治疗癌症和预防癌症耐药性的方法与流程

本专利申请要求在2014年6月23日提交的序列号为62/015,932的美国申请的优先权的权益，该申请通过引用并入本文。

领域

本文提供了使用本文所描述的G9a拮抗剂治疗和/或预防癌症耐药性的方法。

背景

对癌症药物的抗性的相对快速获得仍然是成功的癌症治疗的一个主要障碍。大量用来阐明此类耐药性的分子基础的努力已经揭示了多种机制，包括药物外排、靶标的药物结合缺陷型突变体的获得、占用备选的存活途径和外遗传改变。此类机制一般被认为反映了在药物治疗期间选择的肿瘤细胞群体内存在罕见、随机的赋予耐受性的遗传改变。参见Sharma等,Cell 141(l):69-80(2010)。在癌症治疗中观察到的日益增多的现象是所谓的“再治疗应答”。例如，对用EGFR(表皮生长因子受体)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗应答良好且后来经历治疗失败的一些非小细胞肺癌(NSCLC)患者在“药品假期”后表现出对EGFR TKI再治疗的二次应答。参见Kurata等,Ann.Oncol.15:173-174(2004)；Yano等,Oncol.Res.15:107-111(2005)。对几种其它癌症治疗剂良好地建立了类似的再治疗应答。参见Cara和Tannock,Ann.Oncol.12:23-27(2001)。此类发现表明，对癌症药物的获得性抗性可能涉及可逆的“药物耐受”状态，其机理基础仍有待确定。

虽然在表现出获得性耐药性的许多癌症患者中确实已经鉴别出一些赋予抗性的特异性突变，但是突变和非突变机制对耐药性的相对贡献以及肿瘤细胞亚群的作用仍有些不清楚。需要新型治疗方法来成功地解决癌细胞群体内的异质性和耐药物治疗的癌细胞的出现。

概要

本文提供使用G9a拮抗剂(例如)来治疗个体中的癌症和/或预防耐药性的方法。例如，提供了一种治疗个体中的癌症的方法，其包括向该个体单独施用G9a拮抗剂或联合癌症治疗剂施用G9a拮抗剂。在一些实施方案中，个体被选择来使用癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)进行治疗。在一些实施方案中，个体在用癌症治疗剂治疗前开始包括施用G9a拮抗剂的治疗。在一些实施方案中，个体同时接受包括G9a拮抗剂和癌症治疗剂的治疗。在一些实施方案中，G9a拮抗剂增加癌症敏感性时段和/或延迟癌症抗性的产生。

本文还提供使用G9a拮抗剂和癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的联合治疗。

具体来说，本文提供治疗个体中的癌症的方法，其包括向该个体施用(a)G9a拮抗剂和(b)癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)。在一些实施方案中，G9a拮抗剂和癌症治疗剂的各自的量有效增加癌症敏感性时段和/或延迟癌细胞对癌症治疗剂的抗性的产生。在一些实施方案中，G9a拮抗剂和癌症治疗剂的各自的量有效增强包括癌症治疗剂的癌症治疗的功效。例如，在一些实施方案中，与包括施用有效量的癌症治疗剂而不施用(不存在)G9a拮抗剂的治疗(例如，护理治疗标准)相比，G9a拮抗剂和癌症治疗剂的各自的量有效增强功效。在一些实施方案中，与包括施用有效量的癌症治疗剂而不施用(不存在)G9a拮抗剂的治疗(例如，护理治疗标准)相比，G9a拮抗剂和癌症治疗剂的各自的量有效增加应答(例如，完全应答)。

本文还提供了增强包括癌症治疗剂的癌症治疗在个体中的功效的方法，其包括向该个体施用(a)有效量的G9a拮抗剂和(b)有效量的癌症治疗剂。

本文提供治疗个体中的癌症的方法，其中癌症治疗包括向该个体施用(a)有效量的G9a拮抗剂和(b)有效量的癌症治疗剂，其中与包括施用有效量的癌症治疗剂而不施用(不存在)G9a拮抗剂的治疗(例如，护理治疗标准)相比，所述癌症治疗具有增强的功效。

此外，本文提供在个体中延迟和/或预防癌症对癌症治疗剂的抗性的产生的方法，其包括向该个体施用(a)有效量的G9a拮抗剂和(b)有效量的癌症治疗剂。

本文提供治疗具有增加的对癌症治疗剂产生抗性的可能性的癌症个体的方法，其包括向该个体施用(a)有效量的G9a拮抗剂和(b)有效量的癌症治疗剂。

本文还提供了在癌症个体中增加对癌症治疗剂的敏感性的方法，其包括向该个体施用(a)有效量的G9a拮抗剂和(b)有效量的癌症治疗剂。

本文还提供了在癌症个体中延长癌症治疗剂敏感性时段的方法，其包括向该个体施用(a)有效量的G9a拮抗剂和(b)有效量的癌症治疗剂。

本文提供延长癌症个体对癌症治疗剂的应答的持续时间的方法，包括向该个体施用(a)有效量的G9a拮抗剂和(b)有效量的癌症治疗剂。

在任一所述方法的一些实施方案中，癌症治疗剂是靶向治疗。在一些实施方案中，靶向治疗是EGFR拮抗剂、RAF抑制剂和/或PI3K抑制剂中的一个或多个。

在任一所述方法的一些实施方案中，靶向治疗是EGFR拮抗剂。在任一所述方法的一些实施方案中，EGFR拮抗剂是N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺和/或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，EGFR拮抗剂是N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺。在一些实施方案中，EGFR拮抗剂是N-(4-(3-氟苄氧基)-3-氯苯基)-6-(5-((2-(甲基磺酰基)乙氨基)甲基)呋喃-2-基)喹唑啉-4-胺、二4-甲基苯磺酸盐或其药学上可接受的盐(例如，拉帕替尼(lapatinib))。

在任一所述方法的一些实施方案中，靶向治疗是RAF抑制剂。在一些实施方案中，RAF抑制剂是BRAF抑制剂。在一些实施方案中，RAF抑制剂是CRAF抑制剂。在一些实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼(vemurafenib)。在一些实施方案中，RAF抑制剂是3-(2-氰基丙-2-基)-N-(4-甲基-3-(3-甲基-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-6-基氨基)苯基)苯甲酰胺或其药学上可接受的盐(例如，AZ628(CAS号878739-06-1))。

在任一所述方法的一些实施方案中，靶向治疗是PI3K抑制剂。

在任一所述方法的一些实施方案中，癌症治疗剂是化学治疗。在任一所述方法的一些实施方案中，化学治疗是紫杉烷。在一些实施方案中，紫杉烷为紫杉醇(paclitaxel)。在一些实施方案中，紫杉烷为多西他赛。

在任一所述方法的一些实施方案中，化学治疗是铂剂。在一些实施方案中，铂剂是卡铂。在一些实施方案中，铂剂是顺铂。在任一所述方法的一些实施方案中，化学治疗是紫杉烷和铂剂。在一些实施方案中，紫杉烷为紫杉醇。在一些实施方案中，紫杉烷为多西他赛。在一些实施方案中，铂剂是卡铂。在一些实施方案中，铂剂是顺铂。

在任一所述方法的一些实施方案中，化学治疗是长春花生物碱(vinca alkyloid)。在一些实施方案中，长春花生物碱是长春瑞宾。在任一所述方法的一些实施方案中，化学治疗是核苷类似物。在一些实施方案中，核苷类似物是吉西他滨。

在任一所述方法的一些实施方案中，癌症治疗剂是放射治疗。

在任一所述方法的一些实施方案中，G9a拮抗剂是G9a小分子拮抗剂。

可以用于实践某些实施方案的G9a小分子拮抗剂的实例包括式I的化合物、其异构体或异构体混合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。式I化合物，也称为UNC0638，在本文称为G9ai-2，是针对G9a和GLP的强力的、有选择性的和细胞渗透性的化学探针，其以浓度依赖的方式降低H3K9me2的水平。此类化合物以及用于制备此类化合物的方法和中间体在Vedadi等,Nat.Chem.Biol.,7,566-574(2011)和Sweis等,ACS Med.Chem.Lett.,5,205–209(2014)中描述。

在一些实施方案中，该G9a抑制剂是Bix-01294、UNC0321、UNC0646和/或UNC0224(参见Vedadi等,Nat.Chem.Biol.,7,566-574(2011))。Bix-01294在本文中也称为G9ai-2。

在一些实施方案中，G9a抑制剂包括2-(六氢-4-甲基-1H-1,4-二氮杂-1-基)-6,7-二甲氧基-[1-(苯甲基)-4-哌啶基(Piperidynyl)]-4-喹唑啉胺或其盐。在一些实施方案中，G9a抑制剂包括2-(六氢-4-甲基-1H-1,4-二氮杂-1-基)-6,7-二甲氧基-[1-(苯甲基)-4-哌啶基]-4-喹唑啉胺三盐酸化物。在一些实施方案中，G9a抑制剂是7-[3-(二甲基氨基)丙氧基]-2-(六氢-4-甲基-1H-1,4-二氮杂-1-基)-6-甲氧基-N-(1-甲基-4-哌啶基)-4-喹唑啉胺或其盐。

在一些实施方案中，G9a抑制剂是

或其盐。

在一些实施方案中，G9a抑制剂包含

其中R1和R2是以下中的一种或多种(包括任意组合)

在一些实施方案中，G9A抑制剂是万维网网址_sciencedirect.c om/science/article/pii/S0960894X12015399，(Fujishiro等,Bio organic&Medicinal Chemistry Letters,23,733-736(2013))中所述的抑制剂，其全部内容通过引用并入本文。

在任一所述方法的一些实施方案中，G9a拮抗剂与癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)伴随施用。在一些实施方案中，G9a拮抗剂是在癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)之前施用的和/或与该癌症治疗剂同时施用的。

在任一所述方法的一些实施方案中，癌症是肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌和/或黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是肺癌。在一些实施方案中，肺癌是NSCLC。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。

附图简述

图1A-C|(A)组蛋白3(H3)尾部和转译后修饰的氨基酸位置的示意图。G9a/EHMT2是能够甲基化H3的赖氨酸9的甲基转移酶(emethytransferase)。(B)与亲本PC9细胞相比，G9a在人类非小细胞肺癌系PC9耐药性持留细胞(drug tolerant persister，DTP)中均上调。(C)具有3’-UTR-GFP敲除的G9a短发夹的表达示出消除PC9耐药性细胞。

图2A-C|(A)与亲本PC9细胞相比，人非小细胞肺癌系PC9耐药性持留细胞(DTP)中H3甲基化的示意性变化。(B)如West ern印迹和MSD ELISA所示，与PC9亲本细胞相比，PC9DTP中的H3K4me²和me³减少。(C)如Western印迹和MSD ELISA二者所示，与PC9亲本细胞相比，PC9DTP中H3K9me³增加。与PC9亲本细胞相比，PC9DTP中H3K9乙酰化减少。

图3A-B|(A)如Western印迹和质谱所观察的，小分子G9a拮抗剂UNC0638能够抑制H3K9的甲基化。(B)小分子G9a拮抗剂抑制剂自甲基化G9aK185me3。

图4|使用G9A-K185me 0/1/2/3肽下拉质谱数据，通过H3K9或G9aK185甲基化肽下拉CDYL1和LRWD1。

图5|UNC0638(G9ai-2)降低了用特罗凯(Tarceva)处理产生的PC9DTP的活力。

图6|(A)UNC0638(G9ai-2)以剂量依赖性方式减少H3K9甲基化(例如，me1、me2和me3)。(B)G9A抑制剂抑制DTP形成。直方图显示用不同剂量的UNC0638(G9ai-2)预处理后形成的DTP数目的剂量依赖性减少。显示的浓度不影响亲本PC9细胞的活力。

