工程支架。

在另一优选例中，所述3D打印的熔融温度为50～200℃，较佳地，70～180℃，更佳地，90～160℃。

在另一优选例中，所述打印压力为0.5～5bar，较佳地，1～4bar，更佳地，1.5～3.5bar。

在另一优选例中，所述打印速率为0.5～20mm/s，较佳地，1～18mm/s，更佳地，2～16mm/s。

本发明第四方面提供了一种本发明第二方面所述打印混合物的用途，用于制备所述的组织工程支架。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明一个实施例的可光调控降解速率的3D打印组织工程支架的光学照片。

图2显示了本发明一个实施例中利用3D打印制备得到的可光调控降解速率的3D打印组织工程支架的扫描电子显微图像。

图3显示了本发明一个实施例中可光调控降解速率的3D打印组织工程支架的光照/不光照条件下的水解降解曲线。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外的开发了一种3D打印的组织工程支架，其包括(i)可光降解的聚合物(如PESNB)和(ii)可生物降解的聚酯类聚合物，将(i)和(ii)以一定比例混合，用3D打印技术形成的组织工程支架不仅具有良好的光降解性，还具有降解速率可调、降解部位可设计、外观和内部微结构皆 精确可控的特点。

可光降解的聚合物

如本文所用，所述“可光降解的聚合物”指在光照条件下，能够降解的聚合物。

在本发明中，一类优选的“可光降解的聚合物”指含硝基苯酯结构的聚酯类聚合物(PESNB)，具有式I结构,

本发明所述的“可光降解的聚合物”具有显著的光降解特性。

本发明所述的“可光降解的聚合物”的制备见专利申请号为201510336322.8，申请日为20150617的中国专利申请。该专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。

可生物降解的聚合物

如本文所用，所述“可生物降解的聚合物”指在生物体内可逐渐水解的聚合物。所述可生物降解的聚合物包括(但不限于)：聚羟基乙酸PGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚氯酯、聚原酸酯(POE)、聚酸酐、聚乙烯醇(PVA)、酪氨酸衍生的聚碳酸酯、它们的共聚物以及它们的组合。

天然来源的可生物降解的聚合物包括(但不限于)：胶原、壳聚糖、纤维蛋白、粘多糖、丝心蛋白、琼脂糖、海藻酸盐、淀粉、或其组合。

在本发明中，一类优选的“可生物降解的聚合物”是聚酯类聚合物。所述聚酯类聚合物选自下组：聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、或其组合。

3D的组织工程支架及其制备

本发明所述的“3D的组织工程支架”为既可光降解，又可生物降解的组织工程支架。在本发明中，3D的组织工程支架的光降解速率主要与组分(i)的种类和数量直接相关。

在本发明中，所述3D的组织工程支架含有以下组分：(i)可光降解的聚合 物；(ii)可生物降解的聚合物(如聚酯类聚合物)。

在一优选实施方式中，所述可光降解的聚合物为含硫的芳基酯类聚合物。

在一优选实施方式中，所述可光降解的聚合物为含硝基苯酯基团的聚酯类聚合物(PESNB)，其结构如式I所示，

其中，R＝(OCH(CH₃)CO)_m OC_xH_2x、(OCH(CH₃)CO)_l(OCH₂CO)_pOC_xH_2x、(OCH₂CO)_qOC_xH_2x或(O(CH₂)₅CO)_rOC_xH_2x；n＝1～10的整数，m＝10～40的整数，l＝1～40的整数，p＝1～60的整数，l+p＝13～61的整数，q＝15～60的整数，r＝5～30的整数，x＝2～6的整数。

在本发明中，所述可光降解的聚合物与所述聚酯类聚合物之间的重量比决定了组织工程支架的光降解特性。所述可光降解的聚合物与所述聚酯类聚合物之间的重量比没有特别的限制，一种典型的重量比为0.8-1.2:0.1-100，较佳地，1:0.2-80，更佳地，1:0.2-60，更佳地，1:0.2-20，最佳地，1:0.2-10。一种优选的重量比为，当PESNB与PLA的重量比为1:0.2时，组织工程支架具有优异的光降解特性。

本发明所述的组织工程支架可以为三维多孔结构，所述孔径的大小没有特别的限制，一种典型的孔径为10-1000μm，较佳地，50-800μm，更佳地，100-500μm。一种优选的孔径为100～500μm，并且孔的形状没有特别的限制，一种典型的孔的形状为立方体、圆柱体、组织器官形态(如下颌骨组织)、或其组合。一种优选的孔的形状为方形孔。

在本发明中，打印的纤维直径没有特别的限制，一种典型的纤维直径为20-1000μm，较佳地，50-800μm，更佳地，100-300μm。一种优选的直径为100－300μm。并且，相邻层间纤维的夹角没有特别的限制，一种优选的夹角为20°-90°，较佳地，30°－75°，更佳地，45°－60°。

