本发明属于医学生物工程领域，具体涉及一种miRNA-71抑制剂及其用途。
背景技术：
：棘球蚴病俗称包虫病，是由棘球绦虫的中绦期幼虫寄生在哺乳动物脏器内引起的严重人畜共患病，多见于肝部和肺部。我国西部为该疾病流行区域，直接受威胁人口高达八千万。棘球绦虫种类较多，在我国包虫病患者人群中，最常见的是细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫这两种。目前临床上治疗包虫病的手段主要有手术治疗和药物治疗，其中治疗药物主要为苯并咪唑类衍生物。该类药物虽在一定程度上可提高患者生活质量，延长存活时间，但其不论是用于全身化疗还是局部治疗，大多仅起到抑制寄生虫生长的左右，效果十分有限。并且长时间服用该类药物可引起多系统的严重药物不良反应，甚至死亡。因此，目前临床急需寻找一种全新的靶向治疗药物。MicroRNA(miRNA)是真核生物中广泛存在的一种长约22个核苷酸的非编码小RNA分子，其对细胞发育、分化、增殖和凋亡至关重要，调控并影响了整个生命活动的过程。miRNA-71表达于所有的棘球绦虫，也常表达于一些寄生性吸虫和线虫体内。研究发现，该分子不仅在棘球绦虫中为表达丰度最高的miRNA之一，且持续表达于棘球绦虫的各个生命周期，对棘球绦虫的正常生长发育等极为重要。值得指出的是，人体组织细胞中不表达miRNA-71(也不存在与miRNA-71类似的小RNA序列)，使用miRNA-71抑制剂不会与人体自身的miRNA序列发生拮抗作用，因此具有靶向性和安全性的双重优势，极有可能成为包虫防治领域的新型有效手段。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有药物治疗的缺点，提供一种miRNA-71抑制剂，该抑制剂在制备防治包虫病药物的用途。本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种miRNA-71抑制剂，所述抑制剂为RNA单链，其特征在于，所述抑制剂的序列如下：5’-UCUCACUACCAUCGUCUUUCA-3’，其中每个核苷酸被2’-OMe修饰，5’端的前两个碱基和3’端的前4个碱基被磷硫酰键修饰，且3’端修饰有胆固醇基团。miRNA-71抑制剂在制备防治寄生虫病药物的用途。所述寄生虫病为包虫病。miRNA-71抑制剂通过抑制miRNA-71的表达达到抑制棘球绦虫生长发育和杀死棘球绦虫的作用。本发明的核酸序列被2’-OMe和磷硫酰键修饰的作用是为了提高合成分子对核糖核酸酶的抵抗性，达到可以稳定的竞争性抑制目的分子miRNA-71的作用；3’端修饰有胆固醇基团用于促进细胞对miRNA-71抑制剂的吸收作用，使该分子更易于在肝脏富集，并能延长其在血清中的半衰期。本发明具有以下优点：本发明提供的miRNA-71靶向抑制剂可特异性靶向抑制棘球绦虫中miRNA-71的表达，从而影响棘球绦虫正常生长发育并促进其死亡。本发明通过实验证明，在体外培养的含细粒棘球蚴原头节培养液中，加入本发明的miRNA-71抑制剂，可有效杀死其中的原头蚴。在包虫病小鼠动物模型中，使用本发明的miRNA-71抑制剂，对小鼠细粒棘球蚴原头节具有明显的抑制作用，其可为制备预防及治疗包虫病的药物提供基础。附图说明图1为荧光定量PCR检测细粒棘球蚴原头节中miRNA-71表达的结果示意图；图2为不同浓度miRNA-71抑制剂作用后细粒棘球蚴原头节活力曲线示意图；图3为miRNA-71抑制剂处理原头节24h后的Caspase-3酶活性变化示意图。具体实施方式下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。实施例1：通过体外培养细粒棘球蚴原头节检测本发明的miRNA-71抑制剂对miRNA-71表达的抑制作用1.合成本发明的miRNA-71抑制剂将5'-O-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-甲基胞苷-3'-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基)(5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2’-O-methyl-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl))修饰的RNA亚磷酰胺单体A、G、C、U，使用DNA合成仪对本发明miRNA-71抑制剂(示意图中简称Skm-71)进行化学合成，miRNA-71抑制剂的RNA序列为5’-UCUCACUACCAUCGUCUUUCA-3’。