本发明涉及一种利用人参内生真菌制备人参白茯苓发酵液的方法，属于日用化工
技术领域：
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背景技术：
：人参自古誉为“百草之王”“滋阴补生，扶正固本”之极品，含有多种人参皂苷和人参多糖以及维生素和氨基酸类。人参具有提高机体免疫力、降血脂、延缓衰老、清除自由基等多种作用。用于化妆品具有扩张皮肤毛细血管，促进皮肤血液循环，增加皮肤营养，调节皮肤水油平衡，防止皮肤脱水、硬化、起皱，人参活性物质抑制黑色素的还原性能，使皮肤洁白光滑，能增强皮肤弹性，使细胞获得新生。白茯苓为茯苓切去赤茯苓厚的白色部分，通常为中药饮片。白茯苓用于化妆品具有柔嫩肌肤、美白润泽之功效。目前已有的关于人参发酵液的专利大多是人参酒发酵或者利用乳酸菌等非植物内生真菌发酵，如专利CN102366373B是利用保加利亚乳酸菌对红参发酵获得美白效果更好的人参发酵液；如专利CN10239183B是利用乳酸菌对人参和无患子混合物发酵得到发酵液。本发明利用人参内生真菌，对人参和白茯苓复合物进行发酵得到的发酵液用于化妆品的应用。已有的专利主要研究对人参进行发酵，充分利用人参的活性成分，未能发挥真菌的次级代谢功能。本发明所解决的技术问题是筛选出能产生与人参活性成分相同或相似的内生真菌；按照一定比例复配人参和白茯苓经过灭菌之后作为发酵培养基；优化内生真菌发酵条件，得到发酵液。技术实现要素：针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种利用人参内生真菌制备人参白茯苓发酵液的方法。本发明是通过以下技术方案实现的：本发明提供一种利用人参内生真菌制备人参白茯苓发酵液的方法，其包括如下步骤：S1：用人参在内生菌诱导培养基中制备真菌；S2：分别用人参和步骤S1获得的真菌制备人参提取浸膏和真菌代谢产物浸膏，并利用所述人参提取浸膏和真菌代谢产物浸膏分离出目标菌株，该目标菌株为单孢被孢霉，可参见“人参内生真菌及其次生代谢产物研究”，第二军医大学，硕士论文，2009年6月。S3：利用所述目标菌株制备目标菌株种子液；S4：将所述目标菌株种子液接入由人参和白茯苓制备的发酵培养基中，在28～32℃下培养，得到所述人参白茯苓发酵液。作为优选方案，所述内生菌诱导培养基的制备方法为：将PDA固体培养基融化后倒入培养皿中，形成内生菌诱导培养基。作为优选方案，所述真菌的制备方法包括如下操作：将人参根经过预处理后作为培养组织接种于内生菌诱导培养基中，在28℃下培养7～10天，在培养的同时进行挑丝纯化，得到所述真菌。作为优选方案，所述预处理的方法为：取新鲜的人参根用自来水冲洗干净后，用去离子水洗3次；将清洗过的人参根切成1cm长的根段后按以下步骤进行表面消毒：75wt％乙醇浸泡30s、5wt％次氯酸钠浸泡30s、75wt％乙醇浸泡10s、无菌水冲洗3次；滤纸吸干水份，用灭过菌的手术刀将人参根段切成5mm厚片，作为培养组织。作为优选方案，所述真菌代谢浸膏的制备方法包括如下操作：将真菌接入PDA液体培养基中，摇床发酵15天，获得发酵液，用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得到真菌代谢产物浸膏。作为优选方案，所述人参提取浸膏的制备方法包括如下操作：将人参根用甲醇浸泡3天，减压浓缩得到人参提取浸膏。作为优选方案，所述目标菌株的分离方法包括如下操作：分别取真菌代谢产物浸膏和人参提取浸膏用甲醇溶解，薄层色谱检测比较得出两者成分相似的真菌作为目标菌株。薄层色谱检测方法为：硅胶板：G型硅胶板；展开剂：三氯甲烷：甲醇：水＝8:2:0.2；显色剂：硫酸和乙醇的混合液；人参提取浸膏作为标样，各真菌代谢产物浸膏为待测样品，分别用甲醇溶解后，用毛细管在硅胶板上点样，烘干，放入展开缸展开后，浸渍显色剂，烘烤显色比较各成分的比移值Rf大小，筛选出Rf相同的样品。