本发明涉及抗心血管病药物技术领域，具体涉及常春卫矛乙醇提取物在制备抗心血管病药物中的应用，进一步说明常春卫矛乙醇提取物对血管内皮细胞氧化损伤的保护作用。
背景技术：
血管内皮细胞是连续被覆在全身血管内膜的一层细胞群，这一细胞群不仅仅是血液和组织的屏障，还具有合成多种血管活性物质的能力。血管内皮细胞作用包括：通过释放血管活性物质如一氧化氮(NO)前列环素(PGI2)内皮素(ET)血栓素A2(TXA2)等多种因子调节血管的舒张和收缩；提供一个抗血栓形成及抗血细胞黏附的表面；合成和分泌一些生长调节因子及细胞因子，调节正常的生理功能；调节血管的通透性，血管内皮细胞通过调节血液中可溶性物质、各种血浆水分子及细胞成分进入周围组织，起着选择性通透屏障作用，同时还维持血管基底膜静息时胶原及糖蛋白的稳定；在转运脂蛋白进入动脉壁时有修饰(氧化)胶蛋白的功能。
保持内皮细胞功能的完整性，在心血管系统稳态调节中起重要作用，血管内皮细胞的损伤与多种心血管疾病(如动脉粥样硬化、高血压、血栓形成等)有密切的关系，从整体细胞分子水平研究对血管内皮细胞具有保护作用的药物，对心血管疾病的防治研究具有重要意义。内环境紊乱与内皮细胞功能受损相互影响，如缺血缺氧高血糖高血脂等都会导致内皮细胞的损伤；另一方面内皮细胞功能受损又会引起或加重糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等疾病。近年来已证实多种中药能从多个方面保护血管内皮细胞免受损伤和促进内皮细胞增殖，从而为中药治疗血管内皮细胞功能受损相关性疾病提供了药理学依据。中药对血管内皮细胞的保护作用一般包括以下几个方面：1、中药降低血管内皮细胞脂质过氧化损伤；2、中药调节血管内皮细胞活性物质的释放；3、中药提高血管内皮细胞的存活率，抑制内皮细胞凋亡。
常春卫矛为卫矛科植物常春卫矛Euonymus hederaceus Champ.Ex Benth的根、树皮或叶，广西民间壮、瑶族特色药材，具有补肝肾、强筋骨、活血止血的功效，临床用于治疗肾虚腰痛、慢性腹泻、跌打损伤、月经不调。发明人前期完成了常春卫矛抗心血管病药理作用的研究，药理试验表明，常春卫矛提取物具有抗凝血，活血化瘀，抗炎，镇痛，抗疲劳，免疫增强等作用。发明人对常春卫矛的上述作用效果做了详细研究，并发有如下文章：
1.作者：罗宇东，张强，蒋林等在2014年6月《中国当代农药》中的“常春卫矛提取物体外及体内抑菌作用的试验研究”中研究了常春卫矛水提物、醇提物及5种不同溶剂提取物的抑菌活性，结果证明：，常春卫矛水提物及醇提物均对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门 菌、铜绿假单胞菌有一定程度的抑制作用，5种不同溶剂提取物中，甲醇、正丁醇、乙醇乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌有一定程度的抑制作用，石油醚、氯仿提取物无明显抑制作用.体内抑菌试验显示,常春卫矛水提物低(16.0g/kg)、高(32.0g/kg)剂量组、醇提物高剂量组(32.0g/ks)有明显降低金黄色葡萄球菌感染小鼠死亡率的作用(<0.05)。
