天花粉蛋白在增强疫苗特异性抗体中的应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，更具体地讲，涉及天花粉蛋白在增强疫苗特异性抗体中的应用。

背景技术：

每年流感病毒流行除引发较高致死率，对于世界大流行病的发生也是一个重大威胁，对于儿童与老年人，发病率与死亡率更高。接种流感疫苗是预防和控制流感发生的主要措施之一，接种季节性流感疫苗对于控制流感的发生发挥着举足轻重的作用。目前，被批准使用的流感疫苗分为两大类：灭活流感疫苗和减毒流感活疫苗。灭活流感疫苗主要分为以下几类：全病毒灭活疫苗、灭活病毒裂解产物疫苗和灭活亚单位疫苗。现阶段较为广泛应用的是三价灭活裂解疫苗。而利用鸡胚生产、对每年新流行的毒株的疫苗至少需要6个月。虽然在过去的三十年里，生产重组蛋白的速度、效率的提高为开发亚单位疫苗提供了新的机遇。然而，与传统的减毒或灭活疫苗相比，亚单位疫苗免疫原性比较低，缺少安全有效的人用佐剂严重制约了该类的疫苗开发，疫苗的产能不足问题在流感大爆发时尤显突兀。因此，提高流感疫苗产能，控制流感大流行的根本在于寻找能提高流感疫苗特异性抗体的方法，相关研究亦是当前疫苗研究的热点之一，比如可通过提高疫苗抗原的免疫原性，从而降低每剂疫苗的抗原用量最终提高疫苗产能。

流行性脑脊髓膜炎(epidemiccerebrospinalmeningitis)是最常见的传染病之一，具有传染性强、人群隐性感染多的特点，主要分为普通型和爆发型两种。患者临床表现为剧烈头痛、频繁呕吐、高热不退等症状，常留下脑实质损害的后遗症。病情严重的发生败血症并累及呼吸和循环系统造成其功能衰竭，危及生命。

流脑的高发地区是非洲、亚洲和南美洲，平均每年发生30-50万病例，对儿童和老年人危害尤为严重，爆发型流脑感染儿童其病死率可高达40％-60％，老年人为17.6％。我国曾出现过5次全国性流脑大流行，其中在1967年春季的流脑流行创造了我国有史以来最强的发病高峰，发病率高达403/10万，病死率5.49％。

因此，流脑疫苗接种是预防和控制流脑发生的关键措施，我国自1980年起正式批准生产a群流脑多糖疫苗，极大地控制了流脑的全国爆发。但是根据近20年来的数据，我国每年流脑发病人数都会达到上千人，而且1994年、2003年流脑发生了两次较明显的发病率反弹现象，2003年度全国报告2490例，与去年同期上升0.53％，死亡134例，死亡数增加8.06％，统计显示其毒力存在着8-10年一个周期的爆发规律，预计下一个发病人数反弹高峰即将到来。造成这一现象的主要原因主要包括两个方面：

首先，a群流脑流行的优势基因型周期性的变换，导致此病周期性流行；

其次，免疫实践证明，多糖类抗原大都属于t细胞非依赖性抗原，不能有效激活辅助性t细胞(th)和t记忆细胞，不能诱导产生免疫记忆功能，免疫保护时间短暂，再次免疫接种不能产生加强免疫反应。而现行流脑疫苗恰恰为多糖类疫苗，其免疫原性差，刺激机体产生免疫应答的效率低下甚至会产生异常应答。

资料显示，脑膜炎球菌多糖抗原虽能诱导产生igm和igg抗体，但人类所产生的igg主要是igg2亚类，而人血清igg2亚类抗体出现较迟，一般到8-12岁才能上升至成人水平，故而婴幼儿接种该多糖疫苗后，产生的抗体以具有短暂作用的igm抗体为主，这就导致了流脑疫苗尤其对两岁以下的婴幼儿保护能力弱、保护周期短的问题。