图7|(A-C)UNC0638(G9ai-2)降低了用特罗凯处理产生的PC9DTP的活力。

图8|(A)UNC0638(G9ai-2)在人乳腺癌细胞系EVSA-T中以剂量依赖性方式减少H3K9甲基化(例如me1、me2和me3)。(B)G9A抑制剂在用GDC-0980处理时抑制DTP形成。直方图显示在用不同剂量的UNC0638(G9ai-2)预处理后形成的EVSA-T DTP的数目的剂量依赖性减少。显示的浓度不影响EVSA-T亲本细胞的活力。

图9|(A)UNC0638(G9ai-2)在人乳腺癌癌细胞系SKBR3中以剂量依赖性方式减少H3K9甲基化(例如me1、me2和me3)。(B)G9A抑制剂在用拉帕替尼处理时抑制DTP形成。直方图显示用不同剂量的UNC0638(G9ai-2)预处理后形成的SKBR3DTP的数目的剂量依赖性减少。显示的浓度不影响SKBR3亲本细胞的活力。

图10|(A)UNC0638(G9ai-2)在人黑素瘤癌细胞系M14中以剂量依赖性方式减少H3K9甲基化(例如me1、me2和me3)。(B)G9A抑制剂在用GDC0973处理时抑制DTP形成。直方图显示用不同剂量的UNC0638(G9ai-2)预处理后形成的M14DTP的数目的剂量依赖性减少。显示的浓度不影响M14亲本细胞的活力。

图11|(A)UNC0638(G9ai-2)在人结肠癌细胞系Colo205中以剂量依赖性方式减少H3K9甲基化(例如me1、me2和me3)。(B)G9A抑制剂抑制用AZ628处理时的DTP形成。直方图显示用不同剂量的UNC0638(G9ai-2)预处理后形成的Colo205DTP的数目的剂量依赖性减少。显示的浓度不影响Colo205亲本细胞的活力。

详述

I.定义

受关注多肽的“拮抗剂”(可互换地称为“抑制剂”)是一种干扰受关注多肽的活化或功能例如部分或完全阻断、抑制或中和由受关注多肽介导的生物活性的试剂。例如，多肽X的拮抗剂可以指部分或完全阻断、抑制或中和由多肽X介导的生物活性的任何分子。抑制剂的实例包括抗体；配体抗体；小分子拮抗剂；反义和抑制RNA(例如，shRNA)分子。优选地，该抑制剂是结合受关注多肽的抗体或小分子。在一个特定实施方案中，抑制剂对受关注多肽具有约1,000nM或更小的结合亲和力(离解常数)。在另一个实施方案中，抑制剂对受关注多肽具有约100nM或更小的结合亲和力。在另一个实施方案中，抑制剂对受关注多肽具有约50nM或更小的结合亲和力。在特定实施方案中，抑制剂与受关注多肽共价结合。在特定实施方案中，抑制剂以1,000nM或更小的IC50抑制受关注多肽的信号传导。在另一个实施方案中，抑制剂以500nM或更小的IC50抑制受关注多肽的信号传导。在另一个实施方案中，抑制剂以50nM或更小的IC50抑制受关注多肽的信号传导。在某些实施方案中，拮抗剂降低或抑制受关注多肽的表达水平或生物活性达至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，受关注多肽是G9a。除非另外说明，否则本文所使用的术语“多肽”是指来自任何脊椎动物来源的任何受关注天然多肽，该脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如，人类)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”未加工的多肽以及通过在细胞中处理所得到的任何形式的多肽。该术语还包括多肽的天然生成的变体，例如剪接变体或等位基因变体。

如本文中可互换使用的"多核苷酸"或"核酸"是指任意长度的核苷酸聚合物，且包含DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和其类似物。如果存在，可以在组装聚合物之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后被进一步修饰，诸如通过与标记物缀合。其它类型的修饰包括例如“帽子”、用类似物替代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷键接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)和具有带电荷键接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰、含有侧链部分诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具有修饰键接(例如α异头核酸等)的修饰以及未修饰形式的多核苷酸。此外，一般存在于糖类中的任何羟基可以被例如膦酸酯基团、磷酸酯基团置换，被标准保护基团保护，或被活化以制备与其它核苷酸的额外连接，或可以与固体或半固体支持物缀合。5′和3′末端OH可以被磷酸化或被胺或具有1至20个碳原子的有机加帽基团部分取代。其它羟基也可以被衍生为标准保护基团。多核苷酸还可以包含本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟-或2’-叠氮-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构体糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚糖、无环类似物和无碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键可以被备选连接基团替换。这些备选连接基团包括但不限于其中磷酸酯被P(O)S("硫代酸酯")、P(S)S("二硫代酸酯")、"(O)NR₂("酰胺酯")、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH₂("甲缩醛")替换的实施方案，其中每个R或R′独立地为H或被取代或未被取代的烷基(1-20个C)，其任选包含醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烃基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有键都必需是相同的。以上描述适用于本文中涉及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

术语"小分子"是指分子量为约2000道尔顿或更小，优选约500道尔顿或更小的任何分子。

“分离的”抗体是一种从其天然环境的组分中分离出的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳法(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相HPLC)所测定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。

术语“抗体”在本文中以最广泛的意义来使用，且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性即可。

术语抗受关注多肽的抗体和“结合受关注多肽的抗体”是指可以足够亲和力结合受关注多肽，使得该抗体可用作靶向受关注多肽的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中，抗受关注多肽的抗体与无关的非受关注多肽蛋白的结合程度是该抗体结合至受关注多肽的约10％，例如通过放射免疫分析(RIA)而测定。在某些实施方案中，结合至受关注多肽的抗体的离解常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10^-8M或更小，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)。在某些实施方案中，抗受关注多肽的抗体结合至受关注多肽的表位，该表位在来自不同物种的受关注多肽间是保守的。在一些实施方案中，受关注多肽是G9a。

“阻断性抗体”或“拮抗性抗体”是一种抑制或降低其所结合抗原的生物活性的抗体。优选阻断性抗体或拮抗性抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。

“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与它的结合配偶体(例如，抗原)间的非共价相互作用的总和的强度。如本文所使用，除非另有指示，否则“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如，抗体和抗原)间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可以通过离解常数(Kd)表示。可以通过本领域已知的常用方法测量亲和力，包括那些本文中所述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。

“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体中结合该完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

作为参考抗体的“结合至相同表位的抗体”是指在竞争分析中使参考抗体与其抗原的结合受阻断50％或更多的抗体，且反过来，在竞争分析中，参考抗体使所述抗体与其抗原的结合受阻断50％或更多。

术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分是源自特定来源或物种，而所述重链和/或轻链的剩余部分是源自不同来源或物种的抗体。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完全抗体”在本文中可互换使用，是指具有实质上类似于天然抗体结构的结构或具有含Fc区的重链的抗体。

如本文所使用的术语“单克隆抗体”是指得自实质上均质抗体群体的抗体，即，除可能的变异抗体(例如含天然存在的突变或在单克隆抗体制剂生产期间产生的抗体，此类变体通常是少量存在)之外，构成该群体的单个抗体是相同的和/或结合相同表位。与通常包含针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂的各单克隆抗体是针对抗原上的单一决定子。因此，修饰语“单克隆”指示得自实质上均质抗体群体的抗体的特性，且不应视为要求通过任何特定方法生产该抗体。例如，按照本发明待使用的单克隆抗体可以通过各种技术而制备，所述技术包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法和利用含所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，此类方法和用于制备单克隆抗体的其它示例性方法。

“人抗体”是一种具有对应于由人类或人类细胞生产或者源自利用人抗体谱系或其它人抗体编码序列的非人类来源的抗体的氨基酸序列的抗体。该个人抗体的定义特别排除包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。

“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个并且通常两个可变结构域的实质上全部，其中全部或实质上全部HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的HVR，且全部或实质上全部FR对应于人抗体的FR。人源化抗体可以任选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。例如非人抗体的抗体的“人源化”形式是指已经经历人源化的抗体。

如本文所使用，术语“靶向治疗”是指结合至受关注多肽并抑制特定受关注多肽的活性和/或活化的治疗剂。此类药剂的实例包括结合至受关注多肽的抗体和小分子。

“化学治疗”是指可用于治疗癌症的化合物。化学治疗的实例包括烷基化剂，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺烷基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(p iposulfan)；氮丙啶，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboqu one)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(t riethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramid e)、三亚乙基硫化磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲基蜜胺(trimethylomelamine)；多聚乙酰(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)及布拉它辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)，)；β-拉帕醌；拉帕醇(lapac hol)；秋水仙碱；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan)CPT-11(依立替康(irinote can)、)、乙酰基喜树碱、东莨菪亭(scopolectin)及9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；凯利斯他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)及比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；足叶草酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；念珠藻素(c ryptophycin)(特别是念珠藻素1及念珠藻素8)；多拉司他汀(dolas tatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189及CB1-TM1)；五加苷素(eleutherobin)；潘卡他汀(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥(nitrog en mustards)，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlomaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifos famide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofo sfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosoureas)，诸如亚硝基脲氮芥(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemusti ne)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ran imnustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如，卡里奇霉素(calic heamicin)，尤其是卡里奇霉素γ1I和卡里奇霉素ωI1(参见例如N icolaou等,Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；CDP323,一种口服的α-4整合素抑制剂；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neoc arzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(c arabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红菌素(daun orubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(doxorubicin)(包括吗啉代阿霉素、氰基吗啉代阿霉素、2-吡咯啉基-阿霉素、盐酸阿霉素脂质体注射剂脂质体阿霉素TLC D-99聚乙二醇化脂质体阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esor ubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(诸如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromyc in)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubici n)；抗代谢药，诸如氨甲蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)替加氟(tegafur)卡培他滨(capecitabine)埃博霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如环胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷(azac itidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氟氧尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素，诸如二甲睾酮(calusterone)、丙酸甲雄烷酮(dromostanolon e propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺，诸如氨鲁米特(aminoglutethim ide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosp hamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(biasntrene)；依达曲沙(edatraxate)；地佛法明(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elforni thine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素；依托格鲁(e toglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lon idainine)；美登木素(maytansinoid)，诸如美登素(maytansine)及安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mito xantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；硝呋旦(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razo xane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirog ermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2’,2’-三氯三乙胺(trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯(trichothecene)(尤其是T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)()；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；紫杉烷，例如紫杉醇紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(ABRAXANE^TM)和多西他赛苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲蝶呤；铂剂，诸如顺铂、奥沙利铂(例如，)和卡铂；长春碱(vincas)，其防止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱(vinblastine)长春新碱(vincristine)长春地辛和长春瑞宾(vinorelbin e)依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；甲酰四氢叶酸(leucovorin)；诺消灵(novantrone)；依达曲沙(edatrexa te)；柔红霉素(daunomycin)；氨喋呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视色素(retinoid)，诸如视黄酸，包括蓓萨罗丁(bexarotene)二膦酸盐，诸如氯膦酸盐(例如，或)、依替膦酸盐(etidronate)NE-58095、唑来膦酸(zoled ronic acid)/唑来膦酸盐(zoledronate)阿仑膦酸盐(alendronate)帕米膦酸盐(pamidronate)替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)曲沙他滨(troxacitabine)(一种1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；和上述任一个的药学上可接受的盐、酸或衍生物；和上述两个或更多个的组合，诸如CHOP，即环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松龙的联合治疗的缩写；和FOLFOX(使用奥沙利铂(ELOXATIN^TM)与5-FU和甲酰四氢叶酸组合进行的治疗方案的缩写)。

如本文所使用，术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。该术语意在包括放射性同位素(例如，At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素)、化学治疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤、亚德里亚霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、阿霉素、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红菌素或其它插入剂)、生长抑制剂、酶和其片段(诸如核分解酶)、抗生素和毒素(诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物源性酶促活性毒素，包括其片段和/或变异体)和下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。下文描述其它细胞毒性剂。杀肿瘤剂导致肿瘤细胞受到破坏。

