一种五加叶总黄酮提取物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种五加叶总黄酮提取物及其制备方法和用途。

背景技术：

心脑血管类疾病是目前危害人类身体健康的疑难疾病之一，其在世界范围内的发病率及死亡率都很高。虽然目前已研制开发出很多心脑血管类药物，但是由于药物本身的毒副作用大，导致很多药物在临床使用过程中受到限制。因此寻找毒副作用小的心脑血管疾病药物是目前研究的重中之重。

近年来，随着环境污染的严重，地球上空的臭氧层不断被破坏，由此引发的皮肤加速老化及一些皮肤性疾病明显增多，如日光性皮炎、慢性光化性皮炎、多形性日光疹等，因此防晒成为延缓老化，预防和治疗疾病的最主要措施之一。目前市场上有很多种防晒剂在使用，其中主要类型为肉桂酸酯类的油性防晒剂，而且高防晒因子的护肤品中大多加入较高浓度的防晒剂，存在或轻或重的副作用及对皮肤严重的刺激性。中药防晒剂来自天然不仅符合化妆品“回归自然”的潮流，且因其独特的广谱、高效、安全防晒效果，受大多消费者青睐。

五加科五加属植物有很多种，其中细柱五加和刺五加是临床常用中药，分别以其根皮和根茎收录在《中国药典》中；糙叶五加皮不仅做药用，民间也常用来作为食材和酿制药酒，属于药食两用的植物。但是传统加工通常将五加的叶除去丢弃，这不仅造成了极大的资源浪费，也会增加生产成本和工序，对环境也可能造成污染。植物化学成分研究表明，五加叶的主要化学成分是黄酮类化合物，而黄酮类化合物具有调节心脑血管系统，抗氧化，清除氧自由基等作用。经检索，尚未发现五加叶总黄酮用于心脑缺血、止血及止咳药物和制备防晒美白化妆品的报道。故本发明专利将五加的叶经过适当处理，提供了一种具有治疗心脑缺血、止血及止咳作用的五加叶总黄酮提取物的制备方法，其操作简单、安全、易于工业化生产，充分利用了其中黄酮类的生物活性物质及其药理活性，不仅减少了资源浪费，而且保护环境，具有广泛的市场应用前景。

技术实现要素：

本发明目的之一在于提供一种高黄酮含量的五加叶总黄酮提取物。

本发明目的之二在于提供上述五加叶总黄酮提取物的新的制备方法。

本发明目的之三在于提供上述五加叶总黄酮提取物的用途。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供的一种五加叶总黄酮提取物，它具有如下特征：含有总黄酮的量为55％～100％，其中芦丁含量为10％～99％，槲皮素含量为0.05％～10％，山奈酚的含量为0.002％～0.5％，金丝桃苷含量为0.5％～70％。

本发明提供一种上述五加叶总黄酮提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)粗提物的制备

取五加叶，用4～15倍体积的溶剂提取1～3次，合并提取液，回收溶剂；残渣以适量蒸馏水充分分散，石油醚萃取3～8次；水层浓缩至适量体积，低温静置24h，取残渣，得总黄酮粗提物。

(2)纯化

将粗提物用溶剂充分溶解，上色谱柱，以不同比例的甲醇水溶液或乙醇水溶液为洗脱溶剂，洗脱适量体积，收集馏分，合并含有黄酮类成分的馏分，减压回收溶剂，干燥，即得五加叶总黄酮提取物。

步骤(1)中所述的五加叶为糙叶五加叶、细柱五加叶、吴茱萸五加叶、藤五加叶、红毛五加叶、短梗五加叶、柔毛五加叶、刺五加叶、无梗五加叶、白毛五加叶、唐五加叶、岛五加叶、异柱五加叶、民家氏五加叶、智异山五加叶中的一种或多种。

步骤(1)中所述的五加叶优选糙叶五加叶。

步骤(1)中所述的提取溶剂为甲醇、乙醇、水或者其混合物。

步骤(1)中所述的提取方法为加热回流提取、闪式提取、超声提取、冷浸提取中的一种或多种。

步骤(2)中所色谱柱的吸附剂为聚酰胺，或D101、HPD-100、AB-8、X-5、NKA-9型大孔吸附树脂。

步骤(2)中所述的干燥方法为烘干、真空干燥、微波干燥、冷冻干燥中的一种或多种。

本发明提供了一种五加叶提取物在制备治疗心脑缺血、止血及止咳药物和制备防晒美白化妆品中的应用。

本发明有如下优点和有益效果：

1.本发明制得的五加叶总黄酮提取物中含有总黄酮的量为55％～100％，其中芦丁含量为10％～99％，槲皮素含量为0.05％～10％，山奈酚含量为0.002％～0.5％，金丝桃苷含量为0.5％～70％；所得总黄酮提取物用于制备心脑缺血、止血及止咳药物，也可用于制备防晒美白化妆品。