在控孔玻璃固相载体(controlled-poreglasssolidsupport)中进行RNA与胆固醇基团的连接修饰。在miRNA-71抑制剂的合成过程中，指定位置的磷硫酰键的修饰是通过亚磷酸盐和苯乙酰二硫化物(PADS)的氧化反应完成的。在控孔玻璃固相载体中对miRNA-71抑制剂进行切落和脱保护后，合成的miRNA-71抑制剂使用反相高效液相色谱法进行纯化。纯化后的miRNA-71抑制剂经冻干后保存于-80℃备用。2.合成miRNA-71抑制剂的阴性对照化合物设计一段miRNA-71抑制剂的阴性对照序列，该RNA序列为5’-AGUGACUAAGAUCGUAUGCAGUUGC-3’。其中每个核苷酸被2’-OMe修饰，5’端的前两个碱基和3’端的前4个碱基被磷硫酰键修饰，且3’端修饰有胆固醇基团。该阴性对照化合物的合成过程与miRNA-71抑制剂的制备方法相同。本发明中，该阴性对照化合物命名为Skm-negative(示意图中简称Control)。3.细粒棘球蚴原头节收集及体外培养取新鲜的自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏，先用自来水清洗干净表面污渍，再用75％酒精浸泡消毒10秒后放入超净工作台内。用一次性无菌注射器抽取包囊中含原头节的囊液，移入50ml无菌离心管中，静置待原头节沉淀后将上清弃掉，然后加入PBS清洗，静置待原头节沉淀后将上清弃掉，重复3～5次。用0.1％伊红染液做染色排斥实验，确定存活率≥98％。最后用含100U/ml青霉素，100U/ml链霉素和10％小牛血清的RPMI1640培养基将原头节混匀，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中进行培养，每2～3天更换一次培养液。4.实验分组收集原头节于倒置显微镜下计数，确定原头节密度后，按每孔约2000个原头节接种于六孔板中。设立对照组(示意图中简称Control)，原头节培养液中加入终浓度为50nM，100nM和200nM的miRNA-71抑制剂阴性对照。设立实验组(示意图中简称Skm-71)，原头节培养液中加入终浓度为50nM，100nM和200nM的miRNA-71抑制剂。同时还设立空白组(示意图中简称BLANK)，除培养液外不加任何试剂。每孔3天更换一次培养液，并重新加入miRNA-71抑制剂或阴性对照。5.Q-PCR检测细粒棘球蚴原头节中miRNA-71表达情况收集加入miRNA-71抑制剂或阴性对照后培养第三天和第六天的原头节，用PBS洗涤三次，然后使用试剂盒mirVanamiRNAIsolationKit进行操作提取总miRNA(购自Ambion公司)。将提取的总miRNA进行miRNA-71反转录，使用AppliedBiosystems公司的MicroRNAAssays试剂盒来进行操作，首先按表1加入以下体积加入相关试剂和样品。表1：反转录加入的试剂及用量然后按表2条件在PCR仪器中进行反应，4℃表示反应完成。.表2：反转录反应条件StepTypeTime(min)Temperature(℃)HOLD3016HOLD3042HOLD585HOLD∞4最后对上述步骤获得的反转录样品进行miRNA-71的荧光定量PCR检测，首先按表3中的体积加入相关试剂和样品。表3：荧光定量PCR反应加入的试剂及用量然后按表4的条件在荧光定量PCR仪器中进行反应。表4：荧光定量PCR反应条件6.实验结果实验数据均使用X±S表示，和空白组间比较用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。如图1所示，通过2-ΔΔCt法进行分析，Q-PCR结果显示在第三天和第六天，miRNA-71在实验组原头节中的表达相比对照组和空白组均受到显著抑制(P<0.05)，因此证实本发明的miRNA-71抑制剂可特异性抑制原头节中miRNA-71分子的表达水平。实施例2：用伊红染色法检测miRNA-71抑制剂对细粒棘球蚴原头节活力的影响1.伊红染色从细粒棘球蚴原头节培养液中加入miRNA-71抑制剂或阴性对照第一天开始，每组每天均匀抽取200ul培养液(含原头节约100个)，用0.1％伊红染色15min，倒置显微镜下观察原头节的活力。