“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子缀合的抗体，该异源分子包括但不限于细胞毒性剂。

“个体应答”或“应答”可利用任何指示对个体的益处的终点进行评估，包括但不限于：(1)在一定程度上抑制疾病进展(例如癌症进展)，包括减慢及完全阻止；(2)减小肿瘤大小；(3)抑制(即减少、减慢或完全阻止)癌细胞浸润至邻近外周器官和/或组织中；(4)抑制(即减少、减慢或完全阻止)转移；(5)一定程度上减轻一种或多种与疾病或病症(例如，癌症)相关的症状；(6)增加无进展生存期长度；和/或(7)降低治疗后给定时间点的死亡率。

如本文所使用，术语“基本上相同”表示两个数值间的相似程度足够高，使得本领域技术人员将认为所述两个值间的差异在由所述值衡量的生物特性(例如，Kd值或表达)范畴内具有极小或不具有生物和/或统计显著性。作为参考/比较值的函数，所述两个值间的差异为(例如)小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％及/或小于约10％。

如本文所使用，短语“基本上不同”表示两个数值间的差异程度足够高，使得本领域技术人员将认为所述两个值间的差异在由所述值衡量的生物特性(例如，Kd值)范畴内具有统计显著性。作为参考/比较分子的值的函数，所述两个值间的差异为例如大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％及/或大于约50％。

物质/分子(例如，药物组合物)的“有效量”是指在各种剂量下并且持续必要时间段，有效实现期望治疗或预防结果的量。

物质/分子的“治疗有效量”可以根据以下因素而变化，诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量、以及所述物质/分子在个体内引起期望应答的能力。治疗有效量还是物质/分子的治疗有益效果超过其任何毒性或有害效果的量。“预防有效量”是指在各种剂量下并且持续必要时间段，有效实现期望预防结果的量。通常但不一定地，因为预防剂量是在疾病之前或疾病早期用于受试者中，所以预防有效量将小于治疗有效量。

术语“药物制剂”是指以允许其中所含活性成分的生物活性有效的形式，且不含对将施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的其它组分的制剂。

“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外的对受试者无毒性的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

如本文所使用，短语“药学上可接受的盐”是指化合物的药学上可接受的有机盐或无机盐。

如本文所使用，“治疗(treatment)”(及其语法变化形式，诸如治疗(treat)或治疗(treating))是指试图改变接受治疗的个体的天然病程，且可为实现预防或临床病变的过程期间中进行的临床介入。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病发生或复发、缓和症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态和缓解或改善预后。在一些实施方案中，使用本发明抗体来延迟疾病产生或减缓疾病进展。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如，奶牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人类和非人类灵长类动物，诸如猴)、兔和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人类。

本文中使用的术语“伴随地”是指施用两种或更多种治疗剂，该治疗剂是在时间上足够接近地给予，它们各自的治疗效果在时间上重叠。因此，同时施用包括中止施用一种或多种其它药剂后继续施用一种或多种药剂的给药方案。在一些实施方案中，伴随施用是并行、依序和/或同时施用。

所谓“减少或抑制”意指导致总体下降20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的能力。减少或抑制可以指所治疗的病症的症状、转移的存在或大小、或原发性肿瘤的大小。

术语“包装说明书”是用于指通常包括在治疗产品商业包装内的使用说明，该使用说明包含关于适应症、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌症和/或关于此类治疗产品的用途的警告的信息。

“制品”是包含至少一种药剂例如用于治疗疾病或病症(例如癌症)的药物或用于具体检测本文所描述的生物标记物的探针的任何制造物(例如，包装或容器)或试剂盒。在某些实施方案中，该制造物或试剂盒作为执行本文所述方法的单元推广、分配或销售。

如本领域技术人员所理解的，本文中提到“约”某一值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。例如，关于“约X”的描述包括描述“X”。

应该理解，本文所描述的本发明的方面和实施方案包括“由方面和实施方案组成”和/或“基本上由方面和实施方案组成”。如本文所使用，除非另有指示，否则单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该/所述(the)”包括复数形式。

II.方法和用途

本文提供使用G9a拮抗剂例如来治疗癌症和/或预防耐药性的方法(例如,以单一试剂和/或联合治疗方式)。例如，一种治疗个体中的癌症的方法包括向该个体单独施用或联合癌症治疗剂施用G9a拮抗剂。在一些实施方案中，个体被选择来使用癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)进行治疗。在一些实施方案中，个体在用癌症治疗剂治疗前开始包括施用G9a拮抗剂的治疗。在一些实施方案中，个体同时接受包括G9a拮抗剂和癌症治疗剂的治疗。在一些实施方案中，G9a拮抗剂增加癌症敏感性时段和/或延迟癌症抗性的产生。

本文还提供了利用G9a拮抗剂和癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的方法。

具体来说，本文提供治疗个体中的癌症的方法，包括向该个体施用(a)G9a拮抗剂和(b)癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)。在一些实施方案中，G9a拮抗剂和癌症治疗剂的各自的量有效增加癌症敏感性时段和/或延迟细胞对癌症治疗剂的抗性的产生。在一些实施方案中，G9a拮抗剂和癌症治疗剂的各自的量有效增强包括癌症治疗剂的癌症治疗的功效。例如，在一些实施方案中，与包括施用有效量的癌症治疗剂而不施用(不存在)G9a拮抗剂的治疗(例如，护理治疗标准)相比，G9a拮抗剂和癌症治疗剂的各自的量有效增强功效。在一些实施方案中，与包括施用有效量的癌症治疗剂而不施用(不存在)G9a拮抗剂的治疗(例如，护理治疗标准)相比，G9a拮抗剂和癌症治疗剂的各自的量有效增加应答(例如，完全应答)。在一些实施方案中，G9a拮抗剂和癌症治疗剂伴随施用。在一些实施方案中，癌症治疗剂是靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗。在一些实施方案中，靶向治疗和/或化学治疗是EGFR拮抗剂、RAF抑制剂、PI3K抑制剂、紫杉烷和铂剂中的一种或多种。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)RAF抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)PI3K抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂、(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)和(c)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，紫杉烷为紫杉醇。

本文另外提供增强包括癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的癌症治疗在个体中的功效的方法，包括向该个体施用(a)有效量的G9a拮抗剂和(b)有效量的癌症治疗剂。在一些实施方案中，G9a拮抗剂和癌症治疗剂伴随施用。在一些实施方案中，癌症治疗剂是靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗。在一些实施方案中，靶向治疗和/或化学治疗是EGFR拮抗剂、RAF抑制剂、PI3K抑制剂、紫杉烷和铂剂中的一种或多种。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)RAF抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)PI3K抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂、(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)和(c)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，紫杉烷为紫杉醇。

本文提供治疗个体中的癌症的方法，其中癌症治疗包括向该个体施用(a)有效量的G9a拮抗剂和(b)有效量的癌症治疗剂(例如,靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)，其中与包括施用有效量的癌症治疗剂而不施用(不存在)G9a拮抗剂的治疗(例如，护理治疗标准)相比，所述癌症治疗具有增强的功效。在一些实施方案中，G9a拮抗剂和癌症治疗剂伴随施用。在一些实施方案中，癌症治疗剂是靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗。在一些实施方案中，靶向治疗和/或化学治疗是EGFR拮抗剂、RAF抑制剂、PI3K抑制剂、紫杉烷和铂剂中的一种或多种。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)RAF抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)PI3K抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂、(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)和(c)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，紫杉烷为紫杉醇。

另外，本文提供在个体中延迟和/或预防癌症对癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的抗性的产生的方法，包括向该个体施用(a)有效量的G9a拮抗剂和(b)有效量的癌症治疗剂。在一些实施方案中，G9a拮抗剂和癌症治疗剂伴随施用。在一些实施方案中，癌症治疗剂是靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗。在一些实施方案中，靶向治疗和/或化学治疗是EGFR拮抗剂、RAF抑制剂、PI3K抑制剂、紫杉烷和铂剂中的一种或多种。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)RAF抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)PI3K抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂、(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)和(c)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，紫杉烷为紫杉醇。

本文提供治疗具有增加的对癌症治疗剂(例如,靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)产生抗性的可能性的癌症个体的方法，包括向该个体施用(a)有效量的G9a拮抗剂和(b)有效量的癌症治疗剂。在一些实施方案中，G9a拮抗剂和癌症治疗剂伴随施用。在一些实施方案中，癌症治疗剂是靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗。在一些实施方案中，靶向治疗和/或化学治疗是EGFR拮抗剂、RAF抑制剂、PI3K抑制剂、紫杉烷和铂剂中的一种或多种。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)RAF抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)PI3K抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂、(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)和(c)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，紫杉烷为紫杉醇。

本文另外提供在癌症个体中增加对癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的敏感性的方法，包括向该个体施用(a)有效量的G9a拮抗剂和(b)有效量的癌症治疗剂。在一些实施方案中，G9a拮抗剂和癌症治疗剂伴随施用。在一些实施方案中，癌症治疗剂是靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗。在一些实施方案中，靶向治疗和/或化学治疗是EGFR拮抗剂、RAF抑制剂、PI3K抑制剂、紫杉烷和铂剂中的一种或多种。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)RAF抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)PI3K抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂、(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)和(c)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，紫杉烷为紫杉醇。

另外，本文另外提供在癌症个体中延长癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)敏感性时段的方法，包括向该个体施用(a)有效量的G9a拮抗剂和(b)有效量的癌症治疗剂。在一些实施方案中，G9a拮抗剂和癌症治疗剂伴随施用。在一些实施方案中，癌症治疗剂是靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗。在一些实施方案中，靶向治疗和/或化学治疗是EGFR拮抗剂、RAF抑制剂、PI3K抑制剂、紫杉烷和铂剂中的一种或多种。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)RAF抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)PI3K抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂、(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)和(c)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，紫杉烷为紫杉醇。

本文还提供延长癌症个体对癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的响应的持续时间的方法，包括向该个体施用(a)有效量的G9a拮抗剂和(b)有效量的癌症治疗剂。在一些实施方案中，G9a拮抗剂和癌症治疗剂伴随施用。在一些实施方案中，癌症治疗剂是靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗。在一些实施方案中，靶向治疗和/或化学治疗是EGFR拮抗剂、RAF抑制剂、PI3K抑制剂、紫杉烷和铂剂中的一种或多种。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)RAF抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)PI3K抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂、(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)和(c)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，紫杉烷为紫杉醇。

除了提供改善的癌症治疗外，施用本文所描述的某些组合相比于接受不同治疗的相同患者所经历的生存质量可以改善该患者的生存质量。例如，与相同患者如果仅接受癌症治疗剂作为治疗将经历的生存质量相比，向个体施用如本文所描述的G9a拮抗剂和癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的组合可以提供改善的生存质量。例如，具有本文所描述的组合的联合治疗可以降低所需的癌症治疗剂剂量，从而减少与治疗剂有关的副作用(例如恶心、呕吐、脱发、皮疹、食欲减退、体重减轻等)。该组合还可以降低肿瘤负荷和减少相关不良事件诸如疼痛、器官功能障碍、体重减轻等。因此，一个方面提供用于治疗用途的G9a拮抗剂，用于改善用癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)治疗癌症的患者的生存质量。在一些实施方案中，G9a拮抗剂和癌症治疗剂伴随施用。在一些实施方案中，癌症治疗剂是靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗。在一些实施方案中，靶向治疗和/或化学治疗是EGFR拮抗剂、RAF抑制剂、PI3K抑制剂、紫杉烷和铂剂中的一种或多种。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)RAF抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)PI3K抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂、(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)和(c)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，紫杉烷为紫杉醇。