2.作者：农毅清，蒋林，吴玉强等在2012年第23卷第6期《时珍国医国药》中发表“常春卫矛与爬行卫矛的镇痛抗炎作用及急性毒性研究”，文中研究了常春卫矛和爬行卫矛的镇痛、抗炎作用及急性毒性，结果表明：在采用相同给药剂量下实验表明，常春卫矛和爬行卫矛均能抑制巴豆油引起的小鼠耳廓肿胀；减少醋酸所致小鼠扭体次数具有明显的抗炎、镇痛作用。急性毒性实验结果：常春卫矛最大给药量为161.4g·kg-1，爬行卫矛最大给药量为321.8g·kg-1；说明常春卫矛和爬行卫矛均具有抗炎镇痛作用，两者的急性毒性都很小，这为常春卫矛替代爬行卫矛作为扶芳藤药材用于抗炎、镇痛方面提供了药理学实验依据。
3.作者：吴玉强，蒋林，钟正贤在2011年22卷第8期《时珍国医国药》中发表“常春卫矛与爬行卫矛提取物免疫调节抗疲劳作用对比研究”，文中研究了究常春卫矛和爬行卫矛的免疫调节、抗疲劳作用，结果表明：常春卫矛和爬行卫矛均能明显延长小鼠游泳耗竭时间，并降低血中乳酸和尿素氮含量，具有明显的抗疲劳、免疫增强作用。
4.公开号为：CN 102228500 A，名称为：常春卫矛制剂的生产方法及其应用。发明人对该药材进行了制备方法、药效学、毒理方面的研究，证明该产品无毒，并具有治疗心血管方面疾病的作用，该制剂可治疗血栓、降血脂、增加免疫力、镇痛，也可应用于治疗冠心病、心绞痛。专利中发明人将常春卫矛采用水提或乙醇对常春卫矛先进行初步提取，得到浸膏后进一步加工为可供人体服用、吸收的中药制剂。
上述可见，尽管人们已经对常春卫矛进行了多方面的研究，但常春卫矛保护血管内皮细胞的作用，还未曾报道过。
技术实现要素：
本发明的目的是针对目前常春卫矛在保护血管内皮细胞方面研究的空白，完成了相关药效学研究，对常春卫矛乙醇提取物进行了抗心血管病药理方面的研究，以此探索常春卫矛的药用价值，进一步开发广西特色中药资源，为资源利用和临床应用提供科学依据。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
常春卫矛乙醇提取物在抗心血管病药物中的应用，更进一步的，所述心血管病是由血管内皮细胞氧化损伤导致的，如背景技术中交代的，保持内皮细胞功能的完整性，在心血管系 统稳态调节中起重要作用，血管内皮细胞的损伤与多种心血管疾病(如动脉粥样硬化、高血压、血栓形成等)有密切的关系。
所述抗心血管病药物是以常春卫矛乙醇提取物为活性成分，辅以助剂加工为片剂、颗粒剂或胶囊。所提到的辅料为各种医药标准通用的药用辅料包括填充剂、矫味剂、润滑剂，防腐剂、稳定剂、增溶剂等，填充剂为糖粉、淀粉、糊精、羧甲基淀粉、磷酸氢钙及其他常用药用辅料；矫味剂为①包合剂(β-环糊精(β-CD)和N-LOK变性淀粉等具有包合作用的辅料)、②无糖甜味剂(甜菊糖和蛋白糖、木糖醇、高果糖及甜蜜素等甜味剂)；润滑剂为聚乙二醇、硬酯酸镁、滑石粉及具润滑作用的药用辅料，增溶剂如吐温80、聚氧乙烯氢化蓖麻油、丙二醇等，防腐剂如山苯甲酸钠、尼泊金酯系列等。
常春卫矛乙醇提取物的提取方法包括如下步骤：
称取常春卫矛药材切成粗段，药材加8-15倍的重量比为50％的乙醇，回流提取2次，每次1.5-4小时，将提取液过滤过200目筛，滤液浓缩成比重为1.08-1.13的浸膏，所得浸膏即为常春卫矛乙醇提取物。
本发明突出的实质性特点和显著的进步是：
本发明对常春卫矛乙醇提取物治疗心血管疾病的内在机理进行研究，并发明了其在保护血管内皮细胞氧化损伤中的功能，从而达到预防或治疗心血管疾病的功效，在临床中具有重大意义。
具体实施方式
实施例一 常春卫矛乙醇提取浸膏制备方法一
称取常春卫矛药材切成粗段，药材加8倍的重量比为50％的乙醇，回流提取2次，每次1.5小时，将提取液过滤过200目筛，滤液浓缩成比重为1.10的浸膏。
