基于响应面法优化当归总黄酮提取工艺参数的方法与流程

本发明涉及植物成分提取技术领域，具体的说是一种基于响应面法优化当归总黄酮提取工艺参数的方法。

背景技术：

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.)Diels的干燥根，性温味甘，归肝、心、脾经，为中医传统常用补血药，具有补血活血、调经止痛、润肠通便等功效，当归中含有黄酮类、生物碱类、有机酸类、挥发油类、多糖类等。黄酮类化合物作为其主要药理成分，具有较强的生理活性，如抗氧化、抗肿瘤、抗菌、降低心肌耗氧量和清除机体自由基等作用，可作为当归内在品质评价指标。“岷归3号”是应用于重离子辐照生物育种技术选育出的当归新品种，产量较其他品种高，但对于其内在品质研究较少。

目前，国内外对于中药总黄酮提取工艺的研究报道较多，提取工艺已经基本成熟。中心组合设计( Central compos-ite design，CCD) 和效应面分析法 ( Response sur-face methodology，RSM) 是近几年来国外药学工作者常用的实验设计和优化方法，使用方便，优选条件预测性好。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于响应面法优化当归总黄酮提取工艺参数的方法，在单因素实验基础上，应用中心复合设计的组合实验设计原理设计三因素五水平实验，采用统计软件Design Expert 7.0.0进行多元回归分析，确定“岷归3号”总黄酮最佳超声提取工艺。

为达到上述目的，本发明所采取的技术方案为：

一种基于响应面法优化当归总黄酮提取工艺参数的方法，本方法所述当归为利用重离子辐照生物育种技术选育出的当归新品种“岷归3号”，为当归Angelica sinensis (Oliv.)Diels的干燥根，它包括以下步骤：

步骤一、药材预处理，称取适量当归药材用水冲洗干净，置于40℃烘箱中烘干至恒重，粉碎，用粒度为60目的筛子筛分后称取2.0g药材粉末；

步骤二、采用超声辅助、乙醇溶液浸提药材中黄酮化合物，以步骤一处理好的当归药材总黄酮提取率为响应值，选择药材质量与乙醇溶液体积的料液比、乙醇体积分数和提取时间为响应因素，应用中心复合设计的组合实验设计原理设计三因素五水平实验，采用统计软件Design Expert 7.0.0进行多元回归分析，得出实验因素对响应值影响的回归方程为：

式中响应值Y为当归总黄酮提取率，变量参数X₁为料液比、变量参数X₂为乙醇体积分数、变量参数X₃为提取时间，最终确定X₁为1:30g/ml，X₂为80%，X₃为60min，当归总黄酮的提取率为1.0260%；

按照所述的变量参数，称取经步骤一预处理的药材粉末2.0g，药材中加入60ml乙醇溶液，乙醇体积分数为80%，放入超声波清洗仪中，设定超声提取时间60min，超声频率为70Hz，进行超声提取总黄酮，过滤，滤渣连同滤纸用同浓度乙醇溶液再次提取，合并滤液，挥去乙醇得黄色粘稠状物质，以同浓度的乙醇溶液转移到100ml的容量瓶中，定容、干燥；

步骤三、总黄酮提取率的计算，称取步骤二所制备的干燥的总黄酮50mg，用浓度为85%乙醇溶液溶解并定容于100ml容量瓶中；精密吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml分别定容于25ml容量瓶中，各取5ml置于10ml具塞试管中，加5g/100ml亚硝酸钠0.3ml，摇匀放置6min，再加10g/100ml硝酸铝0.3ml，摇匀放置6min，最后加体积浓度为4g/100ml的氢氧化钠4.0ml，加水至刻度线，摇匀放置10min后，在510nm处测其吸光度；以芦丁吸光度标准曲线为对照曲线，测定出药材中总黄酮的提取率为1.0260%。

总黄酮含量按下式计算：

式中，C：总黄酮提取液浓度(ug/mL)；V：提取液总体积(mL)；M：称取药材的质量（g）。

作为本发明的进一步改进，所述芦丁吸光度标准曲线的制备方法为：

精确称取干燥至质量恒定的芦丁标准品50mg，用浓度为85%乙醇溶液溶解并定容于100ml容量瓶中，精密吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml分别定容于25ml容量瓶中；各取5ml置于10ml具塞试管中，加5g/100ml亚硝酸钠0.3ml，摇匀放置6min，再加10g/100ml硝酸铝0.3ml，摇匀放置6min，最后加4g/100ml氢氧化钠4.0ml，加水至刻度线，摇匀放置10min后，在510nm处测其吸光度，以芦丁标准物质量浓度(C)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制芦丁吸光度标准曲线。