具有活力的原头节拒染、不着色，而死亡或活力减弱的原头节会着染红色，实验每次重复三次，计算每组每天平均存活率，存活率＝(活原头节数/总原头节数)X100％，连续观察10天，结果用活力曲线图进行表示。实验数据均使用X±S表示，和空白组间比较用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。2.实验结果如图2所示，活力曲线图结果显示实验组原头节的活力随着时间逐渐减少，并且高浓度miRNA-71抑制剂相比低浓度抑制剂的杀伤和抑制作用要更为明显(P<0.05)，证实本发明的miRNA-71抑制剂对细粒棘球蚴原头节具有显著的杀伤和抑制作用，且具有剂量依耐性和时间依耐性。实施例3：细粒棘球蚴原头节中Caspase-3酶活性检测1.Caspase-3酶活性检测在细粒棘球蚴原头节培养液中加入miRNA-71抑制剂或阴性对照处理24h后，收集原头节，用PBS清洗3次，再参照使用说明书用Caspase-3活性检测试剂盒(购自APPLYGEN公司)进行操作。首先对原头节进行称量，每3mg原头节加入150ul裂解液，用超声粉碎仪粉碎后，冰上裂解，4℃低温离心吸取上清，按说明书反应体系加入到96孔酶标板，放置于37℃避光孵育，最后使用酶标仪检测A405值，计算酶活力单位，每组实验重复三次。实验数据均使用X±S表示，和空白组间比较用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。2.实验结果如图3所示，酶联免疫吸附检测(ELISA)结果显示细粒棘球蚴原头节经过本发明的miRNA-71抑制剂处理后，Caspase-3酶活性相比阴性对照组和空白对照组明显增强(P<0.05)，证实其可引起原头节的细胞凋亡。此外，高浓度miRNA-71抑制剂相比低浓度抑制剂的诱导凋亡作用要更为明显(P<0.05)。实施例4：miRNA-71抑制剂处理后小鼠细粒棘球蚴原头节囊湿重及抑囊率1.建立细粒棘球蚴病小鼠模型从新鲜的自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏中收集原头节，0.1％伊红染色确定存活率≥98％。用含250IU/ml青霉素和链霉素双抗的无菌PBS稀释成含有原头节1000个/0.1ml的悬液，吸取0.2ml悬液(2000个原头节)经腹腔注射到6～8周龄大的Balb/c小鼠体内。感染6个月后，随机选取一只进行剖检，无菌操作打开腹腔，可见囊泡样结构形成，证实动物模型构建成功。2.实验分组使用细粒棘球蚴感染成功的Balb/c小鼠，设立对照组(图表中简称Control)接受50mg/kg/天或100mg/kg/天的阴性对照化合物腹膜腔注射治疗。设立实验组(图表中简称Skm-71)接受50mg/kg/天或100mg/kg/天的miRNA-71抑制剂腹膜腔注射治疗。设立空白组(图表中简称Blank)接受同剂量生理盐水的腹膜腔注射。对照组和实验组每种剂量的小鼠数量均为3例，空白组小鼠数量为3例。3.检测细粒棘球蚴囊湿重及计算抑囊率连续注射12天后，解剖小鼠，剥离细粒棘球蚴形成的囊泡并称重，即为囊湿重，每只小鼠均检测3次以上。抑囊率＝(A-B)/A，A为空白组细粒棘球蚴囊湿重，B为注射miRNA-71抑制剂或阴性对照组细粒棘球蚴囊湿重。实验数据均使用X±S表示，和空白组间比较用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。4.实验结果解剖发现每组实验小鼠均成功感染细粒棘球蚴。如表5所示，结果显示两种剂量的miRNA-71抑制剂均对小鼠细粒棘球蚴原头节有抑制作用，抑囊率在50％～75％，均有较好的抑囊趋势，与空白组和对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。表5.miRNA-71抑制剂处理后小鼠细粒棘球蚴原头节囊湿重及抑囊率SEQUENCELISTING<110>成都仕康美生物科技有限公司<120>一种miRNA-71抑制剂及其用途<130>1<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>21<212>RNA<213>人工序列<400>1ucucacuaccaucgucuuuca21当前第1页1 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