免疫监测点阻断药物和肿瘤疫苗联合的制药用途的制作方法
本发明涉及免疫监测点阻断药物和肿瘤疫苗联合在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
背景技术：
我国每年的新发癌症病人约有 250 万，因癌症而死亡的人数约为 140 万。未来空气、水质污染、环境破坏可能进一步提高癌症的发病率和病死率。目前，结直肠癌已经成为3种最常见的癌症之一，局限性的结直肠癌可通过手术治疗，而转移患者只有少部分可以获得多模式治疗。约50%的局限性结直肠癌患者在手术治疗后出现转移和复发。患者的预后依赖于肿瘤分级并受宿主肿瘤相互作用的影响，表现为病灶的T细胞浸润。
免疫治疗依赖于微环境中T细胞的激活，目前研究较多的是免疫监测点药物，包括CTLA-4拮抗型抗体、PD-1拮抗型抗体、TIM-3拮抗型抗体、LAG-3拮抗型抗体、可溶性OX40L、激活型OX40抗体、激活型GITR抗体、激活型4-1BB抗体、激活型CD40抗体、激活型CD27抗体、拮抗型CD70抗体等。在黑色素瘤、非小细胞肺癌等多种肿瘤中针对CTLA-4、PD-1的抗体显示了良好的肿瘤治疗效果，并批准为特定条件下的标准治疗方法。
PD-1是T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞上表达的抑制性受体，其配体包括PD-L1、PD-L2。PD-L1表达在免疫细胞上，更过量表达在肿瘤细胞上。PD-L1/PD-1通路和免疫逃逸、T细胞耗竭相关，导致T细胞增殖、细胞因子产生和细胞毒性受损。相比淋巴结的T细胞，结直肠癌病灶的浸润性T细胞PD-1的表达上调，产生细胞因子和穿孔素的能力降低；肿瘤微环境中PD-L1的表达高，提示PD-L1/PD-1轴在产生免疫抑制环境上起到重要的作用。
但是，临床试验未发现PD-1免疫监测点阻断对错配修复稳定结直肠癌患者的疗效，却对错配修复缺陷的结直肠癌患者有疗效。PD-1免疫监测点阻断对错配修复稳定结直肠癌患者失败的原因可能如下：1. 该肿瘤的免疫原性差，没有预先存在的免疫反应，T细胞不产生显著效果，所以针对免疫监测点的分子也就不起效果，但也有报道T细胞在原发性结直肠癌中起到显著效果；2. 转移性肿瘤的局部微环境处于高度免疫抑制状态，抑制了活化型T细胞的流入。特别是通过CCL5/CCR5轴形成T细胞抑制微环境，得到CCR5抑制剂Maraviroc临床试验的证实。PD-L1单抗（Atezolizumab）加FOLFOX 加VEGF单抗（Avastin）对顽固性的结直肠癌有高的控制效果。
另外一种免疫治疗方法是接种肿瘤疫苗，其原理是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体产生特异性细胞免疫和体液免疫反应，即激活患者自身的免疫系统，来增强机体的抗癌能力，进而阻止肿瘤的生长、扩散和复发，最终达到控制甚至清除肿瘤的目的。
肿瘤不是外来的，而是自体细胞发生的，因此机体对它的反应不如对细菌、病毒的反应那样强烈，以致早期症状不明显，发现的时候肿瘤往往已经到了晚期阶段，肿瘤细胞发生了转移，所有的治疗方法也无法达到治愈的目的。而接种肿瘤疫苗则可以在肿瘤发生的早期就可以高效、特异地清除肿瘤，而且不良反应小。
此外，肿瘤疫苗治疗也可与手术治疗、放疗及化疗相结合，在综合治疗肿瘤中占有重要地位。一种方法就是将纯化或者重组的肿瘤相关抗原和佐剂一起注射，诱发体液免疫和细胞免疫。研究表明，有一种分子MUC1和肿瘤关系密切，已经成为肿瘤免疫治疗的靶点。
国外以MUC1的VNTR为基础的肽结合或混合多种固有免疫系统的固有刺激物的疫苗进行了I期临床试验。佐剂包括 SB-AS2、不完全弗氏佐剂和钥孔虫戚血兰素（KLH）等。两个非糖基化的 VNTR 剂型已经非常成功地进入 III 期临床试验。
