本发明属于医疗美容技术领域，具体涉及一种微自交联透明质酸冻干粉及其制备方法。
背景技术：
透明质酸 (hyaluronic acid，HA) 是一种酸性粘多糖，是由（1-β-4）D-葡萄糖醛酸和（1-β-3）N-乙酰基-D-氨基葡萄糖双糖重复单位所组成的直链多聚糖，广泛分布于脊椎动物的各种组织细胞间质中，在鸡冠、眼玻璃体、脐带、皮肤和滑液中含量较高。在链球菌的荚膜中也有分布。通过微生物发酵法制备的透明质酸钠是如下获取的：例如使用某种链球菌属培养，稀释得到的培养液经过各种提纯工序以粉末状来获取。
透明质酸可携带 500倍以上的水分，是一种效果优良的保湿成分，被称为理想的天然保湿因子。透明质酸、其盐类以及衍生物具有良 好的生物可吸收性、生物相容性、粘弹性和保水性，因此被广泛应用于美容、医药等领域。临床上，透明质酸可用于眼科手术、外科手术中预防术后粘连、促进伤口的愈合和美容整形等方面，把一些药物结合到透明质酸上形成的化合物还可以发挥药物控制缓释的作用，从而达到药物定时和定点释放的目的，但由于透明质酸存在降解速度快、机械强度较低等缺陷，而限制了其应用范围，因此在实际应用中，经常通过交联改性等方法使透明质酸分子内或分子间发生交联制备成为透明质酸水凝胶，从而延长其在生物体内的作用时间。
关于透明质酸交联水凝胶的制备已有专利报道。专利CN101538377A 公开了一种交联透明质酸凝胶的制备方法。该发明中，采用1，4-丁二醇二缩水甘油醚作为交联剂在碱性条件下与透明质酸中的羟基发生反应，再用生理平衡液清洗除去未反应的交联剂从而制备得到产品。但在反应过程中，有的丁二醇二缩水甘油醚只有一个环氧基团参与了反应，这些交联剂无法通过清洗除去，因此还会存在残留毒性的问题。专利CN101724164B 公开了一种制造交联透明质酸的方法。该方法中，使透明质 酸溶液在 10-30℃下进行交联反应超过48h。此低反应温度下进行的交联反应，所形成的交联透明质酸不会因碱的水解作用而快速劣化，在使交联剂消耗至合理的含量后即终止反应。方法中未除去残留的BDDE，会存在安全隐患。
透明质酸是分子量较大的多糖，具有很强的粘度，溶解过程要经过溶胀后，才能进一步溶解。透明质酸溶液粘度大，粉末状原料在配制时容易结块，使得中心部位的原料难以接触溶剂进行溶胀，导致整个溶解过程困难，即使是1%的溶液也需要长时间搅拌才能充分溶解，这在医疗护理实际应用上多有不便。
目前医疗领域主要使用的都是预先溶解好的透明质酸凝胶，这种形态的透明质酸存在生产过程要求高，成品的保质期短，生产成本高，交联剂清洗残留毒性的问题。自交联透明质酸通过在生物体内的条件下易于水解的酯键进行交联。若酯键水解则生成分子状的透明质酸。以凝胶预灌装形态保存是易发生水解，降低产品酯化交联度。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的问题，本发明目的在于在提供一种微自交联透明质酸冻干粉及其制备方法。
本发明通过以下技术方案加以实现：
所述的一种微自交联透明质酸冻干粉，其特征在于该冻干粉为含有微自交联透明质酸的白色疏松固体。
所述的一种微自交联透明质酸冻干粉，其特征在于微自交联透明质酸的自交联酯化度为0.01-0.10mol%，微自交联透明质酸的颗粒粘均分子量为50-300万。
所述的一种微自交联透明质酸冻干粉，其特征在于所述微自交联透明质酸的颗粒粘均分子量为80-200万。
所述的一种微自交联透明质酸冻干粉，其特征在于所述微自交联透明质酸的颗粒粘均分子量为120-150万。
所述的一种微自交联透明质酸冻干粉的制备方法，其特征在于采用以下方法制备：
1）将质量浓度为10%的盐酸溶液冷却到-10℃，投入到透明质酸中，在-10℃、200rpm的条件下震荡2小时，直至呈透明胶状，制得胶状混合物；
2）将步骤1）制得的胶状混合物为无菌条件下分装成2ml/瓶，然后放入到-25℃的冷冻干燥机中，保持48小时；
3）将步骤2）保持了48小时的胶状混合物，快速降温到-45℃进行冷冻，保持2小时；
4）将经过步骤3）冷冻后的胶状混合物升温到-25℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持36小时；
5）继续升温到-15℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持1.5小时；
6）继续升温到-10℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持3小时；