超声波辅助提取是一项重要的天然产物辅助提取技术，与传统方法相比，具有能耗低、效率高、有效成分不被破坏等优点。响应面法是一种优化工艺参数的有效方法，与传统的数理统计方法相比，具有实验次数少、周期短、求得的回归方程精度高等优点，用于研究几种因素间交互作用，根据中心复合设计研究几种实验因素间交互作用，通过直观图形分析寻求最优实验考察因素值。

本发明的有益效果为：

本发明采用超声波辅助提取方法，在单因素试验基础上选取对总黄酮提取率影响较大的提取时间、料液比和乙醇体积分数进行考察，通过响应面法建立了总黄酮提取量与三个因素之间关系的二次多项式方程模型，并绘制出三维曲面图，对其综合分析，得出最佳工艺条件：提取时间60min；料液比1:30g/ml；乙醇体积分数80%。本发明利用中心组合试验设计和效应面分析法，借助统计软件Design Expert7.0.0简便、可靠地进行优化试验和数据分析，对“岷归3号”中总黄酮提取的工艺参数进行优化，取得了较好的效果。本发明为“岷归3号”内在质量的评价提供参考，为当归新品种的推广应用奠定基础。

附图说明

图1是料液比对当归总黄酮提取率的影响示意图；

图2是乙醇体积分数对当归总黄酮提取率的影响示意图；

图3是超声提取时间对当归总黄酮提取率的影响示意图；

图4是芦丁吸光度标准曲线；

图5是料液比与乙醇体积分数对总黄酮提取率的交互作用的响应面图；

图6是料液比与乙醇体积分数对总黄酮提取率的交互作用的等高线图；

图7是料液比与提取时间对总黄酮提取率的交互作用的响应面图；

图8是料液比与提取时间对总黄酮提取率的交互作用的等高线图；

图9是乙醇体积分数与提取时间对总黄酮提取率的交互作用的响应面图；

图10是乙醇体积分数与提取时间对总黄酮提取率的交互作用的等高线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。

一种基于响应面法优化当归总黄酮提取工艺参数的方法，本方法所述当归为利用重离子辐照生物育种技术选育出的当归新品种“岷归3号”，为当归Angelica sinensis (Oliv.)Diels的干燥根，其特征在于：它包括以下步骤：

步骤一、药材预处理，称取适量当归药材用水冲洗干净，置于40℃烘箱中烘干至恒重，粉碎，用粒度为60目的筛子筛分后称取2.0g药材粉末；

步骤二、采用超声辅助、乙醇溶液浸提药材中黄酮化合物，以步骤一处理好的当归药材总黄酮提取率为响应值，选择药材与乙醇溶液料液比、乙醇体积分数和提取时间为响应因素，应用中心复合设计的组合实验设计原理设计三因素五水平实验，采用统计软件Design Expert 7.0.0进行多元回归分析，得出实验因素对响应值影响的回归方程为：

式中响应值Y为当归总黄酮提取率，变量参数X₁为料液比、变量参数X₂为乙醇体积分数、变量参数X₃为提取时间，最终确定X₁为1:30g/ml，X₂为80%，X₃为60min，当归总黄酮的提取率为1.0260%；

按照所述的变量参数，称取经步骤一预处理的药材粉末2.0g，药材中加入60ml乙醇溶液，乙醇体积分数为80%，放入超声波清洗仪中，设定超声提取时间60min，超声频率为70Hz，进行超声提取总黄酮，过滤，滤渣连同滤纸用同浓度乙醇溶液再次提取，合并滤液，挥去乙醇得黄色粘稠状物质，以同浓度的乙醇溶液转移到100ml的容量瓶中，定容、干燥；

步骤三、总黄酮提取率的计算，称取步骤二所制备的干燥的总黄酮50mg，用浓度为85%乙醇溶液溶解并定容于100ml容量瓶中；精密吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml分别定容于25ml容量瓶中，各取5ml置于10ml具塞试管中，加5g/100ml亚硝酸钠0.3ml，摇匀放置6min，再加10g/100ml硝酸铝0.3ml，摇匀放置6min，最后加体积浓度为4g/100ml的氢氧化钠4.0ml，加水至刻度线，摇匀放置10min后，在510nm处测其吸光度；以芦丁吸光度标准曲线为对照曲线，测定出药材中总黄酮的提取率为1.0260%。