在本发明的3D打印中，不同层之间的纤维错开一定距离(如，第n+2层与第n层的纤维错开100～300μm)打印，其中，n为正整数。

通常，3D组织工程支架可以用常规方法制得。在本发明中，所述3D组织工程支架用如下方法制备：

(a)提供一个打印混合物(含有可光降解的聚合物与可生物降解的聚合物)；

(b)将上述打印混合物用于3D打印，形成未固化(凝胶状)的组织工程支架；

(c)使得步骤(b)所得到的未固化(凝胶状)的组织工程支架固化或硬化，形成本发明第一方面所述的组织工程支架。

光降解特性

如本文所用，所述“光降解特性”是指在紫外光下，本发明所述的组织工程支架会降解，并且降解速率会随着紫外光的波长和照射强度的变化而变化。

通常，组织工程支架可用常规方法进行性能测试。在本发明中，组织工程支架用如下方法进行测定：扫描电镜，称量法监测质量损失，GPC测分子量损失。

在一优选实施方式中，测定条件如下：紫外光波长为200～500nm(优选365nm)，照射光强为30mW/cm²，且光照时间为15min。在本发明中，在所述测定条件下，当组织工程支架的质量损失≥0.1％(较佳地≥0.2％，更佳地≥0.5％)(按组织工程支架的总质量计)，则认为所述组织工程支架具有光降解特性。

打印混合物

如本文所用，所述“打印混合物”为油墨混合物，指由打印机分配的任意材料，并可包括落入本发明保护范围内的任意化合物或混合物。

在一优选实施方式中，所述“打印混合物”包括：

(i)可光降解的聚合物；和

(ii)可生物降解的聚合物。

在一优选实施方式中，所述“打印混合物”还可以包括溶剂，所述溶剂为功能性助剂，具有生物相容性。

应用

本发明所述的3D组织工程支架可以用于多种组织或器官的修复和再生，所述组织包括：下颌骨，趾骨，指骨及其他浅表部位的骨骼。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明通过生物3D打印技术，采用可光降解的聚合物(如PESNB)与可生物降解的聚合物(如PLA、PLGA、PCL)混合打印的方法，并结合光调控手段，能够得到一系列降解速率可调、降解部位可设计的、外观和内部微结构皆精确可控的组织工程支架，从而能在组织修复过程中更好地匹配组织的生成。

(2)本发明的3D组织工程支架具有良好的光降解特性，并且可通过光照调节组织工程支架的降解速率。

(3)具有良好的机械性能。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

材料：

本发明所述PESNB的结构和制备，见专利申请号为201510336322.8，申请日为20150617的中国专利申请。该专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。

实施例1

(1)打印配方设计：打印材料选用PESNB单独打印，其中PESNB的R基为R＝(OCH(CH₃)CO)₂₀OC₂H₄，PESNB结构中重复单元个数n＝5。

(2)打印过程及参数：将PESNB粉末装入生物3D打印机Bio-Plotter的高温熔融打印喷头中，并通过与3D打印机连接的计算机设计打印结构为打印纤维直径为150μm，纤维间隔为200μm，相邻层间纤维夹角为45°，第n+2层与第n层的纤维错开150μm打印，支架外形为5mm×5mm×1mm的立方体结构。打印前，先将打印筒升温至130℃使材料熔融，打印时设置打印温度为130℃，压力为2bar，打印速率为10mm/s。在PTFE膜接收基质上层层叠加打印并自然冷却固化得到可光调控降解速率的组织工程支架(图1和图2)。

实施例2

(1)打印配方设计：打印材料选用PESNB与分子量为7万的左旋PLA混合打印，其中PESNB的R基为R＝(OCH(CH₃)CO)₂₀OC₄H₈，PESNB结构中重复单元个数n＝5，PESNB与PLA的质量比为1：0.2。

(2)打印过程及参数：将混合均匀的聚合物粉末装入生物3D打印机Bio-Plotter的高温熔融打印喷头中，并通过与3D打印机连接的计算机设计打印结构为打印纤维直径为150μm，纤维间隔为200μm，相邻层间纤维夹角为90°，第n+2层与第n层的纤维错开175μm打印，支架外形为5mm×5mm×2.5mm的立方体结构。打印前，先将打印筒升温至130℃使材料熔融，打印时设置打印温度为126℃，压力为2bar，打印速率为10mm/s。在玻璃接收基质上层层叠加打印并自然冷却固化得到可光调控降解速率的组织工程支架(图1和图2)。

实施例3：

(1)打印配方设计：打印材料选用PESNB与分子量为7万的PLGA(PLA和PGA的比例为70：30)混合打印，其中PESNB的R基为R＝(OCH(CH₃)CO)₁₄(OCH₂CO)₆OC₄H₈，PESNB结构中重复单元个数n＝4，PESNB与PLGA的质量比为1：1。

