本发明属于材料领域，涉及一种胶原蛋白微纤维及其制备方法。
背景技术：
：在日常生活中突发性事故的急救治疗，在医院对病人的手术过程中的创伤止血，特别是战争中受伤战士的救护，病患者的局部快速且有效的止血非常重要。因为未受控制的出血是导致突发事故，术中大出血或战场伤亡的主要原因。在伊拉克战争中，战场上有50％阵亡人员是由于出血过多导致的。尽早的控制出血成为降低患者伤亡的最佳策略。创伤止血材料是应用于创伤出血救治，是救护常用的物品，创伤止血材料的研究对于创伤救治具有重要意义。止血带是能控制出血的救生器材，但对于人体很多部位如胸、腹、头、颈等止血带是无法使用或无效的。临床常用的止血材料如止血纱布、止血绷带存在着局限性：如止血时间较长、易与伤口粘连而不易换药、对伤口的感染和化脓无能为力，同时对于不规则形状、深、窄、动脉破裂等现场常见创伤的止血效果很不理想。因此，随着医学界对止血材料止血性能要求的提高，开发止血效果更佳、更适用于临床的新型止血材料势在必行。技术实现要素：本发明的目的是一种胶原蛋白微纤维及其制备方法。本发明提供的制备胶原蛋白微纤维的方法，包括如下步骤：1)以离体的哺乳动物的真皮和/或皮下组织层为原料，去除所述原料中的非胶原蛋白成分得到粗产物；2)去除步骤1)所得粗产物中的非胶原蛋白质，得到所述胶原蛋白微纤维。上述方法的步骤1)中，哺乳动物为猪、牛或马；所述步骤1)中，去除所述原料中的非胶原蛋白成分的步骤包括：将所述原料依次用酸、缓冲液、表面活性剂、水、酸、水、缓冲液浸泡。其中，所述水均为纯化水；所述酸均为醋酸、盐酸、柠檬酸的水溶液或乳酸的水溶液；所述酸的质量百分浓度均为0.5-4％，具体可为2％或3％；所述缓冲液均为PBS缓冲液，pH值均为7-8，具体为7.4；所述表面活性剂为TritonX-100、Tween-80或Tween-40的水溶液；浓度为0.5-3g/100ml，具体为0.6g/100ml或1g/100ml；所述水为纯化水。第一次用酸浸泡步骤中，时间为2-24h，具体为5h或10h；温度为4-50℃，具体为10℃；第二次用酸浸泡步骤中，时间为5-72h；温度为4-50℃；用缓冲液浸泡步骤中，时间均为20-60min，温度均为4-30℃；用表面活性剂浸泡步骤中，时间为10-72h，具体为48h；温度为20-50℃；所述用水浸泡的次数为2-5次，优选三次；每次浸泡的时间为4-30min，优选5min。所述步骤2)中，去除步骤1)所得粗产物中的非胶原蛋白质的步骤包括：将步骤1)所得粗产物与酸混合。所述酸为醋酸、盐酸、柠檬酸的水溶液或乳酸的水溶液；所述酸的质量百分浓度为0.01-0.5％，具体为0.1％；所述步骤1)所得粗产物与酸的用量比为0.1-6g：100mL；所述方法还包括如下步骤：在所述步骤1)之后，所述步骤2)去除步骤1)所得粗产物中的非胶原蛋白质步骤之前，将步骤1)所得粗产物于水中孵育，孵育完毕后进行一次脱水；所述孵育步骤中，温度为35-50℃，具体为37℃；时间为0-72h，具体为24h或48h，且所述时间不为0；所述步骤1)所得粗产物与水的质量比为1:0.25-3，具体为1:3或1:2；在所述步骤2)去除步骤1)所得粗产物中的非胶原蛋白质步骤之后，将体系进行一次粉碎，过滤，弃滤液，将滤渣中和，再过滤，收集所得固体，二次脱水，干燥，回潮，再进行二次粉碎。具体的，所述一次脱水为离心脱水；所述一次粉碎步骤中，粉碎时间为2-10min，具体为5min；所述中和步骤是在碱溶液或缓冲液中进行；所述碱溶液和缓冲液的pH值均为7-14，具体为7.4；所述碱溶液具体为NaOH或KOH的水溶液；所述缓冲液具体为PBS缓冲液；中和的时间为30-240min，具体为60min；所述二次脱水步骤中，所用脱水剂为无水乙醇或乙醇的水溶液；所得固体与所用脱水剂的重量比为1:1-1:10，具体可为1:3或1:5；所述乙醇的水溶液的质量百分浓度为75％-98％或95-98％；用无水乙醇脱水的步骤包括：先用无水乙醇进行第一步脱水后，弃溶液留残渣，再用无水乙醇对其进行第二步脱水；所述第一步和第二步脱水的时间具体均为5-30min；用乙醇的水溶液脱水的步骤包括：先用75％的乙醇水溶液进行一次脱水，再用95-98％的乙醇水溶液进行二次脱水；所述一次和二次脱水的时间具体均为5-30min。