实施例二 常春卫矛乙醇提取浸膏制备方法二
称取常春卫矛药材切成粗段，药材加10倍的重量比为50％的乙醇，回流提取2次，每次2小时，将提取液过滤过200目筛，滤液浓缩成比重为1.08的浸膏。
实施例三 常春卫矛乙醇提取浸膏制备方法三
称取常春卫矛药材切成粗段，药材加15倍的重量比为50％的乙醇，回流提取2次，每次3小时，将提取液过滤过200目筛，滤液浓缩成比重为1.13的浸膏。
实施例四 常春卫矛乙醇提取浸膏制备方法四
称取常春卫矛药材切成粗段，药材加12倍的重量比为50％的乙醇，回流提取2次，每次4小时，将提取液过滤过200目筛，滤液浓缩成比重为1.13的浸膏。
实施例五 常春卫矛乙醇提物颗粒剂制备
取实施例1制备的浸膏，加入适量的淀粉、环糊精、制粒，筛分，低温干燥，即得粒径为1-2mm的常春卫矛颗粒制剂。
实施例六 常春卫矛乙醇提物片剂制备
取实施例2制备的浸膏，加入适量的淀粉、糊精、甜菊糖、硬脂酸镁，低温干燥，压制成片，包糖衣或薄膜衣，即得常春卫矛片剂制剂。
实施例七 常春卫矛醇提物胶囊制备
取实施例3制备的浸膏，加入适量的淀粉、糊精、甜菊糖、硬脂酸镁，混匀，制粒，筛分，低温干燥，装入胶囊，即得粒径小于1mm的常春卫矛胶囊制剂。
效果实施例
常春卫矛提取物对ECV304细胞氧化损伤的保护作用研究
1实验材料
1.1药物
常春卫矛乙醇提物浸膏，每g膏分别相当于25.5g生药量。由广西中医药大学附属制药厂提供。
1.2试剂
RPMI1640培养基(gibco公司)；胎牛血清(HyClone)；胰蛋白酶(Solarbio)；双抗(gibco公司)；SOD试剂盒、NO、NOS试剂盒(南京建成生物工程研究所)；四氮唑蓝MTT(SIGMA)；H2O2(南国药业)，Hochest染料(碧云天)。
1.3仪器
倒置显微镜(LEICA DMIRB)；二氧化碳培养箱(美国Thermo)；超净工作台(荷兰ClearAir公司)；离心机(德国Biofuge Stoctos公司)；连续波长酶标仪(上海科华实验系统有限公司，ST360)
2实验方法
2.1药物配制
分别称取常春卫矛乙醇提物浸膏0.1218g溶解于1mlDMSO溶液中，得121.8mg/ml母液，于4℃保存，正式试验以母液稀释成所需的浓度，控制DMSO的终浓度在0.05％以内。
2.2细胞培养
血管内皮细胞ECV-304细胞株培养于含10％胎牛血清和双抗1％的RPMI1640培养基中，在37℃、5％CO2培养箱中传代培养。
2.3常春卫矛各提取部位对正常ECV-304细胞生长情况的影响
取对数生长期细胞，将细胞以1×105个/ml的密度接种于96孔板中，每孔100μl，于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养。待细胞长满单层后，实验分为正常对照组、常春卫矛乙醇提取物5个浓度组、5个浓度组终浓度为25、50、100、200、400μg/ml，每组3个复孔。正常对照组加培养基，各药物组加相应终浓度的药物，继续在培养箱中培养24h，用MTT法测定细胞存活率。
2.4常春卫矛各提取部位对H2O2诱导氧化损伤ECV-304细胞生长情况的影响