(2)打印过程及参数：将混合均匀的聚合物粉末装入生物3D打印机Bio-Plotter的高温熔融打印喷头中，并通过与3D打印机连接的计算机设计打印结构为打印纤维直径为200μm，纤维间隔为200μm，相邻层间纤维夹角为60°，第n+2层与第n层的纤维错开200μm打印，支架外形为5mm×5mm×10mm的立方体结构。打印前，先将打印筒升温至80℃使材料熔融，打印时设置打印温度为75℃，压力为2bar，打印速率为4mm/s。在纸质接收基质上层层叠加打印并自然冷却固化得到可光调控降解速率的组织工程支架(图1和图2)。

实施例4：

(1)打印配方设计：打印材料选用PESNB单独打印，其中PESNB的R基为R＝(OCH₂CO)₆₀OC₄H₈，PESNB结构中重复单元个数n＝4。

(2)打印过程及参数：将PESNB粉末装入生物3D打印机Bio-Plotter的高温熔融打印喷头中，并通过与3D打印机连接的计算机设计打印结构为打印纤维直径为150μm，纤维间隔为200μm，相邻层间纤维夹角为90°，第n+2层与第n层的纤维错开0μm(表明没有错开打印)打印，支架外形 为5mm×5mm×2.5mm的立方体结构。打印前，先将打印筒升温至170℃使材料熔融，打印时设置打印温度为155℃，压力为2bar，打印速率为10mm/s。在纸质接收基质上层层叠加打印并自然冷却固化得到可光调控降解速率的组织工程支架(图1和图2)。

实施例5：

(1)打印配方设计：打印材料选用PESNB与分子量为10万的PCL混合打印，其中PESNB的R基为R＝(O(CH₂)₅CO)₁₀OC₆H₁₂，PESNB结构中重复单元个数n＝8，PESNB与PCL的质量比为1：5。

(2)打印过程及参数：将混合均匀的聚合物粉末装入生物3D打印机Bio-Plotter的高温熔融打印喷头中，并通过与3D打印机连接的计算机设计打印结构为打印纤维直径为300μm，纤维间隔为300μm，相邻层间纤维夹角为75°，第n+2层与第n层的纤维错开300μm打印，支架外形为5mm×5mm×1.5mm的立方体结构。打印前，先将打印筒升温至70℃使材料熔融，打印时设置打印温度为65℃，压力为1bar，打印速率为4mm/s。在纸质接收基质上层层叠加打印并自然冷却固化得到可光调控降解速率的组织工程支架(图1和图2)。

实施例6：

(1)打印配方设计：打印材料选用PESNB单独打印，其中PESNB的R基为R＝(OCH(CH₃)CO)₄₀OC₂H₄，PESNB结构中重复单元个数n＝3。

(2)打印过程及参数：将PESNB粉末装入生物3D打印机Bio-Plotter的高温熔融打印喷头中，并通过与3D打印机连接的计算机设计打印结构为打印纤维直径为300μm，纤维间隔为200μm，相邻层间纤维夹角为90°，第n+2层与第n层的纤维错开0μm打印，支架外形为5mm×5mm×2.5mm的立方体结构。打印前，先将打印筒升温至130℃使材料熔融，打印时设置打印温度为135℃，压力为2bar，打印速率为10mm/s。在PTFE膜接收基质上层层叠加打印并自然冷却固化得到可光调控降解速率的组织工程支架(图1和图2)。

实施例7：

降解测试

将实施例1-6得到的3D打印组织工程支架进行降解性能的测试，方法如下：

以实施例1的3D打印组织工程支架为例，将所述组织工程支架分为6组置于 PBS(pH 7.4)的磷酸盐缓冲溶液中，放入37℃恒温振荡箱中以100r/min的速率振荡，进行体外水解降解实验。其中3组每天取出置于37℃培养皿中，30mW/cm²的照射强度、365nm的紫外光下照射15min，另外3组不光照，在一定的时间间隔取样烘干至恒重，并称重计算重量损失。

实施例1的3D打印组织工程支架的降解结果如图3所示。结果表明，本发明的3D打印组织工程支架不仅在无光照条件下可以降解，而且在光照条件下，可以进一步加速支架的降解。

上述光照处理，使得支架的降解速率约为1.5％/天，即通过光照加速了支架材料的降解。

在上述相同条件下，实施例2-6的光降解速率均大于0.5％，在0.5-2％之间。

实施例8

将实施例1-6得到的3D打印组织工程支架分为6组置于PBS(pH 7.4)的磷酸盐缓冲溶液中，放入37℃恒温振荡箱中以100r/min的速率振荡，进行体外水解降解实验。每天取出置于365nm的紫外光下照射15min，在一定的时间间隔取样烘干至恒重，并称重计算重量损失。

结果如表1所示。结果表明，改变纤维夹角、纤维直径以及交错打印方式能显著影响支架的机械性能。

表1

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。