在任一所述方法的一些实施方案中，G9a拮抗剂的来源是天然或合成。在任一所述方法的一些实施方案中，G9a拮抗剂是抗体、结合多肽、结合小分子或多核苷酸。

在任一所述方法的一些实施方案中，癌症治疗剂是靶向治疗。在任一所述方法的一些实施方案中，癌症治疗剂是化学治疗。在任一所述方法的一些实施方案中，癌症治疗剂是放射治疗。

对本文所使用的治疗具有抗性的癌症包括对治疗无应答和/或对治疗产生明显应答(例如，部分应答和/或完全应答)的能力降低的癌症。抗性可以是出现在治疗方法的过程中的获得性抗性。在一些实施方案中，获得性耐药性是短暂和/或可逆的耐药性。对治疗的短暂和/或可逆的耐药性包括其中耐药性可以在治疗方法中断后恢复对治疗的敏感性。在一些实施方案中，获得性抗性是永久抗性。对治疗的永久抗性包括赋予耐药性的遗传变化。

对本文所使用的治疗具有敏感性的癌症包括有应答和/或能够产生明显应答(例如，部分应答和/或完全应答)的癌症。

测定或评估对治疗的抗性获得和/或敏感性维持的方法是本领域中已知的且描述在实施例中。可以通过(a)将参照癌细胞或细胞群体在存在和/或缺少G9a拮抗剂下暴露于癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)和/或(b)分析例如癌细胞生长、细胞活力、细胞凋亡水平和/或百分比、组蛋白3赖氨酸9(H3K9)甲基化状态(例如，单甲基化、二甲基化和/或三甲基化)和/或应答中的一种或多种来测定耐药性和/或敏感性。

可以随时间推移和/或在各种浓度的癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)和/或G9a拮抗剂量下测量耐药性和/或敏感性。还可以测量耐药性和/或敏感性和/或与参照细胞系(例如，PC9和/或H1299)包括该细胞系的亲本细胞、耐药性持留细胞和/或耐药性扩增持留细胞进行比较。在一些实施方案中，可以通过CyQuant直接细胞增殖分析来分析细胞活力。可以通过如实施例和Sharma等所述分析耐药性持留细胞的生长来评估抗性获得和/或敏感性维持的变化诸如耐药性。可以通过如实施例和Sharma等所描述分析耐药性扩增持留细胞的生长来评估抗性获得和/或敏感性维持的变化诸如永久抗性和/或扩增的抵抗细胞。在一些实施方案中，抗性可以由IC₅₀、EC₅₀或耐药性持留细胞和/或耐药性扩增持留细胞的肿瘤生长减少的变化来指示。在一些实施方案中，该变化大于约50％、100％和/或200％中的任一个。另外，可以在体内例如通过评估对治疗的应答、应答持续时间和/或疾病进展时间(例如，部分应答和完全应答)评估抗性获得和/或敏感性维持的变化。抗性获得和/或敏感性维持的变化可以基于在个体的群体中对治疗的应答、应答持续时间和/或疾病进展时间(例如，部分应答和完全应答的数量)的变化。

在任一所述方法的一些实施方案中，癌症是实体瘤癌。在一些实施方案中，癌症是肺癌、乳腺癌、结直肠癌、结肠癌、黑素瘤和/或胰腺癌。在一些实施方案中，癌症是肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC))。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，癌症具有高水平的H3K9三甲基化。在一些实施方案中，癌症具有高水平的H3K9二甲基化。在一些实施方案中，癌症具有高水平的H3K9单甲基化。在一些实施方案中，癌症处于产生增加的H3K9三甲基化水平的风险中。在一些实施方案中，癌症处于产生增加的H3K9二甲基化水平的风险中。在一些实施方案中，癌症处于产生增加水平的H3K9单甲基化的风险中。

本文所描述的任何联合治疗方法中的癌症当开始包括G9a拮抗剂和癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的治疗方法时可以对仅包括癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的治疗方法敏感(敏感的实例包括但不限于应答和/或能够产生显著应答(例如，部分应答和/或完全应答))。本文所描述的任何联合治疗方法中的癌症当开始包括G9a拮抗剂和癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的治疗方法时可以对仅包括癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的治疗方法无抗性(抗性的实例包括但不限于不应答和/或产生显著应答(例如，部分应答和/或完全应答)的能力降低和/或无法产生显著应答)。

在任一所述方法的一些实施方案中，根据任何以上实施方案的个体可以是人类。

在任一所述方法的一些实施方案中，可以伴随施用联合治疗。在任一所述方法的一些实施方案中，联合治疗可以包括组合施用(其中两种或更多种治疗剂被包含在相同或不同制剂中)和分开施用，在分开施用的情况下，G9a拮抗剂和癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的施用可以在施用额外的治疗剂和/或辅助剂之前、同时、依序、共同和/或之后进行。在一些实施方案中，G9a拮抗剂是在癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)之前施用的和/或与该癌症治疗剂同时施用的。在一些实施方案中，联合治疗进一步包括放射治疗和/或额外的治疗剂。

在任一所述方法的一些实施方案中，G9a拮抗剂和癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)可以通过任何合适的方式来施用，包括口服、肠胃外、肺内和鼻内施用以及如果期望用于局部治疗，病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径，例如，通过注射如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂还是长期的。本文预期了各种给药时间表，包括但不限于在不同时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。

在任一所述方法的一些实施方案中，本文所描述的G9a拮抗剂(例如，抗体、结合多肽和/或结合小分子)和癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)可以按照与良好医疗实践一致的方式来配制、给药和施用。在此情况下的考虑因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的起因、药剂的递送部位、施用方法、施药时间表和医疗从业人员已知的其它因素。G9a拮抗剂和癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)不一定，但任选地与目前用于预防或治疗所讨论的病症的一种或多种药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于G9a拮抗剂和癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)在制剂中的存在量、病症或治疗的类型和上述其它因素。这些药剂通常以相同的剂量和如本文所描述的施用途径，或本文所描述的剂量的约1至99％，或者以任何剂量和通过在经验/临床上被确定为适当的任何途径来使用。

对于疾病的预防或治疗而言，本文所描述的G9a拮抗剂和癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)(当单独或与一种或多种其它额外的治疗剂联合使用时)的适当剂量将取决于待治疗的疾病类型、疾病的严重度和病程、是否施用了G9a拮抗剂和癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)用于预防或治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对G9a拮抗剂和癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的应答以及主治医师的判断。将G9a拮抗剂和癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)适当地一次或历经一系列治疗施用给患者。对于持续数天或更长的重复施用，根据状况，治疗一般会持续至出现对疾病症状的所需抑制。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周一次(例如，以使得患者接受约2至约20个例如约6个剂量的G9a拮抗剂和癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗))。可以首先施用较高的负荷剂量，然后施用一个或多个较低剂量。示例性给药方案包括施用。然而，可以使用其它给药方案。这种疗法的进展容易通过常规技术和分析来监测。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)RAF抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)PI3K抑制剂。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂和(b)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。在一些实施方案中，联合治疗包括(a)G9a拮抗剂、(b)紫杉烷(例如，紫杉醇)和(c)铂剂(例如，卡铂或顺铂)。

应当理解，任何以上制剂或治疗方法可以使用免疫缀合物作为G9a和/或癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)来实施。

III.治疗组合物

本文提供用于本文所描述的方法的组合，其包括G9a拮抗剂和癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)。在某些实施方案中，所述组合增强单独施用的癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的功效。在某些实施方案中，所述组合延迟和/或预防癌症对癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的抗性的产生。在某些实施方案中，所述组合延长癌症个体中的癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)敏感性时段。在一些实施方案中，G9a拮抗剂和/或癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)(例如，EGFR拮抗剂、PI3K拮抗剂和/或RAF抑制剂)是抗体、结合多肽、结合小分子和/或多核苷酸。G9A是组蛋白甲基转移酶，其特异性地单独和二甲基化常染色质中组蛋白H3的'Lys-9'(分别为H3K9me1和H3K9me2)。H3K9me代表通过募集HP-1蛋白质到甲基化组蛋白的表观遗传转录抑制的特异性标签。G9a还可以在异染色质中起作用，介导Lamin相关结构域的募集和/或启动DNA甲基化。

在任何G9a拮抗剂的一些实施方案中，G9a拮抗剂具有优于(例如，小于)约4μM、2μM、1μM、500nM、250nM、200nM、150nM、100nM、75nM、50nM和/或30nM中的任一个的G9a IC50。测定化合物的G9a IC50的方法是本领域中已知的。

在任何G9a拮抗剂的一些实施方案中，G9a拮抗剂具有大于约5μM、7.5μM、10μM、15μM和/或20μM中的任一个的IC50。

在任何G9a拮抗剂的一些实施方案中，G9a拮抗剂具有优于(例如小于)约25μM、15μM、10μM、7.5μM、5μM、4μM、3.5μM、3μM、2.5μM、2μM和/或1μM中的任一个的H3K9me(例如，me¹、me²和/或me³)EC50。测定化合物的H3K9me EC50的方法是本领域中已知的(参见Sayegh等JBC Manuscript M112.419861(2013)(可在万维网网址jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.M112.419861处获得)和Kristensen等FEBS J.279:1905-1914(2012)，在此通过引用整体并入)且在本文中描述。

通过从在底物肽存在下的转化百分比减去在缺少肽下的转化百分比来计算肽依赖性转化百分比。使用给定抑制剂浓度下的肽依赖性转化百分比来计算抑制百分比和IC50。使用GraFit软件(Erithacus Software Ltd.,Surrey UK)进行每种抑制剂的IC₅₀值计算。

本文还提供了可用于本文所描述的方法的EGFR拮抗剂。EGFR意指在Ullrich等，Nature(1984)309:418425中所描述的受体酪氨酸激酶多肽表皮生长因子受体，或者被称为Her-1和c-erbB基因产物；以及其变体例如EGFRvIII。EGFR的变体还包括缺失、替代和插入变体，例如在Lynch等(NEJM 2004,350:2129)、Paez等(Science2004,304:1497)、Pao等(PNAS 2004,101:13306)中描述的那些。在一些实施方案中，EGFR是野生型EGFR，其通常指包含天然存在的EGFR蛋白质的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，EGFR拮抗剂是抗体、结合多肽、结合小分子和/或多核苷酸。

示例性EGFR拮抗剂(抗EGFR抗体)包括抗体诸如称为尼妥珠单抗(nimotuzumab，YM Biosciences)的人源化单克隆抗体、完整人ABX-EGF(帕尼单抗(panitumumab),Abgenix Inc.)以及称为E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3和E7.6.3并描述在US 6,235,883中的完整人抗体；MDX-447(Medarex Inc)。帕妥珠单抗(2C4)是人源化抗体，其直接结合至HER2，但是干扰HER2-EGFR二聚化，从而抑制EGFR信号传导。结合至EGFR的抗体的其它实例包括GA201(RG7160；Roche Glycart AG)、MAb 579(ATCC CRL HB 8506)、MAb 455(AT CC CRL HB8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见美国专利号4,943,533，Mendelsohn等)和其变体诸如嵌合225(C225或西妥昔单抗(Cetuximab；)和重塑人225(H225)(参见WO 96/40210,Imclone Systems Inc.)；IMC-11F8，一种完整人EGFR靶向抗体(Imclone)；结合II型突变EGFR的抗体(美国专利号5,212,290)；如美国专利号5,891,996中所描述的结合EGFR的人源化和嵌合抗体；和结合EGFR的人抗体诸如ABX-EGF(参见WO98/50433，Abgenix)；EMD55900(Stragliotto等Eur.J.Cancer 32A:636-640(1996))；EMD7200(马妥珠单抗)，一种针对EGFR的人源化EGF R抗体，其与EGF和TGF-α竞争EGFR结合；和mAb806或人源化mA b806(Johns等,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))。抗EGF R抗体可以与细胞毒性剂缀合，从而生成免疫缀合物(参见例如EP659,439A2，Merck Patent GmbH)。在一些实施方案中，抗EGFR抗体是西妥昔单抗。在一些实施方案中，抗EGFR抗体是帕尼单抗。在一些实施方案中，抗EGFR抗体是扎妥木单抗(zalutumumab)、尼妥珠单抗和/或马妥珠单抗。