Rf＝溶质移动距离/溶液移动距离。作为优选方案，所述发酵培养基的制备方法包括如下操作：分别将人参根和白茯苓切片，在40～50℃下干燥后粉碎，得到人参粉和白茯苓粉；将所述人参粉和白茯苓粉混匀后，加水分散，在120℃下进行灭菌，冷却至常温后得到发酵培养基。作为优选方案，所述人参粉和白茯苓粉的质量比为50:1～100:1。作为优选方案，所述水的加量为人参粉和白茯苓粉总重量的5～10倍。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：1、本发明利用人参内生真菌作为发酵真菌，发酵液中人参皂苷Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Rb2有不同程度的提高；2、本发明对人参和白茯苓发酵，获得的发酵液含有人参和白茯苓活性成分，美白、抗氧化活性比单一的人参发酵液更好。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。发酵用人参内生真菌的筛选取新鲜的人参根，自来水冲洗干净，用去离子水洗3次。将人参根切成1cm长的根段后按以下程序表面消毒：75wt％乙醇浸泡30s、5wt％次氯酸钠浸泡30s、75wt％乙醇浸泡10s、无菌水冲洗3次。滤纸吸干水份，用灭过菌的手术刀将根段切成5mm厚的，作为培养组织。在超净工作台中，每个PDA培养皿中接种4块人参组织，放进28℃培养箱中培养10天，每天观察培养皿中真菌生长状况，有新的菌丝生长出来时，挑取菌丝接入新的培养皿中培养，继续纯化，获得纯化后的真菌菌种。经过统计共获得内生真菌24株。将此24株内生真菌分别接入装有100mLPDA液体培养基的250mL锥形瓶中，摇床发酵15天，获得发酵液用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得到真菌代谢产物浸膏。将人参根用95wt％乙醇浸泡3天，减压浓缩得到人参提取浸膏，分别取少量真菌代谢产物浸膏和人参提取浸膏无水乙醇溶解，薄层色谱检测比较得出两者成分相似的真菌作为目标菌株。经过筛选发现菌株RC18菌株的次级代谢产物和人参的活性成分最相似，因此将菌株RC18作为目标菌株。实施例1本实施例涉及的一种利用人参内生真菌制备人参白茯苓发酵液的方法，包括如下步骤：将人参、白茯苓切成饮片在烘箱中45℃干燥24h，粉碎，取干燥后的人参粉末100g不添加白茯苓，按质量比添加6倍量的纯净水搅拌均匀，120℃高温灭菌30min。灭菌后，放至室温，在超净工作台中用移液枪接入6mL目标菌株RC18种子液，然后将发酵瓶在恒温培养箱中发酵10天。纱布过滤去掉发酵液中的菌丝体，将菌液用硅藻土过滤，用丁二醇和纯水稀释定容至1L。实施例2本实施例涉及的一种利用人参内生真菌制备人参白茯苓发酵液的方法，包括如下步骤：将人参、白茯苓切成饮片在烘箱中45℃干燥24h，粉碎，取干燥后的人参粉末100g按质量比人参：白茯苓＝50:1混合均匀后，添加6倍量的纯净水搅拌均匀，120℃高温灭菌30min。灭菌后，放至室温，在超净工作台中用移液枪接入6mL目标菌株RC18种子液，然后将发酵瓶在恒温培养箱中发酵10天。纱布过滤去掉发酵液中的菌丝体，将菌液用硅藻土过滤，用丁二醇和纯水稀释定容至1L。实施例3本实施例涉及的一种利用人参内生真菌制备人参白茯苓发酵液的方法，包括如下步骤：将人参、白茯苓切成饮片在烘箱中45℃干燥48h，粉碎，取干燥后的人参粉末100g按质量比人参：白茯苓＝75:1混合均匀后，添加8倍量的纯净水搅拌均匀，120℃高温灭菌30min。灭菌后，放至室温，在超净工作台中用移液枪接入8mL目标菌株RC18种子液，然后将发酵瓶在恒温培养箱中发酵12天。