一种抗肿瘤的纳米颗粒药物的制备方法与流程

本发明涉及纳米药物领域，具体涉及一种抗肿瘤的纳米颗粒药物及其制备方法。

背景技术：

恶性肿瘤是目前危害人类健康的几个主要慢性病之一，早期发现，早期诊断和早期治疗仍是防控肿瘤的最有效手段，遗憾的是目前临床接诊的多为中晚期患者。由于其病因病理及发病机制等各方面情况尚未完全阐明，故现今治疗恶性肿瘤的三大手段(放疗、化疗及手术)对绝大多数肿瘤还不能治愈，因此各种新型治疗手段层出不穷，如介入微创治疗、生物靶向治疗、生物免疫治疗等等，但都未能取得突破性的进展。因此不断探索新的治疗方法是临床和科研工作者的目标和责任。

实现这一目标目前最热的研究路径之一是基于精准医学的靶向治疗，但癌细胞具有非常显著的基因不稳定性，因此在包括化疗及靶向治疗过程中，癌细胞可以通过不断的“进化”，获得耐药性或者抗药性，最终导致治疗的失败；另一个研发热点是免疫靶向治疗如针对PD-1及PD-L1靶点，但由于肿瘤微环境的免疫抑制屏障在阻碍疗效的发挥，实现这一目标的另一个可能途径是通过破坏肿瘤生存生长及侵润转移的肿瘤微环境达到控制肿瘤的进展甚至治愈肿瘤成为可能。

肿瘤的癌巢及癌周有大量的炎症细胞侵润，是一个慢性炎症微环境，且此种炎症持久而不会消退，因此肿瘤可称得上是机体“一道永不愈合的伤口”。这些炎症细胞包括巨噬细胞、髓系来源抑制细胞、调节性树突状细胞、Treg细胞、淋巴细胞等，巨噬细胞是浸润的炎细胞的主要和关键成分，有些情况下占到实体肿瘤细胞的50％～80％，在几乎所有的原发和转移肿瘤中，不论是肿瘤发生的早期还是晚期，都有巨噬细胞的浸润，巨噬细胞来源于骨髓CD34的祖细胞，祖细胞不断分裂增殖、分化成前单核细胞释放到外周血进一步分化成单核细胞，单核细胞受肿瘤细胞释放的催化因子(如CC趋化因子配体(CCL)、血管内皮生长因子(VEGF)、集落刺激因子(CSF)和胎盘来源的生长因子(PIGF)、H₂O₂等)作用，穿越血管壁，到达局部组织，在肿瘤局部特殊的微环境(缺氧、高乳酸、IL-10等)作用下发育成为功能与正常巨噬细胞不同的特殊类型巨噬细胞，我们现在又称之为M2巨噬细胞，临床观察屡屡证明肿瘤组织中，M2巨噬细胞密度与肿瘤患者的淋巴结转移、临床预后等有密切的关系为独立的预后因素体。

M2巨噬细胞对肿瘤的发展、侵袭和转移等多个关键环节都有极其重要的作用，表现在：1、其通过促进新生血管生成；2、促进肿瘤细胞淋巴管转移；3、高表达吲哚胺加双氧酶消耗肿瘤微环境中的色氨酸，抑制T细胞的激活；4、上调并分泌基质金属蛋白酶及分泌IL-4，诱导组织蛋白酶的活化，破坏基底膜，从而增强肿瘤的侵袭能力参与免疫抑制；5、通过分泌TNF-α、IL-10等免疫抑制因子，不仅诱导Treg细胞的形成，促使Th1向Th2“漂移”诱导，而且诱导抗原特异性免疫抑制因子B7-H4的表达，从而抑制T细胞功能等。

综上情况，不断有学者提出可从抑制肿瘤组织巨噬细胞的募集和生存、抑制巨噬细胞的促血管生成和组织重塑作用、杀灭肿瘤中定植的巨噬细胞等方面探索肿瘤治疗的新方法，形成针对肿瘤相关巨噬细胞的抗肿瘤新策略。