可用于所述方法的抗EGFR抗体包括以足够的亲和力和特异性结合至EGFR且可以降低或抑制EGFR活性的任何抗体。所选抗体对EGFR通常将具有足够强的结合亲和力，例如，该抗体可以100nM-1pM之间的Kd值结合人c-met。抗体亲和力可以通过例如基于表面等离振子共振的分析(诸如PCT申请公开号WO2005/012359中所描述的BIAcore分析)、酶联免疫吸附分析(ELISA)和竞争分析(例如，RIA’s)来测定。优选地，本发明的抗EGFR抗体可以用作靶向和干扰其中涉及EGFR/EGFR配体活性的疾病或病症的治疗剂。另外，可以对该抗体进行其它生物活性分析，例如以评价其作为治疗剂的效力。此类分析是本领域中已知的且取决于抗体的目标抗原和预期用途。在一些实施方案中，EGFR臂可以与结合至白细胞上的触发分子诸如T-细胞受体分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)(诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))的臂组合，以便将细胞防御机制集中于EGFR表达细胞上。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂定位于表达EGFR的细胞。这些抗体具有EGFR结合臂和结合细胞毒性剂(例如皂草素、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒素A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可以制备成全长抗体抗体或抗体片段(例如F(ab’)₂双特异性抗体)。

示例性EGFR拮抗剂还包括结合小分子，诸如在US5616582、US5457105、US5475001、US5654307、US5679683、US6084095、US6265410、US6455534、US6521620、US6596726、US6713484、US5770599、US6140332、US5866572、US6399602、US6344459、US6602863、US6391874、WO9814451、WO9850038、WO9909016、WO9924037、WO9935146、WO0132651、US6344455、US5760041、US6002008和/或US5747498中描述的化合物。特定结合小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774，埃罗替尼(erlotinib)，OSI Pharmaceuticals)；PD 183805(CI1033，2-丙烯酰胺(2-propenamide)、N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二盐酸盐，Pfizer Inc.)；(ZD1839，吉非替尼(gefitinib)，AstraZeneca)；ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(l-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺，Boehringer Ingelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(l-苯乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(l-苯乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲氨基)-2-丁烯酰胺)；拉帕替尼(lapatinib)(Tykerb，GlaxoSmithKline)；ZD6474(Zactima，AstraZeneca)；CUDC-101(Curis)；卡奈替尼(canerti nib)(CI-1033)；AEE788(6-[4-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]苯基]-N-[(1R)-1-苯乙基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺，WO2003013541，No vartis)和PKI166(4-[4-[[(1R)-1-苯乙基]氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚，WO9702266，Novartis)。在一些实施方案中，EG FR拮抗剂是N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺和/或其药物可接受盐(例如，N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺-HCl)。在一些实施方案中，EGFR拮抗剂是吉非替尼和/或其药物上可接受的盐。在一些实施方案中，EGFR拮抗剂是拉帕替尼和/或其药物上可接受的盐。在一些实施方案中，EGFR拮抗剂是吉非替尼和/或埃罗替尼。

在一些实施方案中，EGFR拮抗剂可以是EGFR的特异性抑制剂。在一些实施方案中，该抑制剂可以是双重抑制剂或泛抑制剂，其中EGFR拮抗剂抑制EGFR和一种或多种靶多肽。

磷酸肌醇3-激酶(PI3K)属于脂质激酶家族，其主要生化功能是使磷酸肌醇的3-羟基磷酸化。PI3K抑制剂的实例在本领域中是已知的且包括但不限于渥曼青霉素(Wortmannin)、LY294002、SF1126(一种小分子前药，LY294002连接至整合素结合组分的缀合物)、NVP-BEZ235(咪唑并喹啉衍生物)、NVP-BGT226、XL765、GDC-0980、PF-04691502、PF-05212384、PKI-587、NVP-BKM120、XL147、PX-866、GDC-0941、GSK615和/或CAL-101。在一些实施方案中，PI3K抑制剂是在WO2009/114874、WO2009/088990、US7511041、US7666901、US7662977、WO2010/046639、US20100105711、WO2010/037765、US20100087440、WO2010034414、US20100075965、US20100075951、US20100075947、WO2010/038165、WO2010/036380、WO2010/059788、WO2010/049481、WO2009/134825、WO2009/123971、WO2009/099163和/或WO2009/042607中描述的化合物，这些参考文献在此通过引用整体并入。

本文还提供了在本文所描述的方法中用作癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的RAF抑制剂。在一些实施方案中，RAF抑制剂是BRAF抑制剂。在一些实施方案中，RAF抑制剂是CRAF抑制剂。示例性BRAF抑制剂在本领域中是已知的且包括例如索拉非尼(sorafenib)、PLX4720、PLX-3603、达拉菲尼(dabrafenib)(GSK2118436)、GDC-0879、RAF265(Novartis)、XL281、AZ628、ARQ736、BAY73-4506、维罗非尼和在WO2007/002325、WO2007/002433、WO2009111278、WO2009111279、WO2009111277、WO2009111280和美国专利号7,491,829中描述的那些抑制剂。在一些实施方案中，BRAF抑制剂是选择性BRAF抑制剂。在一些实施方案中，BRAF抑制剂是BRAF V600的选择性抑制剂。在一些实施方案中，BRAF V600是BRAF V600E、BRAF V600K和/或V600D。在一些实施方案中，BRAF V600是BRAF V600R。在一些实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在一些实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。

维罗非尼(RG7204、PLX-4032，CAS登记号1029872-55-5)已经被证明导致各种癌症细胞系例如黑素瘤细胞系的程序性细胞死亡。维罗非尼干扰BRAF/MEK/ERK路径上的BRAF/MEK步骤-如果BRAF具有常见V600E突变。如FDA所批准，维罗非尼在患者中例如黑素瘤患者中起作用，该患者的癌症具有V600E BRAF突变(即，在BRAF蛋白质上的氨基酸位置编号600处，正常缬氨酸被谷氨酸替换)。约60％的黑素瘤具有V600E BRAF突变。V600E突变存在于多种其它癌症包括淋巴瘤、结肠癌、黑素瘤、甲状腺癌和肺癌中。维罗非尼具有以下结构：

(维罗非尼)(Genentech,Inc.)是在美国获得批准且适用于治疗具有通过FDA批准试验所检测的BRAF V600E突变的不可切除性或转移性黑素瘤患者的药品。不推荐在缺少BRAF V600E突变的黑素瘤患者(野生型BRAF黑素瘤)中使用(维罗非尼)。

本文还提供了在本文所描述的方法中用作癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的铂类药剂。铂类药剂的实例包括但不限于顺铂、卡铂、奥沙利铂(oxaliplatin)、沙铂(satraplatin)、吡铂(picoplatin)、奈达铂(nedaplatin)和/或三铂(triplatin)。在一些实施方案中，铂类药剂是顺铂。在一些实施方案中，铂类药剂是卡铂。

本文还提供了在本文所描述的方法中用作癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的紫杉烷。紫杉烷是可以结合至微管蛋白的双萜，其促进微管聚合和稳定和/或防止微管解聚。紫杉烷在本文中包括紫杉类(taxiod)10-脱乙酰基巴卡丁III和/或其衍生物。紫杉烷的实例包括但不限于紫杉醇(即，紫杉酚，CAS号33069-62-4)、多西他赛(即，泰素帝(taxotere)，CAS号114977-28-5)、拉洛他赛(larotaxel)、卡巴他赛(cabazitaxel)、米拉他赛(milataxel)、泰西他赛(tesetaxel)和/或奥拉他赛(orataxel)。在一些实施方案中，紫杉烷为紫杉醇。在一些实施方案中，紫杉烷为多西他赛。在一些实施方案中，将紫杉烷配制在Cremophor中(例如，)或Tween例如聚山梨醇酯80中(例如，)。在一些实施方案中，紫杉烷是脂质体封装紫杉烷。在一些实施方案中，紫杉烷是紫杉烷的前药形式和/或缀合形式(例如，共价缀合至紫杉醇的DHA、聚谷氨酸紫杉醇和/或碳酸亚油酸酯-紫杉醇)。在一些实施方案中，配制大体上不含表面活性剂的紫杉醇(例如，不含Cremophor和/或Tween-诸如Tocosol紫杉醇)。在一些实施方案中，紫杉烷是涂覆有白蛋白的纳米颗粒(例如，Abraxane和/或ABI-008)。在一些实施方案中，紫杉烷是

本文提供了在本文所描述的方法中用作癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的长春花生物碱。长春花生物碱是最初衍生自长春花(Periwinkle)植物长春花(Catharanthus roseus)的一组抗有丝分裂和抗微管剂。长春花生物碱的实例包括但不限于长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞宾。在一些实施方案中，长春花生物碱是长春瑞宾。

本文提供了在本文所描述的方法中用作癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的核苷类似物。核苷类似物的实例包括但不限于吉西他滨、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨和/或氟尿苷；在一些实施方案中，核苷类似物是吉西他滨。

A.抗体

本文提供用于本文所描述的方法的分离抗体，其结合至受关注多肽诸如G9a。在任何以上实施方案中，抗体为人源化。此外，根据任何以上实施方案的抗体是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一个实施方案中，抗体是抗体片段，例如，Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)₂片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如，本文所定义的“完整IgG1”抗体或其它抗体类别或同种型。

在另一方面，根据任何以上实施方案的抗体可以并入如以下部分中所描述的任何特征中的一个或组合。

1.抗体亲和力

在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤lμM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M或更少，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)的离解常数(Kd)。在一个实施方案中，通过放射性标记抗原结合分析(RIA)测量Kd。在一个实施方案中，使用Fab型式的受关注抗体和其抗原进行RIA。例如，通过在未标记抗原的滴定系列的存在下用最小浓度的(¹²⁵I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体涂层板捕获结合抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如，Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立分析条件，用含在50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕获用抗Fab抗体(Cappel Lab)涂覆多孔板(Thermo Scientific)过夜，且随后在室温(约23℃)下用含在PBS中的2％(w/v)胎牛血清封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc号269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与受关注Fab的连续稀释液混合(例如，与Presta等,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中的抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。然后整夜孵育受关注Fab；然而，孵育可以持续更长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。之后，将混合物转移到捕获板用于在室温下孵育(例如，持续1小时)。然后移除溶液并用含在PBS中的0.1％聚山梨醇酯20洗涤板8次。当板已经干燥时，添加150μl/孔闪烁剂(MICROSCINT-20^TM；Packard)，并在TOPCOUNT^TMγ计数器(Packard)上对板计数10分钟。选择产生小于或等于最大结合的20％的每个Fab的浓度用于竞争结合分析。

根据另一个实施方案，使用表面等离振子共振分析测量Kd。例如，在25℃下，使用固定抗原CM5芯片以约10应答单位(RU)进行使用或(BIAcore,Inc.,Piscat away,NJ)的分析。在一个实施方案中，根据供应商的说明书用N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠(pH4.8)稀释到5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射，以获得约10个应答单位(RU)的偶联蛋白。在注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量来说，在25℃下将Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)以约25μl/min的流速注射到含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂(PBST)的PBS中。使用简单的一对一结合模型(Evaluation Software 3.2版本)，通过同时拟合结合和离解传感图来计算结合速率(k_on)和离解速率(k_off)。平衡离解常数(Kd)被计算为k_off/k_on比率。参见例如，Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过以上的表面等离振子共振分析测得结合速率超过10⁶M^-1s^-1，那么可以使用荧光淬灭技术来测定结合速率，即如在分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMIN CO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯所测量，在浓度渐增的抗原的存在下，测量PBS pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fa b形式)于25℃下的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。