总黄酮含量按下式计算：

式中，C：总黄酮提取液浓度(ug/mL)；V：提取液总体积(mL)；M：称取药材的质量（g）。

芦丁吸光度标准曲线的制备方法为：

精确称取干燥至质量恒定的芦丁标准品50mg，用浓度为85%乙醇溶液溶解并定容于100ml容量瓶中，精密吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml分别定容于25ml容量瓶中；各取5ml置于10ml具塞试管中，加5g/100ml亚硝酸钠0.3ml，摇匀放置6min，再加10g/100ml硝酸铝0.3ml，摇匀放置6min，最后加4g/100ml氢氧化钠4.0ml，加水至刻度线，摇匀放置10min后，在510nm处测其吸光度，以芦丁标准物质量浓度(C)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制芦丁吸光度标准曲线，如图4所示。

本发明采用超声波辅助提取方法，在单因素实验的基础上通过中心复合设计响应面法建立了提取次数、料液比和提取时间3个影响因素与总黄酮得率响应值之间相互作用的数学模型,具体的操作过程为：

1、单因素考察：

采用超声辅助、乙醇溶液浸提药材中黄酮化合物，其影响因素主要有料液比、所用乙醇溶剂的体积分数以及超声时间等因素。因超声处理过程中温度会自动升高，暂不考虑温度对提取过程的影响。本实验主要考察料液比、乙醇体积分数体积分数、超声处理时间对“岷归3号”总黄酮提取率的影响。

2、响应面实验设计：

在单因素实验的基础上，选取提取时间、乙醇体积分数和料液比为实验因素，“岷归3号”总黄酮提取率为响应值，应用中心复合设计的组合实验设计原理，设计三因素五水平的响应面实验，利用响应面实验结果，确定”岷归3号”总黄酮的最佳提取条件。实验因素与水平设计见表1。

表1

3、单因素实验结果：

（1）料液比对当归总黄酮提取率的影响

称取经过步骤一预处理后的药材粉末2.0000 g，固定乙醇体积分数为85%，超声频率为70Hz，提取时间为60 min，分别以料液比1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35g/ml为实验点，考察不同料液比对药材总黄酮提取率的影响，并绘制出如图2所示的当归总黄酮提取率跟随料液比变化的曲线图。

由图2可知，在其它条件不变情况下，随着料液比的扩大，总黄酮的提取率不断提高，当料液比从1:10g/ml扩大至1:25g/ml时，总黄酮的提取率增加趋势较大，之后增幅逐渐较小。这是由于料液比扩大可增加物料与溶剂的接触面积，使得黄酮类物质更充分地溶解出来，但料液比过大提取率不再增长，而且进一步浓缩会消耗更多的能量和时间，所以确定最佳料液比为1:30g/ml。

（2）乙醇体积分数对当归总黄酮提取率的影响

称取经步骤一预处理后的药材粉末2.0000 g，固定料液比为1:30g/ml，提取频率为70Hz，提取时间为60 min，分别以乙醇体积分数为50%、60%、70%、80%、90%和无水乙醇为实验点，考察乙醇体积分数对药材总黄酮提取率的影响，并绘制出如图2所示的当归总黄酮提取率跟随乙醇体积分数变化的曲线图。

由图3可以看出，在其它条件不变情况下，随着乙醇体积分数的升高，总黄酮提取率先增大后减小，乙醇体积分数在80%时总黄酮的提取率最高，乙醇体积分数大于80%时提取率随浓度的增加而降低。因为乙醇体积分数在80%时，醇溶性和溶性的黄酮类物质都能最大程度的溶出，而乙醇体积分数超过80%时，水溶性黄酮溶出量减少，故总黄酮提取率下降。

（3）超声提取时间对当归总黄酮提取率的影响

称取经步骤一预处理后的药材粉末2.0000g，固定乙醇体积分数为80%，料液比为1:30g/ml，分别以提取时间30、40、50、60、70、80min为实验点，考察不同提取时间对药材总黄酮提取率的影响，并绘制出如图3所示的当归总黄酮提取率跟随超声提取时间变化的曲线图。

有图3可以看出，在其它条件不变情况下，随着提取时间的延长，在30-60 min总黄酮的提取率快速增长，在60-80min之间曲线基本呈水平状态，提取率增加不明显，故选择超声提取时间为60min。

