一种载重组戊肝蛋白微球混悬液制剂的制备方法与流程

本发明涉及一种载重组戊肝蛋白微球混悬液制剂的制备方法，属于生物制剂制备技术领域。

背景技术：

戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）基因组全长7.2kb，包含3个部分重叠的ORF，其中ORF2含有重要的中和抗原表位。目前已有ORF2许多片段在不同表达系统中成功的进行了表达。HEV尚无适合的细胞培养系。现上市或在研的HEV疫苗均为基因工程表达的重组HEV ORF2抗原蛋白的亚单位疫苗。我国进行HEV疫苗规模化生产研究的只有两家公司，已上市的（厦门万泰，重组HEV P239蛋白）和进行临床试验（长春生物制品研究所有限责任公司，重组HEV P179蛋白）的重组戊型肝炎疫苗皆使用氢氧化铝作为重组蛋白的佐剂，但是以氢氧化铝作为佐剂，对重组蛋白类疫苗的免疫增强作用有限，不能刺激机体产生更强的针对HEV的免疫反应。并且由于国内HEV疫苗产品较少，对HEV疫苗新剂型，新的后续产品研究也较少。

微球药物载体是近年药物应用新工艺、新技术中的一个突出代表。已有30多类药物在近年采用微球或微胶囊化技术，如解热镇痛药、抗生素、多肽、避孕药、维生素、抗癌药以及诊断用药等。这种药物传送技术在中药或化药中技术比较成熟，但在生物制品等蛋白质药物的应用仍处在研究阶段。微球载药技术在研发预防和治疗性疫苗领域也受到关注。

不同粒径大小的微粒在体内分布范围也不同，通常粒径在2.5~10微米时，大部分积集于巨噬细胞；小于7微米时一般被肝、脾中的巨噬细胞摄取；0.2~0.4微米的微粒集中于肝后迅速被肝清除；小于0.01微米的微粒则缓慢积集于骨髓。由此可见，当粒径范围分布在2.5~10微米时，微粒更容易被吞噬细胞摄取，刺激机体产生免疫反应，但一般重组表达制备的抗原蛋白粒径均为纳米范围，无法直接引起有效的特异性免疫反应，加入铝佐剂后，铝盐形成的聚合体不能形成紧实的具有规则粒径分布的微粒，尤其在剪切力及机体自身流体力学环境下其松散的聚合体更容易被打散，形成更为宽泛的粒径分布范围，限制了其吸附的抗原在机内的分布，影响了巨噬细胞对抗原的摄取率，进而影响机体对抗原产生的特异性免疫应答。而微球载体具有较规则的粒径分布范围，对剪切力及流体力学的影响较小，使用后其粒径变化幅度甚微，能更容易的被巨噬细胞吞噬，从而引发机体的特异性免疫反应，并且作为疫苗的传递与储存系统，微球载体可对抗原蛋白进行局部浓集和缓慢的释放，在局部高浓度并持续刺激的情况下使机体产生比常规佐剂（铝盐佐剂）更强烈、更特异的免疫反应。

海藻酸盐-壳聚糖微球制备条件温和,需要较少有机溶剂,制备过程中对活性蛋白质的破坏较少，特别适合于有生物活性的蛋白质类药物,且其来源丰富,成本低廉,是很有前途的重组抗原载体。海藻酸盐为多糖类化合物，常用稀碱从褐藻中提取制备。海藻酸钠可溶于不同温度的水中，不溶于乙醇、乙醚及其它有机溶剂。可与甲壳素或聚赖氨酸合用为复合材料。因海藻酸钙不溶于水，故海藻酸钠可用氯化钙固化成囊。甲壳素脱乙酰基后能溶于水称之为壳聚糖，甲壳素和壳聚糖是迄今为止唯一发现的阳离子动物纤维。壳聚糖具有一定的生物降解性，其分解产物无毒，具有增强药物吸收、抗菌消炎、促进伤口愈合、降低胆固醇、抑制肿瘤细胞的作用。

乳化法制备海藻酸盐微球核芯时通常使用食用油，但由于食用油存在较为明显的批间差异，对核芯形成及核芯粒径分布影响较大，而改用液体石蜡则避免了因为油相的批间差异及油溶性杂质对核芯形成的影响。

现研究的在蛋白微球制剂为将蛋白药物包裹进微球内部，而因为蛋白质并不像化学药物一样存在明显的油水分布性质，所以在用乳化法制备载蛋白的海藻酸盐-壳聚糖制剂时部分蛋白质溶于油相使得微球中载蛋白数量减少，严重影响微球制剂的包封率，但由于壳聚糖分子链上有大量的伯氨基，海藻酸钠的分子链上有大量的羧基，所以壳聚糖和海藻酸盐可以通过正负电荷吸引形成聚电解质膜。由于重组的戊肝蛋白大多带有负电荷，可以和海藻酸盐-壳聚糖微球载体的外层带有正电荷的壳聚糖层相互吸引，并吸附其上，获得载重组戊肝蛋白的海藻酸盐-壳聚糖微球，并且制备的载戊肝蛋白海藻酸盐-壳聚糖微球混悬液制剂是将蛋白原液与微球混合，混悬液中的蛋白质与微球表面的吸附存在动态平衡，使得微球对蛋白有着较高的吸附率，并且并无蛋白质的损失，制备方法简单，而且更为经济。

技术实现要素：
：

本发明提供一种载重组戊肝蛋白微球混悬液制剂的制备方法，使用海藻酸盐-壳聚糖微球作为重组戊型肝炎病毒抗原蛋白的载体，在国内的戊型肝炎疫苗的研究中属首创，填补了戊肝疫苗剂型研究的空白。