2.本发明所述的五加叶黄酮提取物的制备工艺合理，操作简单可行，生产成本低，对环境污染小，黄酮类化合物的得率及纯度高，可用于工业化大批量生产。

附图说明

图1为混合标准品芦丁、槲皮素、山奈酚、金丝桃苷的HPLC图谱。

图2为五加叶总黄酮提取物的HPLC图谱。

图3为五加叶总黄酮提取物对Iso致小鼠心电图ST段的影响。

具体实施方式

本发明下述实施例所制得的五加叶总黄酮提取物中总黄酮的测定方法参照《中国药典》2010年版一部附录紫外分光光度法测定，以芦丁为对照品，在500nm处测定吸收度，并计算总黄酮的含量。

五加叶总黄酮提取物中的芦丁、槲皮素、山奈酚、金丝桃苷的测定方法参照《中国药典》2010年版一部附录高效液相色谱法测定。色谱条件与系统适用性试验：采用十八烷基硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50：50)为流动相，检测波长为360nm；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；理论塔板数以芦丁计不低于2000；混合标准品HPLC图谱及样品HPLC图谱如图1和图2。

通过以下实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1

五加叶总黄酮提取物的制备方法，步骤如下：

(1)粗提物的制备

取糙叶五加叶，用10倍体积的80％乙醇水溶液加热回流提取3次，合并提取液，回收溶剂；残渣以适量蒸馏水充分分散，石油醚萃取5次；水层浓缩至适量体积，低温静置24h，取残渣，得总黄酮粗提物。

(2)纯化

将粗提物用水溶液充分溶解，上D101大孔树脂色谱柱，以不同比例的乙醇水溶液为洗脱溶剂，洗脱适量体积，收集馏分，合并含有黄酮类成分的馏分，减压回收溶剂，干燥，即得糙叶五加叶总黄酮提取物A。

干燥后的糙叶五加叶总黄酮提取物A中总黄酮的量为95％，其中芦丁含量为80％，槲皮素含量为5.2％，山奈酚含量为0.25％，金丝桃苷含量为9.55％。

实施例2

五加叶总黄酮提取物的制备方法，步骤如下：

(1)粗提物的制备

取细柱五加叶，用12倍体积50％甲醇水溶液超声提取3次，合并提取液，回收溶剂；残渣以适量蒸馏水充分分散，石油醚萃取8次；水层浓缩至适量体积，低温静置24h，取残渣，得总黄酮粗提物。

(2)纯化

将粗提物用水溶充分溶解，上聚酰胺色谱柱，以不同比例的甲醇水溶液为洗脱溶剂，洗脱适量体积，收集馏分，合并含有黄酮类成分的馏分，减压回收溶剂，干燥，即得细柱五加叶总黄酮提取物B。干燥后的细柱五加叶总黄酮提取物B中总黄酮的量为92.6％，其中芦丁含量为76.8％，槲皮素含量为8.2％，山奈酚含量为0.45％，金丝桃苷含量为7.15％。

实施例3

五加叶总黄酮提取物的制备方法，步骤如下：

(1)粗提物的制备

取吴茱萸五加叶，用15倍体积的95％乙醇水溶液闪式提取2次，合并提取液，回收溶剂；残渣以适量蒸馏水充分分散，石油醚萃取6次；水层浓缩至适量体积，低温静置24h，取残渣，得总黄酮粗提物。

(2)纯化

将粗提物用溶剂充分溶解，上HPD-100大孔树脂色谱柱，以不同比例的乙醇水溶液为洗脱溶剂，洗脱适量体积，收集馏分，合并含有黄酮类成分的馏分，减压回收溶剂，干燥，即得吴茱萸五加叶总黄酮提取物C。