取对数生长期ECV-304细胞，以5000cell/孔的密度接种于96孔板中，每孔100μl，于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养。待细胞长满单层后，将细胞分为正常对照组、模型组(H2O2终浓度为0.5mmol/L)，常春卫矛乙醇提物均设5个浓度组别(终浓度为25、50、100、200、400μg/ml)，每组3个复孔。正常对照组和模型组加培养基，药物组加相应浓度的药物，在培养箱中继续培养。24h后，去掉细胞上清液，细胞用PBS洗2遍，除空白组外，其余各组均加终浓度为0.5mmol/L的H2O2，在培养箱中继续孵育1h，然后用MTT法测定细胞存活率。
2.5常春卫矛各提取部位对氧化损伤内皮细胞分泌SOD、NO和NOS含量的影响
细胞处理方法见2.4，药物处理后，分别收集各组细胞上清液，按试剂盒说明分别测定SOD、NO和NOS的含量。
2.6Hochest3258染色观察细胞凋亡情况
取对数生长期细胞接种在6孔板上，药物处理方法见1.2.4,待细胞药物处理后，除去细胞培养基，用PBS洗3遍，预冷4％多聚甲醛固定，10min后弃除固定液，PBS洗3遍，每孔加0.4mlHochest33258染色液，染色10min后，弃除染色液，PBS洗3遍，荧光显微镜下(激发波长为350nm,发射波长为460nm)观察细胞形态变化，分别选取3个视野，计数100个细胞，并计算细胞凋亡率％＝凋亡细胞数/总的细胞数×100％，取3次结果的平均值。
2.7统计学方法
实验数据采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，计量数据以表示，两组间均 数比较用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
3结果
3.1常春卫矛各提取部位对正常ECV-304细胞生长情况的影响
由表1提示，常春卫矛乙醇提取部位在25～400ug/ml浓度范围内对正常ECV-304细胞生长无影响，与正常组比较无差异。
表1乙醇提取物对正常ECV-304细胞生长情况的影响
注：与正常对照组比较，*:P<0.05；**:P<0.01。
3.2常春卫矛各提取部位对H2O2诱导氧化损伤ECV-304细胞生长情况的影响
由表2提示，常春卫矛乙醇提取部位对H2O2诱导的氧化损伤ECV-304细胞存活率无明显提高作用。
表2乙醇提物对H2O2诱导氧化损伤ECV-304细胞生长情况的影响
注：与正常对照组比较，**:P<0.01；与模型组比较，△:P<0.05，△△:P<0.01。
3.3常春卫矛各提取部位对氧化损伤内皮细胞SOD、NOS、NO含量的影响
由表3提示，常春卫矛乙醇提取部位100、200、400ug/ml均能提高氧化损伤内皮细胞SOD水平，与模型组比较有显著差异；常春卫矛乙醇提取部位400ug/ml能提高氧化损伤内皮细胞NO水平，与模型组比较有显著差异。
表3乙醇提取物对氧化损伤内皮细胞SOD、NOS、NO含量的影响
注：与正常对照组比较，*:P<0.05；与模型组比较，△:P<0.05，△△:P<0.01。
3.4常春卫矛各提取部位对H2O2诱导氧化损伤ECV-304细胞凋亡的影响
表4提示，常春卫矛乙醇提取物能明显抑制H2O2诱导的ECV-304细胞凋亡，凋亡率与模型组比较有显著性差异，P<0.01。
表4乙醇提取物对正常ECV-304细胞氧化损伤ECV-304细胞凋亡的影响
注：与正常对照组比较，*:P<0.05；
常春卫矛乙醇提取物对H2O2诱导血管内皮细胞氧化损伤有一定保护。