遗憾的是迄今为止，尚未有成熟的药物或者专利产品(或技术)面试，采用纳米技术，携带治疗元素，靶向到癌巢的巨噬细胞，一方面杀灭M2巨噬细胞从而破坏癌细胞赖以生存的微环境，另一方面将治疗元素引入到肿瘤部位杀灭癌细胞，将是一个新的思路和方法。但目前纳米技术存在有，制备的纳米材料靶向性不佳，纳米粒在体内不能较好的到达肿瘤部位发挥作用；纳米粒需要携带治疗药物(如化学药品)才能发挥抗肿瘤治疗效果，但纳米粒负载的药物量有一定的限度，负载之后纳米性状也会发生较大变化；纳米粒携带的药物在实际应用的各个环节(如体外溶解、体内循环)有不断脱落丢失的情况等问题。

M2巨噬细胞上有丰富的甘露糖受体(MR)表达，在正常细胞表达极少，国外研究证实，甘露糖化的聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸(PLL)及脂质体可将基因成功递送至树突状细胞和巨噬细胞用于治疗炎症和肿瘤，取得一定效果。

咪唑基团具有抑制肿瘤作用，机制在于其可抑制了甲羟戊酸生物合成途径中的关键酶法尼基焦磷酸合酶，抑制该途径的中间产物的产生，影响了GTP结合酶的异戊烯化，进而影响下游的信号传导，抑制细胞存活、黏附和转移、血管形成，促使M2巨噬细胞转化为抑制肿瘤的M1巨噬细胞。双磷酸盐如依替磷酸的基本分子结构为“C-P-C”，这一类化合物在自然界中并不存在，其在细胞内能够三齿螯合Zn²⁺离子从而抑制基质金属蛋白酶降低肿瘤的侵袭力；同时该结构在细胞内由于不能降解而形成“AppCp”，导致细胞凋亡。但是双磷酸盐类药物尽管在体外实验中发现有明显的抗肿瘤作用，但在体内经静脉输注后24h内，很快聚集到骨骼，其余部分(44±18％)经肾脏排泄至尿中，因此难以发挥对实体肿瘤的治疗效果。

本项目研发的纳米粒药物在构思和设计上采取通过化学修饰，将能靶向到M2巨噬细胞和具有细胞凋亡作用的基团，既甘露糖、咪唑和依替磷酸，引入到纳米粒的核壳及核心，在不需要另外负载药物的情况下，既通过破坏肿瘤细胞赖以生存的微环境，又使具有细胞凋亡作用的药物在肿瘤局部形成高浓度，达到治疗效果，通过国内外的文献检索和查新，未见到类似报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种以依替膦酸为核心，由依替膦酸与经咪唑和甘露糖两个基团修饰后的羧甲基壳聚糖通过离子交联法制备纳米粒的方法，通过靶向到肿瘤病灶部位大量存在的M2巨噬细胞，并使其凋亡而干预肿瘤赖以生存的微环境，发挥抗恶性肿瘤的治疗效果，以解决了纳米在治疗恶性肿瘤上的靶向性，和避免了纳米粒的药物包封率，并简化抗肿瘤纳米粒药物制备的步骤；由于本发明不是采用化疗药物发挥抗肿瘤作用，因此在治疗恶性肿瘤的同时不会产生类似化疗药物的毒副作用。

本发明实现其发明目的采用的技术方案为：

一种抗肿瘤的纳米颗粒药物的制备方法，包括以下步骤：

1、合成咪唑及甘露糖修饰的羧甲基壳聚糖

(1)：配置吗啉乙磺酸(MES)缓冲液：将MES溶于蒸馏水，配置成浓

度5～50mg/ml，用NaOH将pH值调至4～7；

(2)：配置O-CMC溶液：取羧甲基壳聚糖(O-CMC)加入到步骤1配浓度为1～10mg/ml O-CMC溶液；

(3)：取α-D-吡喃甘露糖-4-氨基苯基苷(MAN)加入到步骤1配置的MES缓冲液中，搅拌至清澈透明，得到浓度1～10mg/ml的MAN溶液；

(4)：将步骤2配置的溶液100ml与步骤3配置的溶液10～100ml混合，并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)70.4～704mg及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)7～70mg混合搅拌，温度15～95℃，搅拌至液体完全蒸发，得到白色粉末；