2.抗体片段

在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂、Fv和scFv片段以及下文描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün,于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag，纽约),第269-315页(1994)；另外参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)₂片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。

双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，可以是二价或双特异性。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等，Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。在Hudson等，Nat.Med.9:129-134(2003)中还描述了三抗体和四抗体。

单结构域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变结构域或整个或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516)。

可以通过各种技术来生成抗体片段，这些技术包括但不限于如本文所描述的完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞生成(例如，大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)。

3.嵌合和人源化抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体在例如美国专利号4,816,567和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sc i.USA,81:6851-6855(1984))中描述。在一个实例中，嵌合抗体包括非人类可变区(例如，衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔子或非人类灵长类动物诸如猴的可变区)和人类恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是其中类或亚类已从亲本抗体发生改变的一个“类别切换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人类抗体被人源化以降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人类抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR例如CDR(或其部分)衍生自非人类抗体且FR(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体任选还将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人类抗体(例如，衍生HVR残基的抗体)的相应残基取代，例如用于恢复或提高抗体特异性或亲和力。

人源化抗体和其形成方法在例如Almagro和Fransson,Front.Bi osci.13:1619-1633(2008)中综述，并且进一步在例如Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述“F R重排”)；以及Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述用于FR重排的“导向选择”方法)中描述。

可以用于人源化的人类框架区包括但不限于：使用"最佳拟合"(best-fit)方法选择的框架区(参见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；衍生自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变型)框架区或人生殖系框架区(参见例如，Almagro和Fransson,Fr ont.Biosci.13:1619-1633(2008))；和衍生自筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

4.人抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般在van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Op in.I mmunol.20:450-459(2008)中描述。

可以通过向转基因动物施用免疫原来制备人抗体，该转基因动物已经被修饰成应答抗原激发而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其置换内源性免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或无规整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源性免疫球蛋白基因座灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584，其描述XENOMOUSE^TM技术；美国专利号5,770,429，其描述技术；美国专利号7,041,870，其描述K-M技术；以及美国专利申请公开号US 2007/0061900，其描述技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合来进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。

还可以通过基于杂交瘤的方法来生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boemer等,J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也在Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中描述。额外的方法包括在例如美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)还在Vollmers和Brandlein,Hist.&Histopath.,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods Find Exp.Clin.Pharm acol.,27(3):185-91(2005)中描述。

还可以通过分离选自人衍生型噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来生成人抗体。然后，可以将此类可变结构域序列与所需的人恒定结构域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。

5.文库源性抗体

可以通过筛选组合文库中具有一种或多种所需活性的抗体来分离抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并筛选此类文库中具有所需结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等Methods Mol.Biol.178:1-37(O’Brien等编辑,Hum an Press,Totowa,NJ,2001)中并且进一步在例如McCafferty等,Na ture 348:552-554；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；M arks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,M ethods Mol.Biol.248:161-175(Lo编辑,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等,J.Immunol.M ethods 284(1-2):119-132(2004)中描述。

在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的谱系，并在噬菌体文库中无规重组，然后可以筛选噬菌体文库中的抗原结合噬菌体，如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所描述。噬菌体通常展示呈单链Fv(scFv)片段形式或呈Fab片段形式的抗体片段。来自免疫来源的文库提供针对免疫原具有高亲和力的抗体而无需构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆天然谱系以在没有任何免疫的情况下提供针对大范围的非自体抗原以及自体抗原的单一来源抗体，如由Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所描述。最后，还可以通过以下方式合成制备天然文库：自干细胞克隆未重排V基因区段并使用含有PCR引物的无规序列以编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排，如由Hoogenboom和Winte r,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。

从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被视为人抗体或人抗体片段。

6.多特异性抗体

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性中的一种是受关注多肽例如G9a，而另一种是针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合受关注多肽诸如G9a的两个不同表位。双特异性抗体还可以用于将细胞毒剂定位于表达受关注多肽例如G9a的细胞。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段。

用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))、WO 93/08829和Traunecker等,EMBOJ.10:3655(1991))和“孔中钮”(knob-in-hole)工程化(参见例如美国专利号5,731,168)。还可以通过以下方式制备多特异性抗体：工程化用于生成抗体Fc-杂二聚体分子的静电牵引效应(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980和Br ennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以生成双特异性抗体(参见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用"双抗体"技术以生成双特异性抗体片段(参见例如Holling er等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及如例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所描述制备三特异性抗体。

本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”(参见，例如US 2006/0025576A1)。

本文中的抗体或片段还包括“双重作用性FAb”或“DAF”，其包含结合受关注多肽例如G9a及另一种不同抗原的抗原结合位点(参见例如US 2008/0069820)。

7.抗体变体

a)糖基化变体

在某些实施方案中，改变本文所提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列以产生或移除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体添加糖基化位点或使抗体缺失糖基化位点。

在抗体包含Fc区的情况下，可以改变其附接的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含支化双触角寡糖，其一般通过N-键接附接至Fc区的CH2域的Asn297。参见例如Wright等TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接至双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的海藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改进特性的抗体变体。

在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺少附接(直接或间接)至Fc区的海藻糖的碳水化合物结构。例如，海藻糖在此抗体中的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。如通过MAL DI-TOF质谱法所测量，通过相对于附接至Asn297的所有糖结构(例如，复合、杂交和高甘露糖结构)的总和，计算在Asn297处的糖链内海藻糖的平均量来测定海藻糖的量，如例如WO2008/077546中所描述。Asn297是指位于Fc区中的约位置297(Fc区残基的Eu编号)处的天冬酰胺残基；然而，Asn297还可以由于抗体中的微小序列变异而位于位置297的上游或下游约±3个氨基酸处，即在位置294和位置300之间。此类海藻糖基化变体可以具有改进的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“去海藻糖基化”或“海藻糖缺乏”抗体变体的公开的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Ya mane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成去海藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质海藻糖基化的Lec 13CH O细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US专利申请号US 2003/0157108A1,Presta,L；和WO 2004/056312A1,Adams等,尤其是实施例11)，以及基因敲除细胞系诸如α-1,6-海藻糖基转移酶基因FUT8基因敲除CHO细胞(参见例如，Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechn ol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。

进一步提供了具有两等分寡糖的抗体变体，例如其中附接至抗体Fc区的双触角寡糖通过GlcNAc二等分。此类抗体变体可以具有降低的海藻糖基化和/或改进的ADCC功能。此类抗体变体的实例在例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利号6,602,684(Umana等)和US2005/0123546(Umana等)中描述。还提供了在附接至Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改进的CDC功能。此类抗体变体在例如WO1997/30087(Patel等)；WO1998/58964(Raju,S.)和WO 1999/22764(Raju,S.)中描述。

b)Fc区变体

在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文所提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。

在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些而非全部效应子功能的抗体变体，所述效应子功能使该抗体成为如下应用的期望候选物：其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应子功能(诸如补体和ADCC)是不必要或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性分析以确认CDC和/或ADCC活性的降低/去除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合分析以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的初级细胞NK细胞仅表达Fc(RIII)，而单核细胞表达Fc(RI)、Fc(RII)和Fc(RIII)。FcR在造血细胞上的表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中。评估受关注分子的ADCC活性的体外分析的非限制性实例在美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中描述。或者，可以采用非放射性分析方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox 非放射性细胞毒性分析(Promega,Madison,WI)。适用于此类分析的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估受关注分子的ADCC活性，例如在动物模型诸如Clynes等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA95:652-656(1998)中公开的动物模型中。还可以进行Clq结合分析以确认抗体不能结合Clq并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO 2005/100402中的Clq和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以进行CDC分析(参见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域中已知的方法来进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。

效应子功能降低的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个经取代的那些抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297被取代为丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。

描述了对FcR的结合有所改善或减弱的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO2004/056312和Shields等,J.Biol.Ch em.9(2):6591-6604(2001)。)在某些实施方案中，抗体变体包含一个或多个具有改进ADCC的氨基酸取代(例如在Fc区的位置298、333和/或334(EU残基编号)处的取代)的Fc区。在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的改变(即，改进或减弱)，例如，如美国专利号6,194,551、WO99/51642和Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)所描述。

半衰期增加并且与负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿Fc受体(FcRn)(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))的结合改进的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等)。那些抗体包括其中具有一个或多个改进Fc区对FcRn的结合的取代的Fc区。此类Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一个或多个处具有取代，例如Fc区残基434的替代的那些变体(美国专利号7,371,826)。关于Fc区变体的其它实例，还参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO94/29351。

c)半胱氨酸工程化抗体变体

在某些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程化抗体，例如“硫代单抗(thioMAb)”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，被取代的残基存在于抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团借此定位于抗体的可接近位点并且可以用于使抗体与其它部分诸如药物部分或接头-药物部分缀合，以产生如本文中进一步描述的免疫缀合物。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸取代下列残基中的任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以如例如美国专利号7,521,541所描述来产生半胱氨酸工程化抗体。

B.免疫缀合物

本文进一步提供用于本文所描述的方法中的免疫缀合物，其包含结合受关注多肽例如G9a或EGFR的抗体，所述抗体与一种或多种细胞毒性剂例如化学治疗剂或化学治疗药、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素缀合。

在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于美登木素(参见美国专利号5,208,020,5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235)；奥瑞斯他汀(auristatin)例如单甲基奥瑞斯他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483、5,780,588和7,498,298)；多拉司他汀；卡里奇霉素或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；HinMan等,Cancer Res.53:3336-3342(1993)；和L ode等,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环霉素例如柔红霉素或阿霉素(参见Kratz等,Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Je ffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgo v等,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等,Proc.Natl.Acad.S ci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Lette rs12:1529-1532(2002)；King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；和美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷如多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛、泰西他赛和奥拉他赛；单端孢霉烯；和CC1065。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文所描述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecene)。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射缀合物的如本文所描述的抗体。多种放射性同位素可用于生成放射缀合物。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素。当使用放射缀合物进行检测时，其可以包含供闪烁法研究用的放射性原子例如Tc^99m或I¹²³，或供核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像，mri)用的自旋标记物诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可以使用多种双功能蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如己二亚氨酸二甲酯HCl)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)来生成抗体和细胞毒性剂的缀合物。例如，可以如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所描述来制备蓖麻毒素免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸酯基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于使放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是有利于细胞毒性药物在细胞内释放的“可裂解接头”。例如，可以使用酸不稳定性接头、肽酶敏感性接头、光不稳定性接头、二甲基接头或含有二硫醚的接头(Chari等,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。

本文的免疫缀合物或ADC明确预期但不限于此类缀合物，其利用包括但不限于以下的交联剂药剂而制备：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)，这些可以从市场上购得(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockf ord,IL.,U.S.A)。

C.结合多肽

本文还提供了用于本文所描述的方法的结合多肽，它是结合受关注多肽包括G9a的多肽。在一些实施方案中，结合多肽是G9a拮抗剂拮抗剂。结合多肽可以使用已知的多肽合成方法化学合成或可以使用重组技术来制备和纯化。结合多肽的长度通常为至少约5个氨基酸，或者长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更多，其中此类结合多肽能够优选特异性结合至靶标例如本文所描述的G9a或EGFR。在一些实施方案中，结合多肽抑制G9a甲基转移酶活性。

结合多肽可以使用熟知技术无需过度实验来鉴别。就这点而言，应该注意，用于筛选多肽文库中能够特异性结合多肽靶标的结合多肽的技术是本领域中所熟知的(参见例如美国专利号5,556,762、5,750,373、4,708,871、4,833,092、5,223,409、5,403,484、5,571,689、5,663,143；PCT公开号WO 84/03506和WO84/03564；Geysen等,Pr oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:3998-4002(1984)；Geysen等,Proc.N atl.Acad.Sci.U.S.A.,82:178-182(1985)；Geysen等,in Syntheti c Peptides as Antigens,130-149(1986)；Geysen等,J.Immunol.Me th.,102:259-274(1987)；Schoofs等,J.Immunol.,140:611-616(1988)，Cwirla,S.E.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378；Lowman,H.B.等(1991)Biochemistry,30:10832；Clackson,T.等(1991)Nature,352:624；Marks,J.D.等(1991),J.Mol.Biol.,222:581；Kang,A.S.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8363和Sm ith,G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.,2:668)。