因此，一方面加强推广接种流脑疫苗，另一方面提高流脑疫苗免疫原性即增强其保护效果对预防和控制流脑发病及流行有重要意义。

另外，目前按照国家接种流脑疫苗免疫程序的规定，完整接种该疫苗共需接种4剂，第1、2剂为基础免疫，第3、4剂次为加强免疫，儿童自6月龄接种第1剂，2剂次间隔不少于3个月，3岁时接种第3剂，与第2剂间隔时间不少于1年；6岁时接种第4剂，与第3剂接种间隔不少于3年。

不难看出，现有免疫程序较其他疫苗接种繁琐和复杂，具有接种次数多和流动儿童疫苗漏接率高的缺点，直接影响到疫苗的免疫效果。

针对以上流脑疫苗免疫原性差、接种繁琐等实际问题，如果我们能够研发出更好的可以增强现有疫苗的免疫原性，诱导高水平的特异性保护抗体的策略和技术方法，就有希望可以解决现有流脑疫苗尤其对婴幼儿的低免疫原性、诱导免疫记忆、免疫应答能力弱和仅有短期保护作用等问题。

国外最新研究表明多糖与蛋白质结合成为结合疫苗可以部分改善多糖疫苗的缺陷。参考b型流感嗜血杆菌(hib)结合疫苗研发成功的经验，各国学者均在积极探索用相似的方式改进流脑疫苗的保护效果、减少接种不良反应。

已有经验中，佐剂是非特异性地增强机体对特异性抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，而本身无抗原性的物质，可先于或与抗原同时应用。佐剂作为免疫增强剂应用于流感疫苗，对于增强疫苗的免疫原性、提高疫苗的免疫效果有十分重要的意义。目前，在商品化的三价灭活流感疫苗(tiv)中已有铝佐剂使用，并证明可以增强抗原的免疫原性，减少有效的免疫应答所需要的抗原。但铝佐剂的缺点在于，它不能诱导产生th1型反应，干扰细胞免疫，并阻断cd8+ctl的激活，使得疫苗的免疫保护作用不全面，不持久，并且也有一些不良反应。但由于铝佐剂的应用历史较长，安全性相对新型佐剂较为可靠，故目前还无法被完全取代。虽然其它许多疫苗佐剂都曾用于增强流感疫苗免疫原性的研究，但只有mf59(鲨烯水乳液)等水包油乳剂显示了较强的佐剂效应并最终在欧洲被批准在流感疫苗中使用，但该种佐剂在增加免疫原性的同时，也增强反应原性，在成年人中可见轻微局部疼痛、发热、红斑、硬结、肌痛等症状增加。

鉴于以上疫苗与佐剂的缺点，寻找新的、可特异性增强流感和流脑病毒抗体水平和时间的佐剂类物质是当务之急。

在这方面，我国宝贵的中草药库有着天然的优势。天花粉蛋白(trichosanthin，tcs)是从葫芦科栝楼属植物栝楼的根块中提取出来的一种碱性蛋白，入药已有两千年的历史。tcs临床主要用于抗早孕及宫外孕、葡萄胎、绒癌等的治疗，同时其也是唯一被临床用于抗艾滋的中药，对hiv病毒有明显抑制作用，并且这种抑制作用与tcs的浓度呈正相关。天花粉蛋白作为一种植物蛋白，有廉价、易获得、生物作用广泛等特点，使其具有了良好的研究前景及实用价值。

从80年代起，国内外许多学者开始从多角度观察了天花粉蛋白对免疫系统的影响。不同研究小组的研究结果发现天花粉蛋白具有免疫抑制和免疫增强两种免疫调节作用：tcs可诱发人体t细胞介导的免疫抑制，即tcs对可溶性抗原和多克隆激活剂诱发的t细胞增殖具有强烈的抑制作用。对其作用机制的结果表明tcs诱导免疫抑制需要抗原递呈细胞参与，涉及抗原加工递呈和hla-dq分子的功能性表达，低剂量的tcs还可直接干扰t淋巴细胞发挥正常的功能。这些结果都说明tcs可能对同种异基因免疫应答有抑制效应。但是一定浓度的tcs也能促进植物血凝素刺激下的正常人外周血单个核细胞(pbmc)分泌il-2和il-6，由于il-2可作用于tc细胞，产生杀伤和细胞毒效应，参与细胞免疫应答；il-6则刺激b细胞增殖产生抗体，介导机体的体液免疫应答。因此tcs通过促进il-2和il-6的分泌，起到增强机体免疫应答的作用。tcs可促使小鼠唾液腺内igg分泌增多，促进小鼠脾脏免疫细胞的形成和分化，使b淋巴细胞及浆细胞数量明显增多，增强体液免疫。一定浓度的天花粉蛋白增强免疫调节作用提示天花粉可能具有类似佐剂的作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供天花粉蛋白在增强疫苗特异性抗体中的应用。