干燥后的吴茱萸五加叶总黄酮提取物C中总黄酮的量为81.9％，其中芦丁含量为75％，槲皮素含量为2.1％，山奈酚含量为0.32％，金丝桃苷含量为4.48％。

实施例4

下面是五加叶总黄酮提取物进行动物试验用以说明本发明提取物的活性和应用。

一、五加叶总黄酮提取物对小鼠心肌缺血缺氧的影响

1.实验动物 昆明种小鼠110只，雌雄各半，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。

2.供试药物 五加叶总黄酮A、B、C分别由本实施例1-3制得；灯盏花素，由云南白药集团有限公司生产，异丙肾上腺素，乌拉坦。

3.实验方法

(1)小鼠心肌缺血模型建立 昆明种小鼠60只，随机分成6组，分别为正常组、模型组、阳性对照药组(灯盏花素EB，10mg/kg)、五加叶黄酮提取物A、B、C组，每组10只。小鼠腹腔注射乌拉坦(112mg/kg)麻醉，用BL-420E+生物机能实验系统描记标准肢体II导联正常心电图，然后尾静脉注射(iv)给药，其中，正常组和模型组小鼠iv等量的含有DMSO的生理盐水，其他组小鼠iv相应的受试药。iv给药1h，皮下注射(sc)异丙肾上腺素(Iso)20mg/kg，记录注射Iso后1、2、5、15、30、60min各时间点的心电图(ECG)，观察ST段的变化。实验结束后，迅速取出心脏用生理盐水冲洗挤出心脏内残留的血液，再用滤纸吸干制成匀浆后，置于-20℃冰箱保存。严格按试剂盒操作检测心肌组织中LDH、MDA、SOD及GSH-PX等生化指标。

(2)小鼠气管夹闭模型 昆明种小鼠50只，雌雄各半，随机分成5组，分别为空白对照组、阳性对照组(灯盏花素EB，10mg/kg)和五加叶黄酮提取物A、B、C组，每组10只。各组小鼠腹腔注射乌拉坦(112g/kg)麻醉，固定，用BL-420E+生物机能实验系统描记标准肢体II导联心电图，然后iv给药，1h后分离小鼠气管并夹闭，记录夹闭气管后至心电图完全消失的时间。

(3)统计学处理 实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析。方差齐者采用LSD检验进行组间比较，方差不齐者采用Tamhanest2检验进行组间比较。

4.实验结果

(1)对Iso致心肌缺血小鼠心电图ST段改变的影响 从图3中可以看出，模型组小鼠在给药后60min内的各个观察时间点其ST段均有不同程度的抬高。而五加叶总黄酮提取物可不同程度的抑制Iso造成的 ST段的抬高，与模型组比较差异显著(P＜0.01)。阳性对照药也可以抑制Iso造成的ST段的抬高。

(2)对Iso致心肌缺血小鼠心肌缺血心肌组织中LDH活性的影响 结果见表1。模型组小鼠心肌组织中LDH的活性显著降低，与正常组比较差异有显著性。与10mg/kg EB相同，五加叶总黄酮提取物A、B、C组对心肌组织中LDH活力的降低有显著的抑制作用(P＜0.01)。

(3)对Iso致心肌缺血小鼠心肌缺血心肌组织中MDA含量和SOD及GSH-Px活性的影响 结果见表3。模型组小鼠心肌组织中MDA含量显著增加，而SOD和GSH-Px的活性显著降低，与正常组比较差异均有显著性。与10mg/kg EB相同，五加叶总黄酮提取物可显著降低小鼠心肌组织中MDA含量，升高GSH-PX的活性；显著升高SOD活性。

表1五加叶总黄酮提取物对Iso所致心肌缺血小鼠心肌中LDH、SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响

5.实验结论

通过本实验研究，表明五加叶总黄酮提取物对小鼠心肌缺血缺氧具有一定保护作用。

二、五加叶总黄酮提取物对小鼠止血作用的影响

1.实验动物 健康昆明种小鼠80只，体重19～21g，雌雄各半，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。

2.供试药物 五加叶总黄酮提取物A、B、C分别由本实施例1-3制得；醋酸泼尼松龙，上海信谊药厂有限公司。

3.实验方法

(1)动物选择及分组 将80只小鼠随机分成8组，每组10只，分别为空白对照组、五加叶总黄酮提取物A、B、C组的高剂量组和低剂量组、阳性对照组。实验各组分别灌饲相应药物，空白对照组给予等量蒸馏水，连续7天。

(2)剪尾法测定出血时间 末次给药1h后，将小鼠固定，露鼠尾于外，用手术刀片于小鼠尾尖1/2处横断(严格控制切割深度)，待血液自行溢出开始计时每隔30s用滤纸吸去血滴一次，直至血流自然停止(滤纸吸时无血)为止，即为出血时间。

玻片法测定小鼠凝血时间 末次给药1h后，用内径1mm，长10cm的毛细玻璃管从小鼠内眦球后静脉丛取血，待血液充满玻璃管时开始计时，接着每隔30s折断两端毛细玻璃管(约0.5cm)，并缓慢向左右拉开，观察折断处有无凝丝出现，至血凝丝出现为止的时间则为凝血时间。