7）继续升温到0℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持3小时；
8）继续升温到25℃，于真空度≤10Pa的条件下，保持5小时，即得冻干粉成品。
所述的一种微自交联透明质酸冻干粉的制备方法，其特征在于步骤1）中透明质酸占透明质酸和盐酸总质量的5-15%。
所述的一种微自交联透明质酸冻干粉的制备方法，其特征在于步骤1）中透明质酸的分子量为50-300万。
所述的一种微自交联透明质酸冻干粉的制备方法，其特征在于步骤1）中透明质酸占透明质酸和盐酸总质量的10%。
本发明中的微自交联透明质酸冻干粉是指将透明质酸进行轻度自交联冷冻干燥得到的颗粒。此处，自交联透明质酸是指具有交联结构的透明质酸，通过透明质酸分子中的部分羧基与同一透明质酸分子的羟基或其它透明质酸分子的羟基进行自身酯键合，从而形成三维网状结构，不包括使用了化学交联剂、化学修饰剂等的交联透明质酸。
本发明自交联透明质酸的自交联酯化度为 0.01～0.10mol%。自交联透明质酸通过在生物体内的条件下易于水解的酯键进行交联，若酯键水解则生成分子状的透明质酸。从其美容保湿效果出发，水解生成的透明质酸的分子量（定义为一次分子量，用粘均分子量来表示）优选为120万左右，接近人体皮肤本身透明质酸分子量。另外，本发明的交联透明质酸即使制成高浓度，粘度也不会急剧上升，因此将交联透明质酸应用于美容浅表导入时，导入量可以更大，维持效果变变长。皮肤外部涂抹时，成膜性更好。
自交联酯化度的测定需要先将透明质酸的主链结构水解，进行低分子量化。此处，需要抑制自交联酯键的水解，因此利用仅选择性地水解自交联透明质酸的主链结构的透明质酸水解酶来进行水解处理，利用质子核磁共振法（NMR）测定化学位移的峰的积分值。具体而言，算出相当于酯交联部分（4.18ppm）的峰与相当于乙酰甲基（2.05ppm）的峰的面积比例，作为自交联酯化度。
本发明中，透明质酸可以从动物组织中提取，也可以通过发酵法来制造，无论来源均可使用。另外，透明质酸还可以包括其碱盐如钠、钾、锂盐的概念进行使用。自交联透明质酸可以通过使透明质酸浓度达到 5质量%以上的水以 及与透明质酸的羧基为等摩尔以上的酸成分共存，在低温下保持该共存状态而得到。对要与透明质酸共存的酸没有特别限定，可以使用公知的任何酸，优选比透明质酸强的酸，更优选无机酸。其中，特别优选常用挥发性的盐酸。
本发明通过在特定条件下，将透明质酸进行微自交联处理，通过冷冻干燥工艺将透明质酸制成松散固体，使产品通过酯化交联，具备一定交联透明质酸的抗降解性，固态保存，防止交联脂键水解，延长产品保存时间，溶解时间缩短。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步详述。
实施例1
一种微自交联透明质酸冻干粉，该冻干粉为含有微自交联透明质酸的白色疏松固体，微自交联透明质酸的自交联酯化度为0.01-0.10mol%，微自交联透明质酸的颗粒粘均分子量为145万。
微自交联透明质酸冻干粉的制备方法，其特征在于采用以下方法制备：1）将90g质量浓度为10%的盐酸溶液冷却到-10℃，投入到10g透明质酸中，在-10℃、200rpm的条件下震荡2小时，直至呈透明胶状，制得胶状混合物；2）将步骤1）制得的胶状混合物为无菌条件下分装成2ml/瓶，然后放入到-25℃的冷冻干燥机中，保持48小时；3）将步骤2）保持了48小时的胶状混合物，快速降温到-45℃进行冷冻，保持2小时；4）将经过步骤3）冷冻后的胶状混合物升温到-25℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持36小时；5）继续升温到-15℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持1.5小时；6）继续升温到-10℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持3小时；7）继续升温到0℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持3小时；8）继续升温到25℃，于真空度≤10Pa的条件下，保持5小时，即得冻干粉成品。
实施例2
一种微自交联透明质酸冻干粉，该冻干粉为含有微自交联透明质酸的白色疏松固体，微自交联透明质酸的自交联酯化度为0.01-0.10mol%，微自交联透明质酸的颗粒粘均分子量为145万。