纱布过滤去掉发酵液中的菌丝体，将菌液用硅藻土过滤，用丁二醇和纯水稀释定容至1L。实施例4本实施例涉及的一种利用人参内生真菌制备人参白茯苓发酵液的方法，包括如下步骤：将人参、白茯苓切成饮片在烘箱中50℃干燥24h，粉碎，取干燥后的人参粉末100g按质量比人参：白茯苓＝100:1混合均匀后，添加10倍量的纯净水搅拌均匀，120℃高温灭菌30min。灭菌后，放至室温，在超净工作台中用移液枪接入10mL目标菌株RC18种子液，然后将发酵瓶在恒温培养箱中发酵14天。纱布过滤去掉发酵液中的菌丝体，将菌液用硅藻土过滤，用丁二醇和纯水稀释定容至1L。对比例1本对比例涉及的一种常规发酵液的制备方法，包括如下步骤：将人参切成饮片在烘箱中45℃干燥24h，粉碎，取干燥后的人参粉末100g，不添加白茯苓，添加6倍量的纯净水搅拌均匀，120℃高温灭菌30min。灭菌后，放至室温，在超净工作台中用移液枪接入6mL保加利亚乳酸菌种子液，然后将发酵瓶在恒温培养箱中发酵10天。纱布过滤去掉发酵液中的菌丝体，将菌液用硅藻土过滤，用丁二醇和纯水稀释定容至1L。对比例2本对比例涉及的另一种常规发酵液的制备方法，包括如下步骤：将白茯苓切成饮片在烘箱中45℃干燥24h，粉碎，取干燥后的白茯苓粉末100g，不添加人参，按质量比添加6倍量的纯净水搅拌均匀，120℃高温灭菌30min。灭菌后，放至室温，在超净工作台中用移液枪接入6mL目标菌株RC18种子液，然后将发酵瓶在恒温培养箱中发酵10天。纱布过滤去掉发酵液中的菌丝体，将菌液用硅藻土过滤，用丁二醇和纯水稀释定容至1L。比较分析人参皂苷的含量。以对比实施例发酵液为实验对照，实施例1为试验样品，利用高效液相色谱分析比较两种真菌发酵得到的发酵液中人参皂苷Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Rb2的含量。其结果如表1所示。HPLC分析条件建立：柱温：室温(25℃)，流速1.0mL/min，检测波长203nm。表1.人参皂苷含量如表1所示，实施例1中人参皂苷Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Rb2均比对比例1有所提高，说明人参内生真菌作为发酵真菌，获得的发酵液中人参皂苷含量更高。比较分析抑制酪氨酸酶活性实验材料：上述实施例制备获得的发酵液。酪氨酸酶抑制活性使用酶标仪检测。准确称取不同重量的人参发酵液和实施例1中发酵液用DMSO配置为不同的浓度。准确吸取配置好的不同浓度的人参发酵液和人参白茯苓发酵液，作为待测样品加入96孔板中，依次加入L-酪氨酸和pH6.8的磷酸缓冲液混合均匀，30℃水浴10min，加入酪氨酸酶混匀，迅速转移到比色皿中，测定475nm处的吸光度。L-酪氨酸为测试底物，待测样品为测试物。每个浓度3个重复，每个样品3个重复。以pH6.8的磷酸缓冲液作为空白对照。酪氨酸酶的抑制率计算公式如下：抑制率(％)＝{[(A-B)-(C-D)]/(A-B)}*100％；A：有底物无测试物时吸光度；B：空白对照的吸光度；C：有底物和测试物的吸光度；D：有测试物无底物的吸光度。实验结果如表2所示，可以看出实施例1与其它实施例比较对酪氨酸酶抑制率IC50值偏大，但差别不是很明显，说明发酵配方中添加白茯苓在一定程度上能增强发酵液的美白活性；实施例1酪氨酸酶抑制率IC50值明显比对比例1和对比例2小，说明本发明获得的发酵液比常规发酵液美白活性更好。表2：酪氨酸酶抑制率结果样品IC50(ug/mL)实施例1564.1实施例2509.8实施例3518.6实施例4534.5对比例1812.8对比例2695.4以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。当前第1页1 2 3