(3)血小板总数测定 末次给药1h后，用直径为1mm的玻璃毛细管分别插入各鼠内眦球后脉丛取血，检测小鼠血小板总数。

(4)腹腔毛细血管通透性测定 末次给药1h后，用721型光密度仪测定小鼠腹腔液光密度(OD值)。

(5)数据处理 采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差表示，进行方差分析。

4.实验结果

五加叶黄酮提取物A、B、C组对小鼠出、凝血时间、血小板计数及毛细血管通透性的影响，见表2。其中醋酸泼尼松龙、五加叶黄酮提取物A、B、C组高剂量组和低剂量组均可明显减少小鼠出血时间及凝血时间(P_高＜0.01，P_低＜0.05)；对血小板总数有明显影响(P_高＜0.01，P_低＜0.05)；均可显著降低小鼠腹腔毛细 血管通透性，差异均有显著性(P_高＜0.01，P_低＜0.05)。

表2五加叶总黄酮提取物对小鼠出血、凝血时间、血小板及毛细血管通透性的影响

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

5.实验结论

通过该研究实验，表明五加叶总黄酮提取物具有明显的止血作用。

三、五加叶总黄酮提取物对小鼠止咳作用研究

1.实验动物 昆明种雄性小鼠80只，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。

2.供试药物 五加叶总黄酮提取物A、B、C分别由本实施例1-3制得；生理盐水。

3.实验方法

(1)取80只雄性昆明种小鼠，随机分为8组，分别为对照组、阳性对照组、五加叶总黄酮提取物A、B、C各组高剂量组和低剂量组，每组10只。分别ig相应的溶液，对照组ig等体积生理盐水，每天1次，连续6天。末次给药1h后将小鼠逐只放入钟罩内后用超声波雾化器以恒定压力匀速将氨水喷入箱内，喷雾时间为70s，观察其咳嗽潜伏期(即从开始喷雾到引起小鼠第1次咳嗽的时间)和3min内咳嗽次数(以小鼠腹肌收缩，张大口并同时伴有咳嗽声为准)。并对此实验进行两次验证。

(2)数据处理：应用SPSS 17.0软件进行统计分析，结果以表示，组间比较采用单因素方差分析。

4.实验结果

结果见表3。两次实验结果表明，五加叶总黄酮提取物高剂量组和低剂量组均可显著延长氨水引起小鼠咳嗽潜伏期。均能显著减少小鼠3min内咳嗽次数。

表3五加叶总黄酮提取物对氨水引起小鼠咳嗽的影响(n＝10)

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

5.实验结论

本实验研究结果表明，五加叶总黄酮提取物具有良好的止咳作用。

四、五加叶总黄酮提取物对阳光直接照射剃毛小鼠的防晒作用

1.实验动物 普通级雌性小鼠90只，体质量17～20g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。

2.供试药物 五加叶总黄酮提取物A、B、C分别由本实施例1-3制得；阳性对照：SPF20(PA++)丁家宜美白防晒霜。

3.实验方法

(1)动物分组及模型建立 将90只小鼠随机分成9组，每组10只，空白对照组、模型组、五加叶总黄酮提取物A组、B组、C组的高剂量组和低剂量组、阳性对照组。用剪刀剪去鼠背上的粗毛，再用一次性医用刮毛刀将剩余的绒毛剃除干净，使背部皮肤充分暴露，剃毛面积约2cm*1cm。每周脱毛1次，脱毛后用温清水洗净。

(2)给药及紫外线照射 每天正常喂养，给以充足的水分及食物。五加叶总黄酮提取物A组、B组、C组的高剂量组和低剂量组在晒前30min于剃毛小鼠背部分别按0.4g/cm²和0.1g/cm²涂抹相应药物，对照组在晒前30min于剃毛小鼠背部按0.5g/cm²涂抹SPF20(PA++)丁家宜美白防晒霜，模型组不涂任何防晒霜，以上6组在6～7月份11点到3点钟日光照射1h(分段完成每次照射至小鼠面部出汗约30min，即将小鼠移自室内休息30min，然后按上法再照射30min，累计照射量达1h)连续照射4周。空白对照组不予日光照射，也不涂任何防晒霜。实验第4周末，小鼠背部再次脱毛，面积为2cm*1cm。断颈处死全部小鼠后，立即取下背部脱毛处全层皮肤。

(3)皮肤组织匀浆的制备 每个小鼠皮肤组织标本取0.1～0.2g，在冰生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，用眼科小剪剪碎组织块，倒入玻璃匀浆管中；用量筒量取9倍冷生理盐水，倒入匀浆器中进行匀浆；以3000r/min的速度离心10min；取上清液严格按照SOD和MDA试剂盒要求进行指标测定。