第一个是 Stimuvax （Merck, NJ, USA），它是一个 25 聚体的 VNTR MUC1肽被脂质体包裹联合和一个Toll样受体-4激动剂（脂质A），现在正在进行三个III 期临床试验：两个在非小细胞肺癌（NSCLC），一个在雌激素受体阳性的乳腺癌联合激素治疗。这些试验是基于IIB期研究的令人鼓舞的结果，即证明了处于 IIIB 阶段 NSCLC（限于局部的疾病）的一群病人，接受Stimuvax和最高标准护理的中位生存期为30.6 个月，而只接受最高标准护理的病人的中位生存期为13.3个月。最近一千多人的肺癌治疗试验表明癌症疫苗，总体治疗效果并不明显，可能和入组的是晚期肺癌患者有关系。通过分组发现以下规律：吸烟患者（n=762）的治疗效果好于非吸烟的患者，中位数生存时间从20.6个月延长到32.1个月（p=0.0058）；女性患者（n=269）的中位数生存时间从20.6个月延长到36.8个月(p=0.0370) ，非腺癌患者（n=496）的中位数生存时间从19.6个月延长到29.6个月(p=0.0435)；同时合并化疗的患者（n=806）中位数生存时间从20.6个月延长到30.8个月(p=0.0175)的研究显示，相对于化疗后使用疫苗的患者，只有化疗和疫苗同时使用的患者受益。
第二个是 MUC1（100 聚体）联合被氧化的甘露聚糖，它已经被使用很多年，在临床前、I 期和 II 期试验和III 期试验的研究中证明了有效性。总共 31 名绝经后的乳腺癌 II 期病人在 36 周内被免疫了甘露聚糖-MUC1 9 次，并且联合他莫昔芬。安慰剂组15名病人中有 4名复发，而用氧化甘露聚糖-MUC1治疗的16 名病人中没有发生复发（p=0.0292）。13位接受疫苗的患者中9位检测到MUC1的抗体，10位接受疫苗的患者中4位检测到MUC1特异性T细胞反应。安慰剂组未出现MUC1特异性免疫反应。2012-2015年随访III期临床研究表明：安慰剂组的乳腺癌复发率为60%（6/15），使用癌症疫苗的患者乳腺癌复发率为12.5%（2/16），寿命显著延长，总体使用癌症疫苗后无癌患者的百分比极显著增加；病人从未出现疫苗引起的毒性和自身免疫病，疫苗注射保证这些乳腺癌患者7年内无癌症复发。
临床试验还表明癌症疫苗对胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肾细胞癌患者都是安全有效的。根据肝癌、结直肠癌、甲状腺癌的抗原表达情况，癌症疫苗可能适合这部分肿瘤患者的治疗。1例不能手术的复发胃癌患者使用抗原诱导DC细胞局部治疗，30个月内未出现复发。对15位多发性骨髓瘤患者的I/II期临床试验研究表明，应用癌症疫苗的大部分患者病情稳定（至少17.5~41.3个月），出现T细胞和B细胞的特异性免疫。I期临床试验研究表明，肝脏转移结直肠癌患者经肝转移手术切除后使用表达GM-CSF的异种癌细胞疫苗，同时静脉低剂量给予环磷酰胺，患者产生抗MUC1的抗体，9位患者中6位存活时间超过3年，4位再无复发。II期临床研究发现，74位患者使用DC细胞治疗和疫苗治疗，结直肠癌患者的2年无复发生存率相近（分别为47%和55%），都好于非免疫组。39位晚期结肠腺瘤（结肠癌前病变）接种癌症疫苗后，17位产生抗MUC1的抗体和长期免疫记忆，而剩余未产生抗体的22位患者是因为接种疫苗前血液中的髓系抑制细胞数量较多有关。
技术实现要素：
针对目前在治疗结直肠癌方面存在的上述问题，本发明提供了免疫监测点阻断药物和肿瘤疫苗联合在制备用于治疗癌症的药物中的用途，达到单一治疗方法都无法达到的治疗效果，有效延长患者生存时间。
作为其中一个优选的方案，上述应用中，所述癌症为结直肠癌。结直肠癌包括结肠癌和直肠癌，结肠癌和直肠癌仅仅是患病部位不同，病灶癌细胞种类是一样的。免疫监测点阻断药物和肿瘤疫苗联合制备的药物对于结直肠癌的治疗特别有效。
作为其中一个优选的方案，上述应用中，所述免疫监测点包括CTLA-4、PD-1、TIM-3和LAG-3中的至少一种。
作为其中一个优选的方案，上述应用中，所述免疫监测点阻断药物为PD-1拮抗型抗体。
作为其中一个优选的方案，上述应用中，所述肿瘤疫苗为以MUC1蛋白为靶点的肺癌疫苗。
更优选地，上述应用中，所述肺癌疫苗是由以下任意一种蛋白质作为抗原制备而成的：
（1）氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同功能的衍生蛋白质；
（3）氨基酸序列中含有SEQ ID NO.2所示的必需序列；
（4）与SEQ ID NO.2所示的必需序列有30%及以上同源性的氨基酸序列。
更优选地，上述应用中，所述肺癌疫苗的制备方法为：扩增作为抗原的蛋白质的编码基因，连接到表达载体，转化大肠杆菌DH5α，经过IPTG诱导表达的产物进行纯化后获得的抗原蛋白，加入氢氧化铝佐剂混合即可。