为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：天花粉蛋白在增强疫苗特异性抗体中的应用。

作为一个优选方案，所述天花粉蛋白的使用量为0.004－0.04mg/kg。

作为一个优选方案，所述疫苗指流感疫苗和流行性脑脊髓膜炎疫苗。

本发明的优点在于：极低剂量中药天花粉蛋白可显著增强疫苗特异性抗体免疫应答水平，为研制免疫效果增强的新佐剂流感疫苗和解决流感疫苗产能不足的问题提供有力解决方案。只需使用原有疫苗十分之一的量，即可达到保护作用，抗体的滴度和维持时间显著增加，降低90％疫苗的使用量。国内外尚无研究报道，天花粉蛋白源自中药，极具中国特色。

附图说明

图1天花粉蛋白诱导ova特异性体液免疫应答，利用模式抗原-卵清白蛋白(ova)与天花粉蛋白混合免疫小鼠，在免疫后的1、2、3周采血，用ova以1ug/ml的浓度包被96孔板，将初免的血清稀释100倍，再免之后的血清稀释10000倍后，测定血清中ova特异性免疫球蛋白igg的含量，同时设立不同对照组，确定天花粉蛋白可诱导ova特异性体液免疫应答。

图2血清中抗ova特异性igg1与igg2a表达格局，用ova以1ug/ml的浓度包被96孔板，将初免的血清稀释100倍，再免之后的血清稀释10000倍后，测定稀释后的血清中抗原特异性的igg1与igg2a，表明tcs诱导了th2主导的特异性体液免疫应答。

图3tcs显著增强细胞因子ifn-r和il-5显著升高，a图，tcs显著增强抗ova特异性igg1抗体水平；b图tcs显著增强抗病毒和抗体生成有关的细胞因子ifn-r和il-5分泌水平，通过血清中特异性抗体亚型的测定，证明tcs可显著增强th2主导的体液免疫应答，同时用elisa验证tcs实验组中细胞因子的格局变化，结果发现与抗病毒和抗体生成有关的细胞因子ifn-r和il-5显著升高。

图4tcs显著增强血清中特异性抗流感病毒igg水平，剂量范围实验确定了tcs的最适剂量为1μg/小鼠，将葛兰素史克生产的流感疫苗fluarix(gsk)100μl与1μg天花粉蛋白混合免疫小鼠，同时设立空白对照和铝佐剂对照，发现，1μg天花粉蛋白显著增强小鼠血清中抗flu特异性抗体水平，与对照组比较有统计学意义(p＜0.01)。

图5tcs显著降低流感疫苗fluarix的用量，仍然可到达等同的抗体水平。将流感疫苗fluarix按照倍比稀释后(5μl，10μl，50μl，100μl)，分别与1μg天花粉蛋白混合免疫小鼠，同时设立对照组，通过eilsa检测发现，如果加入天花粉蛋白，即使仅仅取用疫苗常用剂量的十分之一，10μl，仍然可以达到100μl疫苗剂量同等范围内的抗体水平，两者相比无统计学意义。

图6小鼠血清中抗流脑抗体滴度随免疫时间的变化，tcs能够显著增强血清中抗流脑病毒的特异性抗体，提高流脑疫苗mccv的免疫应答，实验组(mccv+tcs)血清中特异性抗体滴度显著高于对照组(mccv)(p＜0.01)，连续观察7周，组间差异从第2周起开始，从第4周开始，在第5周差异最为显著，抗体滴度到达最高值，表明天花粉蛋白可显著增强a群流脑疫苗特异性抗体的滴度。