美国专利号5,723,286、5,432,018、5,580,717、5,427,908、5,498,530、5,770,434、5,734,018、5,698,426、5,763,192和5,723,323中也公开了生成肽文库和筛选这些文库的方法。

D.结合小分子

本文提供了用于上述方法中的结合小分子，其用作受关注多肽诸如G9a的结合小分子拮抗剂。在一些实施方案中，结合小分子拮抗剂抑制G9a甲基转移酶活性。

结合小分子优选是除本文所定义的结合多肽或抗体之外的有机分子，其优选特异性结合至本文所描述的G9a和/或EGFR。

可用于实施某些实施方案的G9a的小分子拮抗剂的实例包括式I的化合物，其异构体或异构体的混合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药。式I的化合物，也称为UNC0638，在本文中称为G9ai-2，是对于G9a和GLP以浓度依赖性方式降低H3K9me2水平的有效的选择性和细胞渗透性化学探针。这样的化合物，以及可用于制备这些化合物的方法和中间体描述于Vedadi等.,Nat.Chem.Biol.,7,566-574(2011)和Sweis等.,ACS Med.Chem.Lett.,5,205–209(2014)。

在一些实施方案中，G9a抑制剂是Bix-01294、UNC0321、UNC0646和/或UNC0224(参见Vedadi等,Nat.Chem.Biol.,7,566-574(2011))。Bix-01294在本文中也称为G9ai-2。

在一些实施方案中，G9a抑制剂包括2-(六氢-4-甲基-1H-1,4-二氮杂-1-基)-6,7-二甲氧基-[1-(苯基甲基)-4-哌啶基]-4-喹唑啉胺或其盐。在一些实施方案中，G9a抑制剂包括2-(六氢-4-甲基-1H-1,4-二氮杂-1-基)-6,7-二甲氧基-[1-(苯基甲基)-4-哌啶基]-4-喹唑啉胺三盐酸盐。在一些实施方案中，G9a抑制剂是7-[3-(二甲基氨基)丙氧基]-2-(六氢-4-甲基-1H-1,4-二氮杂-1-基)-6-甲氧基-N-(1-甲基-4-哌啶基)-4-喹唑啉胺或其盐。

在一些实施方案中，G9a抑制剂是

或其盐。

在一些实施方案中，G9a抑制剂包括

其中R1和R2是以下中的一种或多种(包括任意组合)

在一些实施方案中，G9A抑制剂是万维网网址sciencedirect.c om/science/article/pii/S0960894X12015399，(Fujishiro等,Bio organic&Medicinal Chemistry Letters,23,733-736(2013))中所述的抑制剂，其通过引用整体并入本文。

可以使用已知方法来确定和化学合成结合小分子(参见，例如PCT公开号WO00/00823和WO00/39585)。结合小分子的大小通常小于约2000道尔顿，或者小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中能够优选特异性结合至本文所描述的多肽的此类小分子可以使用熟知技术无需过度实验而确定。就这点而言，应该注意，用于筛选有机小分子文库中能够结合受关注多肽的分子的技术是本领域中所熟知的(参见例如PCT公开号WO00/00823和WO00/39585)。结合有机小分子可以是例如醛、酮、肟、腙、缩氨基脲、卡巴肼、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、缩酮、酮缩硫醇、缩醛、硫缩醛、芳基卤、芳基磺酸酯、烷基卤、烷基磺酸酯、芳族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二醇、氨基醇、噁唑烷、噁唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺、环氧化物、氮丙啶、异氰酸酯、磺酰氯、重氮化合物、酰基氯等。

E.拮抗剂多核苷酸

本文还提供了用于本文所描述的方法的多核苷酸拮抗剂。该多核苷酸可以是反义核酸和/或核酶。反义核酸包括与受关注基因(例如，本文所描述的G9a(UNIPROT号Q96KQ7-1、Q96KQ7-2和/或Q96KQ7-3的氨基酸序列，其通过引用整体并入本文)的RNA转录物的至少一部分互补的序列。然而，绝对互补虽然是优选的，但不是必需的。

本文中提到的“与RNA的至少一部分互补”序列意指具有足够的互补性从而能够与RNA杂交形成稳定双螺旋的序列；在双链反义核酸的情况下，可以由此测试双螺旋DNA的单链，或者可以分析三螺旋形成。杂交能力将取决于互补程度和反义核酸的长度。通常，杂交核酸越大，其可以包含的与RNA的碱基失配越多且仍可以形成稳定双螺旋(或视情况而定，三螺旋)。本领域技术人员可以通过使用标准程序测定杂交复合物的熔点来确定可容忍的失配度。

与信使的5’末端例如至且包括AUG起始密码子的5′未转译序列互补的多核苷酸应该最有效地抑制转译。然而，已经证明与mRNA的3′未转译序列互补的序列也能有效抑制mRNA的转译。一般参见Wagner,R.,1994,Nature 372:333-335。因此，可以在反义方法中使用与基因的5′-或3′-非转译非编码区互补的寡核苷酸来抑制内源性mRNA的转译。与mRNA的5′未转译区互补的多核苷酸应该包括AUG起始密码子的补体。与mRNA编码区互补的反义多核苷酸是不太有效的转译抑制剂，但是可以根据本发明来使用。无论被设计成与mRNA的5′-、3′-还是编码区域杂交，反义核酸的长度都应该为至少六个核苷酸，且优选是长度在6至约50核苷酸的范围内的寡核苷酸。在具体方面，寡核苷酸为至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。

F.抗体和结合多肽变体

在某些实施方案中，预期本文所提供的抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。例如，期望改进抗体和/或结合多肽的结合亲和力和/或其它生物特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体和/或结合多肽的核苷酸序列中或者通过肽合成，制备抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体和/或结合多肽的氨基酸序列内的残基进行删除和/或插入和/或取代。可以进行删除、插入和取代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有所需的特征例如抗原结合。

在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体和/或结合多肽变体。取代诱变的受关注位点包括HVR和FR。保守取代在表1中的“优选取代”标题下示出。更实质的变化在表1中的“示例性取代”标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别所进一步描述。可以将氨基酸替代引入受关注的抗体和/或结合多肽中，并且对产物筛选所需的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。

表1

根据共同的侧链特性，氨基酸可以分组如下：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代将需要用这些类别之一的成员替换另一个类别。G.抗体和结合多肽衍生物

在某些实施方案中，本文中提供的抗体和/或结合多肽可经进一步修饰以含有本领域已知的且易于获得的其他非蛋白质部分。适于使抗体和/或结合多肽衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇和其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而可以在生产中具有优势。聚合物可以具有任何分子量，且可以支化或未支化。附接至抗体和/或结合多肽上的聚合物数量可以变化，而且如果附接了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可以基于多种考虑来确定用于衍生化的聚合物的数量和/或类型，这些考虑包括但不限于抗体和/或结合多肽要改进的具体特性或功能、抗体衍生物和/或结合多肽衍生物是否将用于限定条件下的治疗等。

在另一个实施方案中，提供了抗体和/或结合多肽与可以通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。辐射可以具有任何波长，且包括但不限于这样的波长，其对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质部分加热至抗体和/或结合多肽-非蛋白质部分附近的细胞被杀死的温度。

IV.筛选和/或鉴别具有所需功能的G9a拮抗剂的方法

已经在上文描述了用于本文所描述的方法的受关注多肽G9a的额外拮抗剂，包括抗体、结合多肽和/或小分子。本文中提供的额外拮抗剂诸如抗G9a抗体、结合多肽和/或结合小分子可以通过本领域中已知的各种分析针对其物理/化学特性和/或生物活性来鉴别、筛选或表征。

在某些实施方案中，包括含有G9a多肽的原子坐标的存储器的计算机系统可用作用于合理鉴别具有G9a的配体结合位点的化合物的模型。可以例如重新或通过修饰已知化合物来设计此类化合物。在其它情况下，可以通过测试已知化合物以确定是否与G9a的分子模型“对接”来鉴别结合化合物。此类对接方法一般在本领域中是熟知的。

G9a晶体结构数据可以与计算机建模技术结合使用，以通过分析晶体结构数据来开发多种G9a结合化合物的结合模型。位点模型描绘了位点表面的三维形貌以及包括范德华接触(van der Waals contact)、静电相互作用和氢键机会的因素。然后使用计算机模拟技术来映射被设计成与模型位点相互作用的官能团的相互作用位置，所述官能团包括但不限于质子、羟基、胺基、二价阳离子、芳香族和脂肪族官能团、酰胺基、醇基等。可以将这些基团设计进药效团或候选化合物中，期望该候选化合物将特异性结合至位点。药效团设计因此涉及考虑候选化合物落在药效团内以通过任何或所有可用类型的化学相互作用包括氢键结合、范德华力(van der Waals)、静电和共价相互作用与位点相互作用的能力，然而一般而言，药效团通过非共价机制与位点相互作用。

除了实际合成以外，可以使用计算机建模技术来分析药效团或候选化合物结合G9a多肽的能力。只有通过计算机建模被指出以足够的结合能(在一个实例中，结合能对应于与标靶的离解常数，约为10^-2M或更紧)结合标靶(例如，G9a多肽结合位点)的那些候选物才可能被合成，并使用本领域技术人员已知的和/或本文所描述的酶分析测试其结合G9a多肽和抑制G9a(如果适用的话，酶功能)的能力。因此，计算评价步骤避免了不太可能以适当亲和力结合G9a多肽的化合物的不必要合成。

可以通过其中筛选化学实体或片段并选择它们与G9a多肽上的个别结合靶位点相结合的能力的一系列步骤来计算地评估和设计G9a药效团或候选化合物。本领域技术人员可以使用若干方法之一针对化学实体或片段与G9a多肽且更具体与G9a多肽上的靶位点结合的能力对它们进行筛选。该过程可以首先是基于G9a多肽坐标或本领域中已知的那些坐标的子集肉眼检查例如计算机屏幕上的靶位点。

为了选择诱导癌细胞死亡的拮抗剂，可以相对于参照物评估由例如碘化丙啶(PI)、台盼蓝或7AAD摄入所指示的膜完整性的丧失。可以在缺乏补体和免疫效应细胞下进行PI摄入分析。仅用培养基或用包含适当联合治疗的培养基孵育肿瘤细胞。将细胞孵育3天的时间。在每个处理后，洗涤细胞并等分至35mm滤网覆盖的12×75试管(每个试管1ml，每个处理组3个试管)中用于去除细胞团块。试管然后接收PI(10μg/ml)。可以使用流式细胞仪和CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。如通过PI摄入所测定的相比于仅含培养基和/或单一疗法诱导统计显著水平的细胞死亡的那些拮抗剂可以被选为诱导细胞死亡的抗体、结合多肽或结合小分子。

在任何筛选和/或鉴别方法的一些实施方案中，G9a的候选拮抗剂是抗体、结合多肽、结合小分子或多核苷酸。在一些实施方案中，G9a拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，G9a拮抗剂是结合小分子。在一些实施方案中，G9a拮抗剂抑制G9a甲基转移酶活性。

V.药物制剂

本文所描述的G9a拮抗剂和/或癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的药物制剂是通过将具有所需纯度的此类抗体与一种或多种可选的药学上可接受的载体(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编辑(1980))混合成冻干制剂或水溶液形式而制备。在一些实施方案中，G9a拮抗剂和/或靶向治疗是结合小分子、抗体、结合多肽和/或多核苷酸。在一些实施方案中，癌症治疗剂是EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，癌症治疗剂为紫杉烷。在一些实施方案中，紫杉烷为紫杉醇。在一些实施方案中，紫杉烷为多西他赛。