(5)：将步骤1配置的MES缓冲液100ml加入到步骤4得到的白色粉末中，室温搅拌至完全溶解；

(6)：取1-(3-氨基丙基)咪唑加入到步骤1配置的MES缓冲液中，搅拌至清澈透明，得到浓度为1～10mg/ml的1-(3-氨基丙基)咪唑溶液；

(7)：将步骤5所得溶液100ml与步骤6所得溶液10～100ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)152.8～1528mg及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)15.3～153mg混合搅拌温度30℃，搅拌至液体完全蒸发，得到白色粉末；

(8)：将步骤7所得的白色粉末加入到蒸馏水中，室温搅拌至完全溶解，经滤纸过滤，并清洗留下的沉淀3次，收集液体放入分子截留量800的透析袋中，双蒸水透析7天后，将透析袋内液体冷冻干燥，得到白色粉末即咪唑及甘露糖修饰的羧甲基壳聚糖(I，M-OCMC)；

(9)：将步骤8所得的I，M-OCMC取100mg溶于25～100ml蒸馏水中，

在室温下，以400转/分的速度，搅拌30min，配置成1～4mg/ml的I，M-OCMC

溶液，将搅拌后的溶液，滴入冰乙酸将pH值调至6，得到I，M-OCMC溶液；

2、反应产生纳米粒：

(10)取依替膦酸二钠溶于蒸馏水中蒸馏水，配置浓度1～4mg/ml的依替磷酸二钠溶液，室温搅拌至清澈透明，取步骤9制备好的I，M-OCMC溶液在室温下，以200～800转/分的速度进行搅拌，在搅拌的过程中，按I，M-OCMC：依替膦酸二钠质量比1：1～4：1的不同比值，恒速滴入制备好的依替膦酸二钠溶液，并继续在室温下，以200～800转/分的速度搅拌15～30分钟；

(11)将搅拌后的产物放入透析袋中，并放入已加入100ml双蒸馏水的烧杯中，以100转/分的速度进行搅拌透析，每隔4小时换一次双蒸馏水溶液，透析24～48小时后，将所得产物在-80℃的环境下经行冷冻真空干燥，获得纳米颗粒粉末，将粉末溶于50ml双蒸水中，采用仪器AKTApurifier蛋白纯化系统，柱子为QXL1ML，进行过柱，取过柱的液体冷冻干燥，得到咪唑及甘露糖修饰的羧甲基壳聚糖依替磷酸复合物纳米颗粒药物。

本发明的原理为：

利用α-D-吡喃甘露糖-4-氨基苯基苷(CAS：34213-86-0)的-NH₂与羧甲基壳聚糖的-COOH通过酰胺化反应发生枝接，从而使甘露糖稳定的键合在羧甲基壳聚糖分子上；利用1-(3氨基丙基)咪唑的-NH₂与羧甲基壳聚糖的-COOH通过酰胺化反应发生枝接，从而使甘露糖稳定的键合在羧甲基壳聚糖分子上，枝接后的羧甲基壳聚糖分子由于含有大量的-NH₂，在酸性溶液中质子化形成带正电的氨基(-NH3⁺)，依替膦酸分子上有多个羟基(-OH)，碱化后形成负电基团(-O^-)，与壳聚糖分子内大量的-NH3⁺形成分子间的交联，通过控制反应条件(浓度比、质量比和pH值等)形成纳米粒。该纳米粒抗肿瘤的可能机理为：