图7小鼠血清中抗流脑抗体滴度随免疫时间的变化，tcs能够显著延长mc特异性抗体在体内时间，由此增强流脑疫苗对小鼠的保护时间。通常多糖类流脑疫苗常规接种后保护时间约为3个月。我们发现，与对照相比，第13周后，对照组血清中已检测不到特异性抗体，而实验组血清中特异性抗体在30周时依然维持着较高的水平，仍然可以达到最高滴度时的一半。说明tcs通过某种机制使得小鼠对多糖类流脑疫苗的免疫应答更加持久，有效延长了疫苗的保护时间。

图8a显示对照组小鼠脾脏b2细胞(b220+cd11b-)比例为38.9％,图8b显示实验组小鼠脾脏b2细胞比例为57.5％，实验组b2细胞比对照组增加了18.6％，提示tcs可显著提升小鼠体内b2细胞百分比。

图9a显示对照组小鼠骨髓b2祖细胞(b220⁺cd11b^-)比例为12.9％,图图9b显示实验组小鼠骨髓b2祖细胞比例为29.6％，实验组b2细胞比对照组增加了16.7％，提示tcs可显著提升小鼠体内b2祖细胞百分比。

图10a为对照组小鼠腹膜腔b1细胞的流式结果图，横坐标为cd11b，纵坐标为ssc，对照组小鼠腹膜腔cd11b+比例为54.8％；图10b横坐标为b220，纵坐标为igm，以cd11b+设门，显示对照组小鼠b220lowigmhigh比例为84.3％，图10a、图10b表明对照组小鼠b1细胞(cd11b+b220lowigmhigh)比例为54.8％*84.3％＝46.2％。

图11a为实验组小鼠腹膜腔b1细胞的流式结果图，横坐标为cd11b，纵坐标为ssc，实验组小鼠腹膜腔cd11b+比例为70.0％；图11b横坐标为b220，纵坐标为igm，以cd11b+设门，显示对照组小鼠b220lowigmhigh比例为80.2％，图11a、图11b表明实验组小鼠b1细胞(cd11b+b220lowigmhigh)比例为70.0％*80.2％＝56.1％。

图12为足垫免疫以及采血流程与说明。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本发明首次发现中药天花粉蛋白可显著增强疫苗(亚单位流感及多糖类流脑疫苗)特异性抗体的水平：

(1)提供天花粉蛋白增强疫苗特异性抗体的有效浓度；

(2)提供其增强的应用效果与部分机制。

tcs增强亚单位流感疫苗特异性抗体的水平技术方法：

(1)利用模式抗原-卵清白蛋白(ova)与天花粉蛋白混合免疫小鼠，在免疫后的1、2、3周采血，测定血清中ova特异性免疫球蛋白igg的含量，同时设立不同对照组，确定天花粉蛋白可以诱导ova特异性体液免疫应答(图1)。

(2)确定天花粉蛋白发挥作用的最适剂量，在最佳剂量条件下，天花粉蛋白可以同时诱导体液与细胞免疫反应。首先，将ova与不同浓度的天花粉蛋白混合免疫小鼠，elisa测定小鼠血清中ova-specificiggantibody来确定天花粉蛋白的最适剂量为1μg/只小鼠，换算为0.004－0.04mg/kg(图2)。

(3)按最适剂量tcs与ova混合免疫小鼠，同时设立不同对照组，在初次免疫与再次免疫后的不同时间点，用ova体外刺激小鼠脾细胞，elisa检测th1型细胞因子的分泌情况；同时用mhc-i四聚体染色法检测cd8t细胞数量变化，并进行细胞内染色，流式细胞仪分析cd8t细胞的免疫应答反应。