更优选地，上述应用中，所述表达载体为pMAL-p5X质粒，所述纯化包括经内压式滤膜过滤除菌，滤液再经外压式滤膜浓缩；浓缩液经过10K滤膜透析2次至Tris缓冲液，离心后上Amylose亲和树脂纯化得到疫苗主要组分蛋白质，经内毒素去除达到标准<0.5EU/μg。pMAL-p5X质粒是商品化的大肠杆菌表达载体，用于表达本发明的抗原蛋白具有较显著的高效率。
作为其中一个优选的方案，上述应用中，所述免疫监测点阻断药物采用静脉输液给药，静脉给药有利于免疫监测点阻断药物快速进入循环系统，直达癌症部位；肿瘤疫苗采用肌肉注射的方式给药，肌肉给药利于药物的缓慢释放，在较长时间内刺激免疫系统，产生靶向肿瘤的免疫细胞。
作为其中一个优选的方案，上述应用中，所述免疫监测点阻断药物和肿瘤疫苗分别单独给药，联合药物的剂量和药物单独使用时剂量相同。肿瘤疫苗不增加免疫监测点阻断药物的副作用，肿瘤疫苗本身无副作用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过将免疫监测点阻断药物和肿瘤疫苗联合制备成新的药物，实现两种免疫疗法联合对结直肠癌的治疗，达到单药治疗都不能达到的优异治疗效果，显著限制了肿瘤的生长，延长了患者的生存时间。
附图说明
图1为实施例1中DH5α-pMAL-p5X-MNR表达的蛋白质电泳图；
图2为实施例2中各实验组结肠癌生长情况检测结果；
图3为实施例2中各实验组结肠癌小鼠寿命的检测结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。实施例中用到的生物材料如无特殊说明，均来自于市售商品。
实施例1 以MUCI蛋白为靶点的肺癌疫苗的制备
抗原蛋白的合成
根据SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，使用Gene Designer软件对其编码基因进行密码子优化，并在基因上游引入NdeI内切酶位点，下游引入NcoI内切酶位点，合成基因克隆入pUC57载体，氨苄抗性。基因合成后用NdeI和NcoI内切酶双酶切，连接入经过同样酶切的pMAL-p5X质粒，并用DNA连接酶连接，转化到感受态DH5α细菌，用含有氨苄（AMP）的琼脂培养板上筛选，挑选单克隆用LB-AMP培养基培养，提取质粒酶切鉴定，然后进行测序鉴定。将含有编码基因的pMAL-p5X质粒（为方便描述，将该质粒命名为pMAL-p5X-MNR）的DH5α细菌用LB-AMP培养，待OD600nm达到0.5加入终浓度为1mM的IPTG，诱导表达12h。同样诱导表达带有pMAL-p5X的DH5α细菌做为对照。取诱导前后的菌液进行蛋白质电泳，考马斯亮蓝R250染色。DH5α-pMAL-p5X-MNR表达出约65KD的蛋白质（如图1右指箭头所示），而对照细菌DH5α-pMAL-p5X表达出约48KD的蛋白质（如图1左指箭头所示）。
采用上述相同的方法，扩增表达出SEQ ID NO.2~4所示的蛋白质。
肺癌疫苗MNRVax的制备
肺癌疫苗的制备以DH5α-pMAL-p5X-MNR表达的抗原蛋白质为例进行详细说明。
先培养含pMAL-p5X-MNR质粒的DH5α菌株，待OD600nm达到0.5加入终浓度为1mM的IPTG，诱导表达12h。离心收集培养基。经内压式滤膜过滤除菌，滤液再经外压式滤膜浓缩。浓缩液经过10K滤膜透析2次至Tris缓冲液，离心后上Amylose亲和树脂纯化得到疫苗主要组分蛋白质，经内毒素去除达到标准<0.5EU/μg。制备无菌氢氧化铝佐剂，0.22μm滤膜过滤后4℃保存备用。取0.5ml氢氧化铝佐剂加入0.5mg （0.5ml）疫苗蛋白质，混合均匀即成为肺癌疫苗，命名为MNRVax1。
采用上述相同的方法，以SEQ ID NO.2~4所示的蛋白质为抗原制备肺癌疫苗，顺序命名为MNRVax2~4。
组合免疫治疗动物实验
取36只6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠，腋下注射MC38结肠癌细胞1×106个/100μl，待肿瘤长至可触摸检测到后分成以下六组，每组6只。每周联合给药2次，共6次。
分组情况：
双盐水对照组：腹腔和肌肉分别注射生理盐水100μl；