药学上可接受的载体通常在所用的剂量和浓度下对接受者无毒，且包括但不限于：缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质络合物)和/或非离子表面活性剂诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药学上可接受的载体进一步包括间质性药物分散剂诸如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(Baxter Internationa l,Inc.)。某些示例性sHASEGP(包括rHuPH20)和使用方法在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述。在一个方面，将sHA SEGP与一种或多种额外的葡萄糖胺基聚糖酶诸如软骨素酶组合。

示例性冻干制剂在美国专利号6,267,958中描述。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后述制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。

本文中的制剂还可以包含多于一种治疗特定适应症所需要的活性成分，优选那些具有不互相产生不利影响的互补活性的活性成分。此类活性成分适合以对于预期目的有效的量组合存在。

可以将活性成分包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术在Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)中公开。

可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括包含G9a拮抗剂和/或癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品形式，例如薄膜或微胶囊。

用于体内施用的制剂一般是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌性。

VI.制品

在本发明的另一个方面，提供了包含可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制品。所述制品包括容器和位于容器上或与容器相伴的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉输液袋等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器内含有单独的组合物或与另一种有效治疗、预防和/或诊断病状的组合物组合的组合物，并且可以具有无菌进入口(例如容器可以为具有塞子的静脉输液袋或小瓶，塞子可被皮下注射针刺穿)。组合物中的至少一种活性剂为本文所描述的G9a拮抗剂。标签或包装说明书指示组合物用于治疗特别的病状。另外，所述制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含G9a拮抗剂；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)。

在一些实施方案中，所述制品包括容器、所述容器上的标签和所述容器内含有的组合物，其中所述组合物包含一种或多种药剂(例如，与一种或多种生物标记物结合的一级抗体或本文所描述的一种或多种生物标记物的探针和/或引物)，容器上的标签指示该组合物可以用于评估样品中一种或多种生物标记物的存在，以及使用药剂来评估样品中一种或多种生物标记物的存在的说明书。所述制品可以进一步包括用于制备样品和使用药剂的一套说明书和材料。在一些实施方案中，所述制品可以包含药剂诸如初级和二级抗体，其中二级抗体与标记物例如酶标记物缀合。在一些实施方案中，所述制品包含本文所描述的一种或多种生物标记物的一种或多种探针和/或引物。

在任何制品的一些实施方案中，G9a拮抗剂和/或癌症治疗剂是抗体、结合多肽、结合小分子或多核苷酸。在一些实施方案中，癌症治疗剂为紫杉烷。在一些实施方案中，紫杉烷为紫杉醇。在一些实施方案中，癌症治疗剂是EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，G9a拮抗剂和/或EGFR拮抗剂的拮抗剂是结合小分子。在一些实施方案中，EGFR结合小分子拮抗剂是埃罗替尼。在一些实施方案中，G9a拮抗剂的拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是人、人源化或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是抗体片段且该抗体片段结合G9a和/或抑制剂。在一些实施方案中，G9a拮抗剂抑制G9a甲基转移酶活性。

在本发明的这个实施方案中的制品可以进一步包括指示组合物可以用于治疗特定病状的包装说明书。在一些实施方案中，包装说明书包含用于在癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)之前施用的和/或与癌症治疗剂同时施用的G9a拮抗剂的说明。或者或另外，所述制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer′s solution)和葡萄糖溶液。其可以进一步包括就商业和用户立场而言可期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。

制品中的其它任选组分包括一种或多种缓冲液(例如封闭缓冲液、清洗缓冲液、底物缓冲液等)、其它药剂诸如被酶标记物化学改变的底物(例如色原)、表位修复液、对照样品(阳性和/或阴性对照物)、对照载玻片等。

应该理解，任何上述制品可以包括本文所描述的免疫缀合物来代替或补充G9a拮抗剂和癌症治疗剂(例如，靶向治疗、化学治疗和/或放射治疗)。

实施例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。应该理解，考虑到以上提供的一般描述，可以实践各种其它实施方案。结果也呈现和描述在附图和图例中。

实施例1

材料和方法

细胞培养

在5％CO₂在37℃下，将所有细胞维持在补充有5％胎牛血清(FBS)和L-谷氨酰胺的RPMI培养基(高葡萄糖)中。

细胞存活分析

将2x10⁵个细胞涂铺在6孔丛培养皿的每个孔中。在涂铺后24小时，移除培养基并替换成含有药物的培养基。每2天替换新鲜培养基一次，直到未处理的细胞达到汇合。然后移除培养基，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，接着用在PBS中的4％甲醛固定15分钟。然后用PBS洗涤细胞并用荧光核酸染色试剂Syto60(1nM于PBS；Molecular Probe)染色15分钟。移除染料，用PBS洗涤细胞单层，并使用Odyssey红外成像仪(Li-Cor Bioscience)在700nM下进行荧光定量。在一些设置中，使用RFP核红细胞而不是Syto60。

耐药性持留细胞(DTP)的产生

用如本文所描述的相关药物在超过100倍确定IC₅₀值的浓度下处理药敏性细胞三回，每次处理持续72小时。在第三回相关药物处理结束时仍贴附在培养皿上的活细胞被视为DTP，并将其收集供分析使用。

特别对特罗凯、GDC-0980、GDC-0973、AZ628和拉帕替尼DTP来说，将细胞涂铺并生长至60-70％汇合，然后用特罗凯(0.1、0.2、0.5和/或1uM)、GDC-0980(2uM)、GDC-0973(1uM)、AZ628(2uM)和拉帕替尼(1uM)处理。在最终剂量的化学治疗后1周收集并进行分析DTP。

siRNA和shRNA基因敲低

对于siRNA基因敲低，在黑色96孔透明底平板(Corning,目录号3603)中以1000个细胞/孔使用0.0625ul DharmaFECT1转染脂质(Dharmacon，目录号T-2001)和12.5nM最终浓度的单链siRNA(Dharmacon siGENOME)将细胞反向转染。随后转染细胞48-72小时，然后用含在培养基中的1uM相关药物处理或仅用培养基替换转染培养基。孵育72小时后，然后用新鲜培养基替换培养基+/-药物，以允许在相关药物处理后存活的耐药性持留细胞(DTP)恢复(恢复期)。在3天恢复期后，根据制造商方案使用CyQUANT直接细胞增殖测定(Molecular Probe)测量最终的细胞活力。使用GE IN细胞分析仪2000(4X物镜)检测CyQUANT荧光信号，并使用利用GE Developer Tollbox1.9.1开发的图像分析算法量化为每孔的细胞数量。随后在Microsoft Excel中处理数据，且每个细胞系在完全独立的条件下操作两次。

结合小分子抑制剂实验

通常，对于G9a抑制剂实验，在化学治疗治疗前用活性化合物以0.1、0.2、0.5和/或1uΜG9a抑制剂UNC0638处理细胞3-5天，并且在研究期间维持用药。

细胞收集和蛋白质分析

在Laemmli样品缓冲液中制备细胞裂解物并通过如前所述的免疫印迹法进行分析。使用抗H3上的修饰的商业抗体(Abcam、Active Motif和Cell Signaling Technologies)分析细胞裂解物。

质谱法样品制备

使具有1千万个细胞的样品裂解并使用Active Motif组蛋白纯化试剂盒(万维网activemotif.com/catalog/171.html)从细胞裂解物分离出组蛋白。使用Qubit荧光平台(Invitrogen)进行分离后的蛋白定量。目标产量是至少20μg或更多的纯化组蛋白/5百万个细胞。然后使样品衍生化并使用d0/d10丙酸酐和胰蛋白酶消化进行双重比较。具体来说，使用d0丙酸酐使每种样品的5μg等分试样衍生化，以阻断赖氨酸和单甲基化赖氨酸残基。对照样品使用15μg。使用胰蛋白酶消化样品。使用d0丙酸酐使对照样品再衍生化(在暴露的肽N末端上)。使用d10丙酸酐使测试样品再衍生化(在暴露的N末端上)。每个测试样品独立地与对照样品以1:1汇集。然后，对样品进行多酶消化。每种样品使用一组三种酶以在待表征的PTM位点周围生成大肽，并在所有位点周围产生相伴的重叠序列覆盖。

质谱法

在LTQ Orbitrap Velos串联质谱仪上，通过纳米LC/MS/MS以数据依赖模式分析肽消化物。使用CID、HCD和ETD碎裂方案采集数据。在数据采集后，使用Mascot(Matrix Science)进行数据库搜索，以用于测定乙酰化、甲基化、二甲基化、三甲基化、磷酸化和泛素化。包括从头测序的手工数据分析用于确定推定性计算机模拟分配并询问原始数据在Mascot中不匹配的修饰肽。对精确治疗全扫描LC/MS数据进行积分以测定样品之间的修饰肽的相对丰度。在每次LC/MS运行内通过比较d0/d5对来定量被胰蛋白酶消化的丙酰化样品(根据Garcia等,JPR,8,5367-5374(2009)的操作)。在LC/MS运行之间对备选酶样品进行无标记定量。

结果

G9a是特异性催化组蛋白H3的单甲基化和二甲基化赖氨酸9的组蛋白甲基转移酶。G9a也称为EHMT2、BAT8、GAT8、KMT1C和NG36。H3K9KMT G9a(KMT1C)已显示在体外和体内甲基化H3K27。G9a和G9a样蛋白(GLP或KMT1D)主要作为G9a-GLP异聚体复合物存在，其在体内似乎是功能性H3K9甲基转移酶。已经在许多类型的人类癌症中观察到G9A表达的升高的水平。

如图1B所示，与亲本PC9细胞相比，G9a在人非小细胞肺癌细胞系PC9药物耐受性存留物(DTP)中上调。为了证实G9a甲基化活性是建立药物耐受性所必需的，G9a短发蛋白与3'-UTR-GFP基因敲低的表达显示消除PC9药物耐受性细胞。参见图1C。与通过Western印迹和质谱两者的G9a表达水平的变化一致，与PC9亲本细胞相比，PC9DTP中的H3K9me3增加，如图2C所示。

如图3A所示且数据未显示，小分子G9a拮抗剂UNC0638能够通过Western印迹和质谱法观察到抑制H3K9的甲基化。此外，如图3B所示，小分子G9a拮抗剂UNC0638抑制自体甲基化G9aK185me3。使用如图4所示的G9A-K185me 0/1/2/3肽下拉质谱数据，CDYL1和LRWD1被H3K9或G9aK185甲基化肽拉下，表明甲基化的K9或甲基化的G9a可以募集其功能对于该群体的异染色质形成可能是重要的蛋白质。

小分子G9a拮抗剂UNC0638(G9ai-2)能够抑制H3K9的甲基化，并且在一系列癌细胞类型中以及在使用各种药物产生的DTP上抑制DTP形成示于图中。如图5和7所示，用UNC0638(G9ai-2)处理减少了通过用特罗凯处理产生的非小细胞肺癌细胞系PC9、DTP的数目。此外，UNC0638(G9ai-2)减少H3K9的甲基化，如Western印迹所示以及减少PC9DTP的数目(参见图6)。如图8(乳腺癌细胞系EVSA-T/GDC-0980)、图9(乳腺癌细胞系SKBR3/拉帕替尼)、图10(黑色素瘤细胞系M14/GDC-0973)和图11(结肠直肠癌细胞系Colo205/AZ628)所示，通过多个细胞系和治疗方案观察到UNC0638(G9ai-2)以及DTP形成对H3K9的甲基化的减少。

尽管已经通过说明和实施例详述了上述发明以用于清楚说明，但所述描述和实施例不应该被视为限制本发明的范围。本文所引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用整体并入。