由于M2巨噬细胞大量表达甘露糖受体，机体正常细胞没有表达或者很少表达，而在肿瘤患者体内M2巨噬细胞主要分布在癌周和癌巢，是多种肿瘤病灶区域的主要细胞，可保证纳米粒的有效靶向。而且该细胞通过①促进新生血管生成和肿瘤淋巴管转移、②诱导组织蛋白酶活化增强肿瘤的侵袭能力、③诱导Treg细胞的形成、分泌多种免疫抑制因子、诱导抗原特异性免疫抑制因子B7-H4的表达和使Th1向Th2“漂移”，从而抑制T细胞的激活和参与肿瘤的免疫抑制等，在多个关键环节参与和主导了肿瘤的发展、侵袭与转移。该纳米粒在设计上采用咪唑基团和依替磷酸为治疗效应分子，能够：①抑制法尼基焦磷酸合酶导致异戊烯焦磷酸大量蓄积致使细胞凋亡；②三齿螯合Zn²⁺离子抑制基质金属蛋白酶降低肿瘤的侵袭力；③在细胞内形成ATP类似物“AppCp”导致细胞凋亡。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

与现有的通过壳聚糖与三聚磷酸钠或者采用羧甲基壳聚糖与氯化钙等通过离子交联法结合制备纳米，再负载药物发挥抗肿瘤治疗作用相比，本发明采用经咪唑基团和甘露糖基团修饰后的羧甲基壳聚糖与依替膦酸，通过离子交联法制得纳米，该纳米本身带有的咪唑基团和依替膦酸能够引发细胞凋亡，因此不用再负载药物既可发挥抗肿瘤作用，同时简化了制备流程，避免了纳米粒携带药物后存在的包封率问题，制得的纳米粒粒径可控，在几十到1000纳米之间，甘露糖作为靶向材料可引导纳米粒到达肿瘤部位，被肿瘤相关性巨噬细胞(包括M2巨噬细胞、未成熟树突状细胞)吞噬后，在局部及以胞内释放出依替膦酸和咪唑，发挥细胞杀灭作用，从而实现靶向性的抗癌效果。通过动物实验可以观察到该纳米粒具有肿瘤靶向性和有抗肿瘤和抑制转移作用。

附图说明

图1：咪唑及甘露糖修饰的壳聚糖MRI图谱；

图2：本发明实施例1制备的纳米颗粒药物；

图3：本发明实施例2制备的纳米颗粒药物；

图4：本发明实施例3制备的纳米颗粒药物；

图5：本发明实施例4制备的纳米颗粒药物。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不限定于本发明。

实施例1

1、合成咪唑及甘露糖修饰的羧甲基壳聚糖

步骤1：配置吗啉乙磺酸(MES)缓冲液：取MES6g，蒸馏水300ml，配置浓度为5mg/ml，用NaOH将pH值调至4，

步骤2：取羧甲基壳聚糖(O-CMC)100mg加入到步骤1配置的MES缓冲液100ml中，搅拌至清澈透明，得到浓度为1mg/ml O-CMC溶液，

步骤3：取α-D-吡喃甘露糖-4-氨基苯基苷(MAN)加入到步骤1配置的MES缓冲液中，搅拌至清澈透明，得到浓度1mg/ml的MAN溶液，

步骤4：将步骤2配置的溶液100ml与步骤3配置的溶液10ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)70.4mg及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)7mg混合搅拌，温度15℃，搅拌至液体完全蒸发，得到白色粉末，

步骤5：将步骤1配置的MES缓冲液100ml加入到步骤4得到的粉末中，室温搅拌至完全溶解，

步骤6：取1-(3-氨基丙基)咪唑100mg加入到步骤1配置的MES缓冲液100ml中，搅拌至清澈透明，得到浓度为1mg/ml的1-(3-氨基丙基)咪唑溶液，

步骤7：将步骤5所得溶液100ml与步骤6所得溶液10ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)152.8mg及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)15.3mg混合搅拌温度30℃，搅拌至液体完全蒸发，得到白色粉末，

步骤8：将20ml蒸馏水加入步骤7中的白色粉末中，室温搅拌至完全溶解，经滤纸过滤，并清洗留下的沉淀3次，收集液体放入分子截留量800的透析袋中，双蒸水透析7天后，将透析袋内液体冷冻干燥，得到白色粉末即咪唑及甘露糖修饰的羧甲基壳聚糖(I，M-OCMC)，