4、响应面设计与结果

在单因素实验基础上，选择料液比、乙醇体积分数和提取时间为影响因素，“岷归3号”总黄酮提取率为响应值，利用统计软件Design Expert 7.0.0 设计三因素五水平实验，结果见表2。

表2

表中：变量参数X₁为当归药材质量与所加入乙醇溶液体积的料液比、变量参数X₂为乙醇体积分数、变量参数X₃为提取时间，

5、响应面分析与优化

实验数据采用统计软件Design Expert 7.0.0进行多元回归分析，得出实验因素对响应值影响的回归方程为：

方程中各项系数绝对值的大小反映了各因素对响应值的影响程度，实验数据响应面方差分析的结果见表 3。

表3

注：“P>F”小于0.0001 表明差异极显著，小于0.01 表明差异较显著，小于0.05 表明差异显著。

表中变量参数X₁为药材质量与乙醇溶液体积的料液比、变量参数X₂为乙醇体积分数、变量参数X₃为提取时间。

由表3可看出，X₁²、X₂²、X₃²对总黄酮提取率的影响极其显著，X₁、X₃、X₁X₃对总黄酮提取率的影响显著，表明方程一次项、二次项的影响是显著的。由表3还可看出，回归方程失拟项小于0.0001，说明未知因素对实验结果干扰小，拟合模型检验较显著（P＜0.01），方程决定系数 R²= 97.36%，说明该方程与实际情况拟合良好，可以用该方程代替真实实验点进行分析。综上所述，该回归方程为优化“岷归3号”总黄酮的提取工艺条件提供了一个良好的模型，可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。

图5至图10是根据回归方程所绘制的响应面图和等高线图，能直观地描述两个因素之间对响应值的交互作用。从图中可以看出，提取时间和料液比交互作用显著，表现为曲线比较陡峭。3个因素对“岷归3号”总黄酮提取率的影响顺序为：X₃>X₁>X₂，即提取时间影响最大，料液比次之，最后为乙醇体积分数。

6、验证实验

根据所得的回归模型，由统计软件Design Expert7.0.0对实验参数进一步优化，得到“岷归3号”中提取总黄酮的最佳条件：提取时间59.71min，乙醇体积分数79.59%，料液比1:32.44g/ml，在此最佳工艺条件下“岷归3号”中总黄酮的提取率为1.0535%，考虑到实际操作的可行性，将提取条件修改为：提取时间60min，乙醇体积分数80%，料液比1:30g/ml，在此条件下进行3次验证实验，按照步骤一至步骤三所述的方法，测得总黄酮提取率的平均值为1.0260%，与理论值相比，其相对误差为0.0275%，说明响应面法对”岷归3号”黄酮提取条件的优化切实可行。

7、结论

本发明采用超声波辅助提取方法，在单因素试验基础上选取对总黄酮提取率影响较大的提取时间、料液比和乙醇体积分数进行考察，通过响应面法建立了总黄酮提取量与三个因素之间关系的二次多项式方程模型，并绘制出三维曲面图，对其综合分析，得出最佳工艺条件：提取时间60min；料液比1:30g/ml；乙醇体积分数80%。本发明利用中心组合试验设计和效应面分析法，借助统计软件Design Expert7.0.0简便、可靠地进行优化试验和数据分析，对“岷归3号”中总黄酮提取的工艺参数进行优化，取得了较好的效果。本发明为“岷归3号”内在质量的评价提供参考，为当归新品种的推广应用奠定基础。

本实验中所用试剂：

芦丁 (中国药品生物制品鉴定所 100080-2003006)；无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司）、亚硝酸钠、氢氧化钠（天津市大茂化学试剂厂）、硝酸铝等（天津市凯信化学工业有限公司），均为分析纯；实验用水为超纯水，由纯水仪制得。

所用材料：

“岷归3号”由定西市农业科学研究院刘效瑞研究员提供，由甘肃中医学院李成义教授鉴定为当归Angelica sinensis (Oliv.)Diels的干燥根。

所用仪器：

KQ－250TDB型高频数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司2005-11-8)；电子天平(北京赛多利斯仪系统有限公司 BS224S)；紫外-可见分光光度计 (Lab Teach.北京莱伯泰科仪器有限公司。Uv Blue Star)；VPH-1-5T型纯水仪(2007-12-7)；DHG-9123电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）。