该方法能够减少乙醇用量。所述干燥步骤中，温度为室温；所述回潮步骤中，温度为18-25℃；湿度为30-40％；时间为7-14d；所述二次粉碎步骤中，时间为1-30min；温度为4-40℃。所述步骤2)中，所述水均为纯化水；另外，按照上述方法制备得到的胶原蛋白微纤维及该胶原蛋白微纤维在止血或制备止血产品中的应用，也属于本发明的保护范围。本发明所制备的胶原蛋白微纤维与目前其他的胶原蛋白微纤维专利相对比，制备工艺简化，不需要引入复杂的生产设备，从而避免了在生产过程中难以控制微生物，重金属等因素，能够满足工业化生产的要求。与目前市场上已有的海绵止血材料相对比，本发明所制备的胶原蛋白止血微纤维适用于大面积弥漫性出血，具有止血速度快，止血效率高、重金属含量合格等优点，具有广阔的应用前景。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、一、去除原料中的非胶原蛋白成分1、由专人从规范化管理的屠宰厂中收集刚完成屠宰的猪皮，尽量避免接触污染物，收集后立即冷冻储存；2、将冷冻的材料解冻后对其进行充分清洗，同时除去不适合加工的部分；3、使用质量百分浓度为2％的醋酸浸泡处理解冻后的原料10h，溶液温度控制在10℃左右，其目的是破坏细胞结构，脱除细胞以及非胶原蛋白结构；将处理后的原料使用pH值为7.4的PBS缓冲液进行浸泡清洗60min，使其最终pH值为7.4；4、将原料清洗后使用0.6g/100ml的表面活性剂TrironX-100的水溶液浸泡处理48h，处理温度为20℃，目的是进一步除去原料中的非胶原蛋白成分，随后使用纯化水浸泡清洗，清洗时间为30min，清洗次数为5次，清洗后使用离心甩干机甩干；5、将表面活性剂处理后的样品使用质量百分浓度为3％的醋酸浸泡处理，处理温度为10℃，处理时间为10h；将处理好的样品使用纯化水浸泡冲洗5次，每次5min；随后使用pH值为7.4的PBS缓冲液进行缓冲处理，时间为60min，得到粗产物；二、去除步骤1)所得粗产物中的非胶原蛋白质：6、将处理后的粗产物与纯化水混合，粗产物与水的质量比为1:3，孵育温度为37℃，孵育时间为24h；随后进行离心脱水；7、将孵育后的样品与质量百分浓度为0.1％的醋酸混合进行一次粉碎，步骤1)所得粗产物与醋酸的用量比为6g：100mL，粉碎时间为5min；8、将打碎后的样品进行过滤，滤掉未完全打碎的材料，收集滤渣进行用pH值为7.4的PBS缓冲液中和60min，发现有沉淀生成，将沉淀进行过滤，弃滤液，收集所得固体；9、将所得固体使用乙醇进行二次脱水，首先使用75％的乙醇进行脱水前处理，脱水时间为5min；随后使用98％的乙醇溶液进行脱水，脱水时间为5min；该脱水步骤可使得微纤维形态较好。10、将脱水后的胶原蛋白长纤维进行室温干燥，同时将得到的胶原蛋白长纤维进行回潮，回潮温度为25℃，湿度为40％，回潮时间为7d；11、将回潮后的胶原蛋白长纤维使用低速粉碎机进行粉碎，粉碎时间为5min，温度为20℃，制得胶原蛋白微纤维材料。实施例2：一、去除原料中的非胶原蛋白成分1、由专人从规范化管理的屠宰厂中收集刚完成屠宰的猪皮，尽量避免接触污染物，收集后立即冷冻储存；2、将冷冻的材料解冻后对其进行充分清洗，同时除去不适合加工的部分；3、使用质量百分浓度为3％的醋酸浸泡处理解冻后的原料5h，溶液温度控制在10℃左右，其目的是破坏细胞结构，脱除细胞以及非胶原蛋白结构；将处理后的原料使用pH值为7.4的PBS缓冲液进行浸泡清洗60min，使其最终pH值为7.4；4、将原料清洗后使用1g/100ml的TrironX-100溶液浸泡处理48h，目的是进一步除去原料中的非胶原蛋白成分，随后使用纯化水浸泡清洗，清洗时间为5min，清洗次数为5次，清洗后使用离心甩干机甩干；5、将表面活性剂处理后的样品使用质量百分浓度为3％的醋酸浸泡处理，处理温度为10℃，处理时间为12h；将处理好的样品使用纯化水浸泡冲洗5次，每次5min；随后使用pH为7.4的PBS缓冲液进行缓冲处理，时间为60min，得到粗产物；二、去除步骤1)所得粗产物中的非胶原蛋白质：6、将处理后的粗产物与纯化水混合，粗产物与水的质量比为1:3，孵育温度为37℃，孵育时间为48h；随后进行离心脱水；7、将孵育后的样品与质量百分浓度为0.1％的醋酸混合进行粉碎，步骤1)所得粗产物与醋酸的用量比为6g：100mL，粉碎时间为5min；8、将打碎后的样品进行过滤，滤掉未完全打碎的材料，收集滤渣进行用pH值为7.4的PBS缓冲液中和60min，发现有沉淀生成，将沉淀进行过滤，弃滤液；9、使用乙醇进行脱水，首先使用75％的乙醇进行脱水前处理，脱水时间为5min；随后使用98％的乙醇溶液进行脱水，脱水时间为5min；该脱水步骤可使得微纤维形态较好。