微自交联透明质酸冻干粉的制备方法，其特征在于采用以下方法制备：1）将95g质量浓度为10%的盐酸溶液冷却到-10℃，投入到5g透明质酸中，在-10℃、200rpm的条件下震荡2小时，直至呈透明胶状，制得胶状混合物；2）将步骤1）制得的胶状混合物为无菌条件下分装成2ml/瓶，然后放入到-25℃的冷冻干燥机中，保持48小时；3）将步骤2）保持了48小时的胶状混合物，快速降温到-45℃进行冷冻，保持2小时；4）将经过步骤3）冷冻后的胶状混合物升温到-25℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持36小时；5）继续升温到-15℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持1.5小时；6）继续升温到-10℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持3小时；7）继续升温到0℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持3小时；8）继续升温到25℃，于真空度≤10Pa的条件下，保持5小时，即得冻干粉成品。
实施例3
一种微自交联透明质酸冻干粉，该冻干粉为含有微自交联透明质酸的白色疏松固体，微自交联透明质酸的自交联酯化度为0.01-0.10mol%，微自交联透明质酸的颗粒粘均分子量为145万。
微自交联透明质酸冻干粉的制备方法，其特征在于采用以下方法制备：1）将85g质量浓度为10%的盐酸溶液冷却到-10℃，投入到15g透明质酸中，在-10℃、200rpm的条件下震荡2小时，直至呈透明胶状，制得胶状混合物；2）将步骤1）制得的胶状混合物为无菌条件下分装成2ml/瓶，然后放入到-25℃的冷冻干燥机中，保持48小时；3）将步骤2）保持了48小时的胶状混合物，快速降温到-45℃进行冷冻，保持2小时；4）将经过步骤3）冷冻后的胶状混合物升温到-25℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持36小时；5）继续升温到-15℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持1.5小时；6）继续升温到-10℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持3小时；7）继续升温到0℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持3小时；8）继续升温到25℃，于真空度≤10Pa的条件下，保持5小时，即得冻干粉成品。
实施例4
一种微自交联透明质酸冻干粉，该冻干粉为含有微自交联透明质酸的白色疏松固体，微自交联透明质酸的自交联酯化度为0.01-0.10mol%，微自交联透明质酸的颗粒粘均分子量为145万。
微自交联透明质酸冻干粉的制备方法，其特征在于采用以下方法制备：1）将90g质量浓度为10%的盐酸溶液冷却到-10℃，投入到10g透明质酸中，在-10℃、200rpm的条件下震荡2小时，直至呈透明胶状，制得胶状混合物；2）将步骤1）制得的胶状混合物为无菌条件下分装成2ml/瓶，然后放入到-25℃的冷冻干燥机中，保持48小时；3）将步骤2）保持了48小时的胶状混合物，快速降温到-45℃进行冷冻，保持2小时；4）将经过步骤3）冷冻后的胶状混合物升温到-25℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持36小时；5）继续升温到-15℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持1.5小时；6）继续升温到-10℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持3小时；7）继续升温到0℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持3小时；8）继续升温到25℃，于真空度≤10Pa的条件下，保持5小时，即得冻干粉成品。
实施例5
一种微自交联透明质酸冻干粉，该冻干粉为含有微自交联透明质酸的白色疏松固体，微自交联透明质酸的自交联酯化度为0.01-0.10mol%，微自交联透明质酸的颗粒粘均分子量为145万。