(4)验证天花粉蛋白增强流感病毒抗原特异性免疫反应。采用肌肉注射免疫途径，检测天花粉蛋白辅助流感疫苗诱导小鼠抗原特异性的体液和细胞免疫反应。参考ova免疫应答强度确定tcs的最适剂量(图3)，elisa测定流感病毒抗原特异性的总igg和iga以及igg亚型抗体(图4)；流感病毒血凝抑制实验(hia)评价体液免疫的保护效果；噬斑试验测定血清中抗流感病毒的中和抗体滴度，进一步评价体液免疫保护效果；采用elispot分析测定免疫小鼠流感病毒抗原特异性的cd4andcd8tcells分泌ifn-γ的水平；流感抗原体外刺激免疫小鼠脾细胞，elisa测定细胞上清液中细胞因子，如il-2，ifn-gamma，il-4，il-5和il-13等，确定免疫应答格局。

(5)流感疫苗与天花粉蛋白混合免疫小鼠后，通过攻毒试验，验证天花粉蛋白增强流感疫苗诱导免疫应答的保护作用。同时，分别用流感疫苗或将流感疫苗与天花粉蛋白混合免疫小鼠，将加强免疫小鼠的血清过继转移回输到正常小鼠体内，然后对回输血清的小鼠进行攻毒试验，验证tcs增强的特异性抗体的过继保护作用。

tcs增强多糖类流脑疫苗特异性抗体的水平技术方法：

(1)8-10周龄的c57bl/6雌鼠按随机分成2组(另设一组空白对照)，参照tcs增强流感疫苗特异性抗体的使用剂量，按照以下流程(表1)验证tcs增强a群流脑疫苗(a-mccv)特异性抗体滴度。发现，对照组小鼠血清中抗流脑抗体滴度明显低于疫苗中添加tcs的实验组(图5)。

实验设组如表1：

足垫免疫以及采血流程与说明如图12。

足垫免疫

①90μg/瓶的a群脑膜炎球菌多糖疫苗(a-mccv)分为两组，每瓶加1.5ml缓冲生理盐水配制成60μg/ml的a-mccv。其中一组备用，另一组按照1μg/50μl的浓度加入tcs混匀后备用。

②用胰岛素注射针将配置好的免疫试剂对雌鼠分别进行足垫初次免疫，左右足垫各50μl，每只小鼠共注射0.1ml的试剂。在第24天按照初次免疫剂量加强免疫。加强免疫剂量与初次免疫剂量相同。

③根据结果会再设置两个实验组，一个在其他条件不变的情况下，适当降低注射疫苗的剂量；另一个取消第21天的加强免疫。观察与其他实验组和对照组的区别。

采血：

①免疫6天后，进行第一周的眼眶采血。预估得到每只小鼠血清100μl。其中每一份血清取5-10μl进行elisa实验(10μl则做副孔)，观察抗体的显著增加。将其余血清及时保存于-80℃冰箱。

②第一次免疫后第13天，进行第二周眼眶采血。

③第一次免疫后第20天，进行第三周眼眶采血。

④第一次免疫后第23天，进行将强免疫，免疫剂量同第一次免疫。

⑤加强免疫后让小鼠休息3天。

⑥第一次免疫后第26天，进行第四周眼眶采血。

⑦第一次免疫后第33天，进行第五周眼眶采血。

⑧第一次免疫后第40天，摘除小鼠眼球，尽可能地收集血液，处死小鼠。

(2)设计单一变量实验，验证添加tcs的流脑疫苗能够降低免疫原剂量、减少免疫次数等条件下达到等同或更好的保护效果。

(3)构建小鼠感染脑膜炎奈瑟菌模型，从接种疫苗开始每周监测小鼠的体重数据，同时验证tcs增强疫苗的保护作用。

天花粉蛋白与流脑疫苗(mpv)混合后，足垫免疫小鼠，分别于第2、6、7、9、10天眶周静脉丛取血，持续多周收集血清，用流脑疫苗以20ug/ml的浓度包被96孔板，将血清以1:10稀释，igm酶标二抗以1：1000稀释。用elisa法测定稀释后的血清中抗原特异性抗体、分析天花粉蛋白对骨髓b2祖细胞及脾脏b2细胞的比例、腹膜腔b1细胞的比例的变化(图8—图11)。