步骤9：将步骤8所得的I，M-OCMC取100mg溶于25ml蒸馏水中，在室温下，以400转/分的速度，搅拌30min，配置成1mg/ml的I，M-OCMC溶液，将搅拌后的溶液滴入冰乙酸将pH值调至6，得到I，M-OCMC溶液。

2、反应产生纳米粒

取依替膦酸二钠溶于蒸馏水中，配置浓度为1mg/ml的依替膦酸二钠溶液，室温搅拌至清澈透明，取步骤9制备好的I，M-OCMC溶液20ml在室温下，以400转/分的速度进行搅拌。在搅拌的过程中，按I，M-OCMC：依替膦酸二钠质量比1:1的比值，恒速滴入制备好的依替膦酸二钠溶液，并继续在室温下，以200转/分的速度搅拌15分钟，将搅拌后的产物放入透析袋中，并放入已加入100ml双蒸馏水的烧杯中，

以100转/分的速度进行搅拌透析，每隔4小时换一次双蒸馏水溶液，透析24小时后，将所得产物在-80℃的环境下经行冷冻真空干燥，获得纳米颗粒粉末，将粉末溶于50ml双蒸水中，采用仪器AKTApurifier蛋白纯化系统，柱子为QXL1ML，进行过柱，取过柱的液体冷冻干燥，得到咪唑及甘露糖修饰的羧甲基壳聚糖依替磷酸复合物纳米颗粒。

实施例2

1、合成咪唑及甘露糖修饰的羧甲基壳聚糖

步骤1：配置吗啉乙磺酸(MES)缓冲液：取MES溶于蒸馏水中，配置浓度为50mg/ml，用NaOH将pH值调至7，

步骤2：取羧甲基壳聚糖(O-CMC)加入到步骤1配置的MES缓冲液中，搅拌至清澈透明，配置得到浓度为10mg/ml O-CMC溶液，

步骤3：取α-D-吡喃甘露糖-4-氨基苯基苷(MAN)加入到步骤1配置的MES缓冲液中，搅拌至清澈透明，配置得到浓度10mg/ml的MAN溶液，

步骤4：将步骤2配置的溶液100ml与步骤3配置的溶液100ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)704mg及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)70mg混合搅拌，温度95℃，搅拌至液体完全蒸发，得到白色粉末，

步骤5：将步骤1配置的MES缓冲液100ml加入到步骤4得到的粉末中，室温搅拌至完全溶解，

步骤6：取1-(3-氨基丙基)咪唑加入到步骤1配置的MES缓冲液中，搅拌至清澈透明，得浓度为10mg/ml的1-(3-氨基丙基)咪唑溶液，

步骤7：将步骤5所得溶液100ml与步骤6所得溶液100ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)1528mg及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)153mg混合搅拌温度30℃，搅拌至液体完全蒸发，得到白色粉末，

步骤8：将100ml蒸馏水加入步骤7中的白色粉末中，室温搅拌至完全溶解，经滤纸过滤，并清洗留下的沉淀3次，收集液体放入分子截留量800的透析袋中，双蒸水透析7天后，将透析袋内液体冷冻干燥，得到白色粉末即咪唑及甘露糖修饰的羧甲基壳聚糖(I，M-OCMC)，

步骤9：将步骤8所得的I，M-OCMC取100mg溶于25ml蒸馏水中，在室温下，以400转/分的速度，搅拌30min，配置成4mg/ml的I，M-OCMC溶液。将搅拌后的溶液，滴入冰乙酸将PH值调至6，得到I，M-OCMC溶液；

2、反应产生纳米粒

取依替膦酸二钠溶于蒸馏水中，配置浓度4mg/ml的依替磷酸二钠溶液，室温搅拌至清澈透明。取步骤9制备好的I，M-OCMC溶液100ml在室温下，以200转/分的速度进行搅拌。在搅拌的过程中，按I，M-OCMC：依替膦酸二钠质量比4：1的比值，恒速滴入制备好的依替膦酸二钠溶液，并继续在室温下，以800转/分的速度搅拌15分钟，