(4)数据处理 采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差表示，进行方差分析。

4.实验结果 各组实验动物皮肤中SOD活性及MDA含量变化见表4。模型组与空白对照组比较，小鼠皮肤组织中SOD活性下降，MDA含量升高，且两者差异均有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，总黄酮提取物高剂量组和低剂量组各组小鼠皮肤组织中SOD活性均上升，且与模型组差异均有统计学意义(P_高＜0.01，P_低＜0.05)，而各组小鼠皮肤组织中MDA含量下降，且与模型组差异均有统计学意义(P_高＜0.01，P_低＜0.05)。与对照组比较，总黄酮提取物高剂量组和低剂量组各组小鼠皮肤组织中SOD活性差异有统计学意义(P_高＜0.01，P_低＜0.05)；且各组小鼠皮肤组织中MDA含量差异有统计学意义(P_高＜0.01，P_低＜0.05)。

表4各组实验动物皮肤中SOD活性及MDA含量变化比较

注：与模型组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01；与对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

5.实验结论

本实验研究证明五加叶总黄酮提取物对日光所致小鼠剃毛背部皮肤有防晒作用，且高剂量组的防晒效果稍高于SPF20(PA++)丁家宜美白防晒霜。

五、五加叶总黄酮提取物抑制黑色素形成的实验研究

1.体外抗氧化活性研究

(1)DPPH溶液的制备 精密称取DPPH样品0.1g于50mL量瓶中，于避光环境中，加入无水乙醇溶解并定容至刻度，得浓度2mg/mL的DPPH储备液。从DPPH储备液中移取5mL，用无水乙醇定容至100mL，得到浓度为0.1mg/mL的DPPH溶液。

(2)样品测定 分别配制浓度2mg/mL的五加叶总黄酮提取物A、B、C溶液和维生素C溶液，各取2mL加入2mL DPPH溶液，混合均匀后于室温黑暗处避光静置30min，以2mL无水乙醇和2mL该浓度下的样品溶液为空白调零，在517nm处测定吸光度值At。同时，以4mL无水乙醇为空白调零，测定2mL无水乙醇和2mL DPPH溶液于室温黑暗处避光静置30min后的吸光度A0，样品的DPPH自由基清除率计算公式为：

清除率＝(1-At/A0)*100％。其中At为样品的吸光度，A0为2mL无水乙醇和2mL DPPH溶液的吸光度。

(3)实验结果 结果见表5。

表5 DPPH自由基清除率结果比较

2.抑制酪氨酸酶活性的测定

(1)溶液的配制

L-酪氨酸溶液的配制 精密称取L-酪氨酸0.0212g，磷酸盐缓冲液预分散，超声30min，用磷酸盐缓冲液定溶于100mL容量瓶中。

酪氨酸酶溶液的配制 按照酶活力单位为200U/mL称量一定量的酪氨酸酶，用磷酸盐缓冲液溶液，定容于所需体积的容量瓶中，存于冰箱中备用，即可。

磷酸缓冲盐溶液的配制称取Na₂HPO₄·12H₂O7.5g，NaH₂PO₄·2H₂O3.2g，用去离子水充分溶解定容于250mL容量瓶中，配制成pH值为6.8的0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。

(2)测定方法

按“表6反应液组成”用微量移液器移取L-酪氨酸、PBS及五加叶总黄酮提取物A、B、C样品的反应液分别置于8个PE管中，混匀，37℃恒温10min，然后分别加入1mL的酪氨酸酶，反应10min，快速用紫外分光光度计在475nm处测定其吸光度标记为A1、A2、A_a1、A_a2、A_b1、A_b2、A_c1、A_c2。按以下公式计算样品抑制酪氨酸酶的活性：

酪氨酸酶活性抑制率＝[1-(A_样2-A_样1)/(A2-A1)]×100％其中，A1：未加样品且未加酪氨酸酶的反应液在475nm处测得的吸光度；A2：未加样品加酪氨酸酶的反应液在475nm处测得的吸光度；A_样1：加样品而未加酪氨酸酶的反应液475nm处测得的吸光度；A_样2：加样品和加酪氨酸酶的反应液在475nm处测得的吸光度

表6反应液组成

(3)实验结果

3.实验结论

结合清除DPPH自由基实验和酪氨酸酶活性抑制实验，可分别通过清除氧自由基、抑制酪氨酸酶的方式来 抑制黑色素的生成，结果显示五加叶总黄酮提取物对氧自由基和酪氨酸酶均具有较强的清除率和抑制率，所以其可用于美白化妆品的制备。

以上实施例显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，而不是以任何方式限制本发明的范围，在不脱离本发明范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。