微自交联透明质酸冻干粉的制备方法，其特征在于采用以下方法制备：1）将90g质量浓度为10%的盐酸溶液冷却到-10℃，投入到10g透明质酸中，在-10℃、200rpm的条件下震荡2小时，直至呈透明胶状，制得胶状混合物；2）将步骤1）制得的胶状混合物为无菌条件下分装成2ml/瓶，然后放入到-25℃的冷冻干燥机中，保持48小时；3）将步骤2）保持了48小时的胶状混合物，快速降温到-45℃进行冷冻，保持2小时；4）将经过步骤3）冷冻后的胶状混合物升温到-25℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持36小时；5）继续升温到-15℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持1.5小时；6）继续升温到-10℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持3小时；7）继续升温到0℃，于真空度≤15Pa的条件下，保持3小时；8）继续升温到25℃，于真空度≤10Pa的条件下，保持5小时，即得冻干粉成品。
实施例1-5所制备的冻干粉成品外观比较，见表1。
表1
检测实施例1-5和比较例的体外细胞毒性，结果见表2。
表2
其中，体外细胞毒性测试 根据EN ISO10993—5:2009《医疗器械的生物学评价-第五部分：体外细胞毒性试验》标准，检测细胞增值率。比较例1为通过商业渠道购买的用BDDE交联的医药级用品。
具体检测方法如下：
1、将待检测样品用生理盐水溶解，透明质酸浓度20mg/ml，比较例为凝胶直接进行检测。将待检样品和RPMI1460培养液按0.2g/ml混合，放置于37℃,5%二氧化碳孵箱中浸提72小时，用0.22um微孔滤膜过滤除菌，得到浸提液。
2、将1×105个/ml的L929细胞悬浮液接种于96孔细胞培养板，放置于37℃二氧化碳培养箱中培养24小时，待细胞贴壁生长后，去除上清液，分成对照组和实验组两组。
3、对照组加入RPMI1460培养液，实验组加入含50%上述浸提液的RPMI1460培养液，将两组分别放置于37℃二氧化碳培养箱中继续培养，48小时后取出。培养板 每孔加入5mg/ml的MTT溶液20uL，于37℃继续培养4小时，终止培养。
4、小心吸取孔内培养上清液，每孔加入200uL的DMSO，震荡10分钟混匀后，用酶联免疫检测仪在630nm下分别测定其吸光值。
5、根据下面的公式计算细胞相对增值率（RCR），RCR%=（实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值）×100%。
6、细胞相对增值率（RCR）和细胞毒性分级关系：
RCR不小于100%，细胞毒性分级为0级；
RCR为75-99%，细胞毒性分级为1级；
RCR为50-74%，细胞毒性分级为2级；
RCR为25-49%，细胞毒性分级为3级；
RCR为1-24%，细胞毒性分级为4级；
RCR为0%，细胞毒性分级为5级；
用上述方法测得的细胞相对增值率判断样品的生物相容性，RCR越大，表明检测样品的生物相容性越好。
酶降解率的比较，见表3。
表3
其中，比较例1为通过商业渠道购买的用交联的医药级用品，比较例2为通过商业渠道购买的非交联凝胶美容用品。
具体检测方法如下：
1、将待检测样品，用PBS稀释至透明质酸浓度为4mg/ml，作为待试品。
2、取1g待试品，加50U 1ml透明质酸酶液震荡1分钟，于37℃水浴中24小时，然后100℃煮沸10分钟灭活。
3、滤液经0.45um微孔滤膜抽滤，然后用PBS定容至10ml。
4、采用改良咔脞显色法测定糖醛酸含量，乘以2.07后折算加入酶液样品中的透明质酸含量W1，未加酶液样品中的透明质酸含量为W2,计算酶降解率=W1/W2×100%。
用上述方法检测的酶降解率判断透明质酸抗酶降解性。酶降解率越低，表明抗酶降解性能越好，在体内停留时间越长。
溶解性及可注射性的比较，见表4。
表4
其中，比较例1为通过商业渠道购买的用交联的医药级用品，比较例3为通过商业渠道购买的120万分子量的药用级透明质酸原料粉末。
实施例和比较例3用生理盐水溶解至溶胀平衡，透明质酸含量为15mg/ml，作为待检样品，并记录溶解时间。
注射性检测方法：将1ml交联透明质酸组合物填充到内径0.45cm的注射器
中，安装32G的水光注射针头。使用挤出压力测定仪在温度为 25℃、速度为 50mm/分钟的吐出条件下，测定各样品施加于该注射器的压力。