将搅拌后的产物放入透析袋中，并放入已加入100ml双蒸馏水的烧杯中，以100转/分的速度进行搅拌透析，每隔4小时换一次双蒸馏水溶液。透析48小时后，将所得产物在-80℃的环境下经行冷冻真空干燥，获得纳米颗粒粉末，将粉末溶于50ml双蒸水中，采用仪器AKTApurifier蛋白纯化系统，柱子为QXL1ML，进行过柱，取过柱的液体冷冻干燥，得到咪唑及甘露糖修饰的羧甲基壳聚糖依替磷酸复合物纳米颗粒。

实施例3

1、合成咪唑及甘露糖修饰的羧甲基壳聚糖

步骤1：配置吗啉乙磺酸(MES)缓冲液：取MES用蒸馏水配置成浓度25mg/ml，用NaOH将pH值调至6，

步骤2：取羧甲基壳聚糖(O-CMC)加入到步骤1配置的MES缓冲液中，搅拌至清澈透明，得到浓度为5mg/ml O-CMC溶液，

步骤3：取α-D-吡喃甘露糖-4-氨基苯基苷(MAN)加入到步骤1配置的MES缓冲液中，搅拌至清澈透明，得到浓度5mg/ml的MAN溶液，

步骤4：将步骤2配置的溶液100ml与步骤3配置的溶液50ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)704mg及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)70mg混合搅拌，温度15℃，搅拌至液体完全蒸发，得到白色粉末，

步骤5：将步骤1配置的MES缓冲液100ml加入到步骤4得到的粉末中，室温搅拌至完全溶解，

步骤6：取1-(3-氨基丙基)咪唑加入到步骤1配置的MES缓冲液中，搅拌至清澈透明，得到浓度为5mg/ml的1-(3-氨基丙基)咪唑溶液，

步骤7：将步骤5所得溶液100ml与步骤6所得溶液50ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)764mg及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)76.4mg混合搅拌温度30℃，搅拌至液体完全蒸发，得到白色粉末，

步骤8：将50ml蒸馏水加入步骤7中的白色粉末中，室温搅拌至完全溶解，经滤纸过滤，并清洗留下的沉淀3次，收集液体放入分子截留量800的透析袋中，双蒸水透析7天后，将透析袋内液体冷冻干燥，得到白色粉末即咪唑及甘露糖修饰的羧甲基壳聚糖(I，M-OCMC)，

步骤9：将步骤8所得的I，M-OCMC取100mg溶于50ml蒸馏水中，在室温下，以400转/分的速度，搅拌30min，配置成2.5mg/ml的I，M-OCMC溶液，将搅拌后的溶液，滴入冰乙酸将pH值调至6，得到I，M-OCMC溶液；

2、反应产生纳米粒

取依替膦酸二钠溶于蒸馏水中蒸馏水，配置浓度2.5mg/ml的依替磷酸二钠溶液，室温搅拌至清澈透明，取步骤9制备好的I，M-OCMC溶液100ml在室温下，以600转/分的速度进行搅拌，在搅拌的过程中，按I，M-OCMC：依替膦酸二钠质量比3：1的比值，恒速滴入制备好的依替膦酸二钠溶液，并继续在室温下，以500转/分的速度搅拌20分钟；

将搅拌后的产物放入透析袋中，并放入已加入100ml双蒸馏水的烧杯中，以100转/分的速度进行搅拌透析，每隔4小时换一次双蒸馏水溶液，透析30小时后，将所得产物在-80摄氏度的环境下经行冷冻真空干燥，获得纳米颗粒粉末。将粉末溶于50ml双蒸水中，采用仪器AKTApurifier蛋白纯化系统，柱子为QXL1ML，进行过柱，取过柱的液体冷冻干燥，得到咪唑及甘露糖修饰的羧甲基壳聚糖依替磷酸复合物纳米颗粒。