图8—图11显示tcs能够显著增加个体脾脏b2细胞，骨髓b2祖细胞，腹膜腔b1细胞的百分比，提示特异性抗体的增长与b细胞百分比同时出现。取小鼠脾脏细胞、骨髓细胞、腹膜腔细胞，流式细胞术分别检测小鼠脾脏b2细胞，骨髓b2祖细胞，腹膜腔b1细胞的百分比，天花粉蛋白能提高骨髓b2祖细胞及脾脏b2细胞的比例，同时腹膜腔b1细胞的比例也增加，提示b2由b1转化而来的可能性比较低，与elisa结果相一致。

从免疫学角度来讲，流感和流脑疫苗基本可以代表全部的疫苗，从疫苗抗原分类来讲为蛋白或多糖类，而以上两者分别是蛋白和多糖，因此以上效果可以概括到所对应抗原分类的所有疫苗。

本发明涉及的主要试剂与器材：

主要试剂：天花粉蛋白注射液(上海金山制药有限公司)，a群脑膜炎球菌多糖疫苗(北京天坛生物制品股份有限公司)，elisa小鼠细胞因子检测试剂盒(ebioscience)，碱性磷酸酶底物片剂(sigma)，淋巴细胞分离液，胎牛血清(hyclonelab，inc)，rpmi1640培养液(invitrogencorp),anti-mouseigg2a(gamma2achain)(rabbit)antibodyalkalinephosphataseconjugated(rockland),anti-mouseigg(h&l)(goat)antibodyalkalinephosphataseconjugated(rockland),anti-mouseigg1(gamma1chain)(rabbit)antibodyalkalinephosphataseconjuated(rockland)。

主要器材96孔培养板和24孔培养板，co2细胞培养箱(heraeus)，thermoscientificsorvalllegendr+台式离心机，max250全波自动酶标检测仪(moleculardevice)。

流感疫苗：商品名：福禄立适(fluarix)，成分(每0.5ml疫苗含以下病毒株的纯化抗原：)a3型流行性感冒病毒裂解血凝素抗原15ug(2011/2012年度：甲/珀斯/16/2009(h3n2)-类似株：甲/维多利亚/210/2009nymcx-187)a1型流行性感冒病毒裂解血凝素抗原15ug(2011/2012年度：甲/加利福尼亚/7/2009(h1n1)-类似株：甲/加利福尼亚/7/2009nymcx-181)b型流行性感冒病毒裂解血凝素抗原15ug(2011/2012年度：乙/布里斯班/60/2008)。

流脑疫苗：07052571(mccv)，流脑-武生-d-a多糖，a群脑膜炎灰奈瑟菌培养液，经提取获得荚膜多糖抗原，纯化后加入适宜稳定剂冻干制成。

本发明优点表现在：(1)通过中药天花粉诱导t细胞亚群分化增强流感及流脑疫苗特异性抗体水平，体现中国资源特色，取材的中药已入药两千多年，具有安全、廉价、易得的特点，国内外未见相关报道。

(2)目前流感病毒变异多，产能不足；流脑疫苗多针次、长间隔的繁琐接种程序使得“漏接”现象日益频繁，尤其是对于流动儿童，这一问题十分严重。这让疫苗保护效果大大降低。本发明可以提高疫苗使用效率，同时在减少疫苗接种次数、剂量的情况下使受接种人群获得相同的持久保护。

(3)tk通过改变细胞因子格局和t细胞亚群偏移提高体液免疫应答水平的方法，有助于从分子和细胞水平全面了解我国中药制剂天花粉蛋白的特性，及其发挥多种生物学活性的机制，为这一植物蛋白用于治疗更大范围的临床疾病展示新的前景，并可能为发展新的疫苗提供思路。

本发明简单易行，只需与疫苗简单混合，即可达到特异性抗体和效能增加的作用。极低剂量中药天花粉蛋白具有良好的增强疫苗效能的作用，可作为疫苗效能增强剂。将极低剂量天花粉蛋白与季节性流感疫苗联合应用，可加速诱导抗体免答，将低剂量天花粉蛋白与流脑疫苗联合应用，可显著增强特异性抗体免答，提高疫苗免原性，并显著降低抗用量同时促进细胞与体液应答，达到更好的保护效果，为研制新型佐剂流感疫苗与解决产能不足问题提供新思路，开拓了疫苗增强剂研究的发展空间。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。