肌肉对照组：肌肉注射生理盐水100μl；
腹腔对照：腹腔注射生理盐水100μl；
肌肉MNRVax1组：肌肉注射MNRVax1疫苗100μl，内含50 μg蛋白质；
腹腔PD-1抗体组：腹腔注射PD-1抗体，注射100μl，含抗体150μg；
MNRVax1+PD-1抗体组：肌肉注射MNRVax1疫苗（注射100μl，含50 μg蛋白质）加腹腔注射PD-1抗体（注射100μl，含150μg）。
每周测量肿瘤大小3次，连续测量4周，按照长×宽2/2计算肿瘤体积，并观察肌肉对照组、肌肉MNRVax1组、腹腔PD-1抗体组、MNRVax1+PD-1抗体组小鼠的生存率。
结果给药后第4天，MNRVax1+PD-1抗体组（以下称联合治疗组）的肿瘤大小为0.308±0.056cm3，显著低于抗体组(0.575±0.208 cm3)、疫苗组(0.575±0.154 cm3)和双盐水对照组(0.561±0.206 cm3)。
联合治疗后的第8天，联合治疗组的肿瘤大小为0.302±0.101 cm3，极显著低于抗体组的肿瘤大小0.516±0.199 cm3，疫苗组的0.832±0.301 cm3，双盐水对照组的0.983±0.512 cm3。即抗体治疗降低了47.5%的肿瘤负载，而联合治疗降低了69.3%的肿瘤负载。抗体治疗组的肿瘤大小低于腹腔生理盐水对照组（0.996±0.155 cm3，p<0.01）,表明联合治疗比单独的抗体治疗好，对肿瘤的抑制作用起效早。联合治疗组响应率为100%，抗体治疗组响应率为67%。
联合治疗后的13天，肿瘤从第4天的0.308±0.056cm3缩小为0.224±0.154cm3，而抗体治疗组0.575±0.208 cm3从增加到0.890±0.419 cm3。即抗体治疗降低了29.9%的肿瘤负载，而联合治疗降低了82.3%的肿瘤负载。联合治疗组响应率为100%，抗体治疗组响应率为50%。
一直到治疗25天的肿瘤生长曲线见图2。从生存曲线上可以看出，联合免疫治疗好于抗体组和疫苗组，而抗体组和疫苗组又好于对照组，抗体和疫苗可以协同延长直肠癌动物的生存时间，见图3。总之，对结直肠癌的治疗效果，疫苗加抗体的联合治疗不但起效时间早，而且，持续时间长。这种治疗方法不但可以抑制肿瘤的生长，还可以延长动物的生存时间。
MNRVax2、MNRVax3和MNRVax4与PD-1抗体联合的实验效果与MNRVax1差别不大，均优于单独使用疫苗或单独使用PD-1抗体，具体过程在此不一一赘述。
结直肠癌患者用途
PD-1抗体用量约3mg/Kg体重，静脉注射给药，每周给药一次；癌症疫苗用量约7 μg/Kg体重，上臂肌肉注射给药，每周给药一次。持续使用1-12个月，效果优于单独使用疫苗或单独使用PD-1抗体。
肺癌患者用途
PD-1抗体用量约3mg/Kg体重，静脉注射给药，每周给药一次；癌症疫苗用量约7 μg/Kg体重，上臂肌肉注射给药，每周给药一次。持续使用1-12个月，效果优于单独使用疫苗或单独使用PD-1抗体。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院北京协和医院
<120> 免疫监测点阻断药物和肿瘤疫苗联合的制药用途
<130> P20160107
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 573
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu
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Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu
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245 250 255
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290 295 300
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<400> 3
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