10、将脱水后的胶原蛋白长纤维进行室温挥发，同时将得到的胶原蛋白长纤维进行回潮，回潮温度为25℃，湿度为40％，回潮时间为7d；11、将回潮后的胶原蛋白长纤维使用低速粉碎机进行粉碎，粉碎时长为10min，粉碎温度为8-10℃，制得胶原蛋白微纤维材料。实施例3：胶原蛋白微纤维的理化性能检测1、吸水率、吸水速度测试分别取实施例1、实施例2所制备的冻干后样品，约为100mg，称重m1，精确至0.001g。随后加入存有过量生理盐水的平面皿中，记录样品全部吸满水的时间，即吸水速度。随后用滤纸吸走样品表面多余水分，称重m2。计算吸收水分重量与样品重量之比，重复测量5次，求得平均值，即可得到胶原蛋白微纤维相对于自身重量的吸水率(公式1)，具体结果见表1。吸水率＝(m2-m1)/m1*100％(1)可以发现：实施例1样品的吸水速度、吸水率与实施例2样品无明显差别。2、脂肪含量分别取实施例1、实施例2所制备样品，根据《中华人民共和国药典》二部“胰酶脂肪检测”中的方法检测各胶原蛋白微纤维的脂肪含量。实验结果见表1。结果表明，两种处理方式得到的胶原蛋白微纤维样品脂肪含量无明显差异，均低于1％。3、DNA残留测试分别取实施例1、实施例2所制备的样品，根据《中华人民共和国药典》三部“外源性DNA残留量测定法”中的方法二“荧光染色法”检测各胶原纤维的DNA残留。实验结果见表1。结果表明，两个样品的DNA含量均小于2ng/mg，则可以判定本专利的脱细胞工艺能够去除免疫原性，在临床手术使用具有较高安全性。表1脂肪含量和DNA含量测试结果4、细胞毒性参照医疗器械行业标准GB/T16886.5-2003中细胞毒性检测中的MTT法，分别检测实施例1、实施例2所制备样品的细胞毒性。实验结果见表2。结果表明，两个样品均无细胞毒性，临床手术使用具有较高安全性。5、重金属检测参照《中华人民共和国药典》二部附录ⅧH“重金属检查法”，分别检测实施例1、实施例2中所制备样品的重金属。重金属指在试验条件下能与硫代乙酰胺或硫化钠作用显色的金属杂质。结果发现，实施例1、实施例2所得胶原蛋白微纤维材料中的重金属含量合格，表明，并未在实验操作过程中引入重金属。实施例4、胶原蛋白微纤维的兔耳动脉止血试验在兔子耳部中央动脉处用碘伏进行消毒和医用酒精进行脱碘，后做1cm*1cm大小的创口，切断中央动脉并撕下表皮，动脉血涌出后先用无菌医用纱布吸收，然后将0.2g干燥的实施例1、2胶原蛋白微纤维或云南白药施加于创面，并用无菌医用纱布按压止血，记录完全止血时间，平行测试三次。具体时间见表2所示。结果显示：和目前临床上广泛使用的云南白药相比，胶原蛋白微纤维在兔耳创面的止血效果更好。并且，在实验过程中发现，胶原蛋白微纤维在吸血后能够堆积聚集，有效堵塞创口。实施例5、胶原蛋白微纤维的兔肝脏止血试验在兔肝叶上做1cm*1cm创面，血液涌出后先用无菌纱布吸收，然后将0.2g干燥的实施例1、2所得胶原蛋白微纤维或云南白药施加于创面，并用无菌医用纱布按压止血，记录完全止血时间，平行测试三次。具体时间见表2所示。结果显示，胶原蛋白微纤维的止血速度明显优于云南白药组；且可以发现，胶原蛋白微纤维对实质性脏器的止血效果更好。这是因为胶原蛋白微纤维在吸血后可以堵塞血管，相对于动脉出血，脏器出血则为隐蔽的毛细管渗血，出血速度慢，所以相对而言，其止血时间短。表2兔耳创面和图肝脏创面完全止血时间组别耳创面止血时间(s)肝脏创面止血时间(s)实施例1101±870±5实施例295±669±6云南白药组267±9198±11由实施例4、5可以证明，实施例1、2所制备的胶原蛋白微纤维具有优异的止血性能，适用于弥漫性的脏器出血术。当前第1页1 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