实施例4

1、合成咪唑及甘露糖修饰的羧甲基壳聚糖

步骤1：配置吗啉乙磺酸(MES)缓冲液：取MES6g，蒸馏水300ml，配置浓度20mg/ml，用NaOH将pH值调至5.2，

步骤2：取羧甲基壳聚糖(O-CMC)100mg加入到步骤1配置的MES缓冲液100ml中，搅拌至清澈透明，得到浓度为3mg/ml O-CMC溶液，

步骤3：取α-D-吡喃甘露糖-4-氨基苯基苷(MAN)100mg加入到步骤1配置的MES缓冲液100ml中，搅拌至清澈透明，得到浓度4mg/ml的MAN溶液，

步骤4：将步骤2配置的溶液100ml与步骤3配置的溶液20ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)140.8mg及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)14mg混合搅拌，温度30℃，搅拌至液体完全蒸发，得到白色粉末，

步骤5：将步骤1配置的MES缓冲液100ml加入到步骤4得到的粉末中，室温搅拌至完全溶解，

步骤6：取1-(3-氨基丙基)咪唑加入到步骤1配置的MES缓冲液100ml中，搅拌至清澈透明，配置浓度为6mg/ml的1-(3-氨基丙基)咪唑溶液，

步骤7：将步骤5所得溶液100ml与步骤6所得溶液30ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)457mg及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)45.7mg混合搅拌温度75℃，搅拌至液体完全蒸发，得到白色粉末，

步骤8：将20ml蒸馏水加入步骤7中的白色粉末中，室温搅拌至完全溶解，经滤纸过滤，并清洗留下的沉淀3次，收集液体放入分子截留量800的透析袋中，双蒸水透析7天后，将透析袋内液体冷冻干燥，得到白色粉末即咪唑及甘露糖修饰的羧甲基壳聚糖(I，M-OCMC)，

步骤9：将步骤8所得的I，M-OCMC取90mg溶于45ml蒸馏水中，在室温下，以400转/分的速度，搅拌30min，配置成3mg/ml的I，M-OCMC溶液。将搅拌后的溶液，滴入冰乙酸将pH值调至6，得到I，M-OCMC溶液；

2、反应产生纳米粒

取依替膦酸二钠30mg溶于75ml蒸馏水中蒸馏水，配置浓度2.5mg/ml的依替磷酸二钠溶液，室温搅拌至清澈透明，取步骤9制备好的I，M-OCMC溶液20ml在室温下，以300转/分的速度进行搅拌。在搅拌的过程中，按I，M-OCMC：依替膦酸二钠质量比3：1的不同比值，恒速滴入制备好的依替膦酸二钠溶液，并继续在室温下，以600转/分的速度搅拌25分钟，

将搅拌后的产物放入透析袋中，并放入已加入100ml双蒸馏水的烧杯中，以100转/分的速度进行搅拌透析，每隔4小时换一次双蒸馏水溶液，透析30小时后，将所得产物在-80℃的环境下经行冷冻真空干燥，获得纳米颗粒粉末，将粉末溶于50ml双蒸水中，采用仪器AKTApurifier蛋白纯化系统，柱子为QXL1ML，进行过柱，取过柱的液体冷冻干燥，得到咪唑及甘露糖修饰的羧甲基壳聚糖依替磷酸复合物纳米颗粒。

动物实验

1、将Lewis肺癌1×10⁶个/mL悬液0.2mL接种于Babl/c小鼠股内侧皮下，共30只，建立动物肿瘤模型，待肿瘤生长至100mm³～300mm³分为3组(A组、B组、C组)，每组10只，进行实验。

A组：每周经尾静脉注射咪唑及甘露糖修饰的羧甲基壳聚糖溶液0.1ml(0.1mg)，共4次；

B组：每周经尾静脉注射依替膦酸溶液0.1ml(0.1mg)，共4次。

C组：每周经尾静脉注射本项目制备的纳米颗粒溶液0.1ml(0.1mg)，共4次。

接种癌细胞6周后的死亡率，A组为70％，B组90％，C组为30％，与A、B两组相比，C组死亡率明显更低，差异有统计学意义(P<0.05)。