混悬液制剂中微球载体为内层为海藻酸盐核芯，外被壳聚糖层的双层微球，称其为海藻酸盐-壳聚糖微球载体。所制备混悬液制剂中的载重组戊肝蛋白微球的平均粒径分布在6.73微米～8.39微米之间，形态均一。混悬液制剂中重组戊肝蛋白终浓度为60微克/毫升（包括微球载体吸附的重组戊肝蛋白和未吸附游离的重组戊肝蛋白），通过对混悬液外液的重组戊肝蛋白的测定，计算出微球载体对重组戊肝蛋白的吸附率大于90%。

本发明所述的载重组戊肝蛋白微球混悬液制剂的的制备方法，包括如下步骤：

1、微球载体的海藻酸盐核芯的制备

制备方法为乳化法，浓度为1%～1.5%经115℃高压灭菌30分钟的海藻酸钠水溶液为水相，以液体石蜡为油相，水相与油相体积比为1:2，以单一乳化剂或混合乳化剂作为乳化剂，乳化剂添加量为1%~4%（乳化剂体积/油相体积），油水界面平衡值（HLB值）控制在4~6，预乳化转速控制在50转/分钟~500转/分钟，预乳化时间控制在5~30分钟，乳化转速控制在500转/分钟~2000转/分钟，乳化时间控制在5~30分钟，固化剂为经115℃高压灭菌30分钟的氯化钙水溶液，其浓度为5%~20%，固化液与乳液体积比为1:1~1:3，固化液滴入速度为3毫升/分钟~20毫升/分钟，继续固化时间为10~120分钟。海藻酸钙微球经油水相分离后用无菌注射用水或无菌蒸馏水冲洗3~5遍，离心分离，得微球载体海藻酸盐核芯；

2、获得的海藻酸盐核芯包被壳聚糖层制备海藻酸盐-壳聚糖微球载体

将步骤1）中获得的海藻酸盐核心悬浮于浓度为0.1%~0.8%经115℃高压灭菌30分钟的壳聚糖水溶液中，在25℃~42℃，转速为50转/分钟~200转/分钟摇床中温育10~60分钟，经1000转/分钟~5000转/分钟离心1~30分钟，无菌注射用水或无菌蒸馏水冲洗3~5次，获得海藻酸盐-壳聚糖微球载体；

3、重组戊肝蛋白微球制剂的制备

向步骤2）中获得的海藻酸盐-壳聚糖微球载体加入重组戊肝蛋白水溶液，并用无菌注射用水定容至与1中所用的水相相同的体积，使最后抗原蛋白含量在60微克/毫升，在25℃~42℃，转速为50转/分钟~200转/分钟摇床中温育10~60分钟，制备出载戊肝蛋白微球混悬液制剂，混匀后无菌分装，2℃~8℃保存，使用前悬匀。

所制备的混悬液中载重组戊肝蛋白微球平均粒径分布在6.73微米～8.39微米之间，形态均一。通过对混悬液制剂外液中重组戊肝蛋白含量测定，计算出微球载体对所载的戊肝蛋白的吸附率大于90%，吸附率计算方法如下：

吸附率=（蛋白总量-混悬液外液蛋白总量）/蛋白总量×100%

本方法制备的载重组戊肝蛋白混悬液制剂中未吸附的抗原蛋白仍留在混悬液中，符合药物吸附动态平衡规律，实现了药物利用效率最大化。

本发明的积极效果在于：

制剂中载戊肝蛋白的微球载体为乳化法获得的海藻酸盐-壳聚糖微球，在制备中用液体石蜡代替食用油作为油相，有效的避免了因为油相品质及油相批间差异对获得微球载体的影响。戊肝蛋白通过吸附于微球载体而相结合，而不是将戊肝蛋白包入微球，制备了戊肝蛋白终浓度为60微克/毫升的载戊肝蛋白微球混悬液制剂，通过对混悬液外液戊肝蛋白含量检测，证明微球载体对戊肝蛋白的吸附较好，吸附率可以到达90%以上，成功的避免了包入式的方法因蛋白在油水相均有分布而引起的包封率低和大量戊肝蛋白被浪费的现象。获得的载重组戊肝蛋白微球，其粒径均一，粒径分布范围窄，平均粒径小于10微米，形态均一。动物实验对比，载重组戊肝蛋白微球混悬剂较同等剂量以氢氧化铝作为佐剂的重组戊肝疫苗可更好的刺激实验动物产生针对戊肝的免疫反应，这在实际应用中具有较大意义。

附图说明

图1、本发明中实施例1~6所制备五批混悬液制剂中载重组戊肝蛋白微球微粒400倍光镜显微图（编号1~5相对应实施例1~5条件下制备制剂的微球微粒）；

图2.1~图2.5、本发明中实施例1~6所制备五批混悬液制剂中载重组戊肝蛋白微球微粒粒径分布图（编号1~5相对应实施例1~5条件下制备制剂的微球微粒）；

图3、本发明中实施例1~6所制备五批混悬液制剂中载重组戊肝蛋白微球微粒平均粒径对比（编号1~5相对应实施例1~5条件下制备制剂的微球微粒）；

图4、本发明中实施例1~6所制备五批混悬液制剂对重组戊肝蛋白的吸附率对比（编号1~5相对应实施例1~5条件下制备制剂的微球微粒）；

图5、本发明中试验例1所使用两批次食用油（大豆油）为油相制备的海藻酸盐核芯与使用两批次液体石蜡作为油相制备的海藻酸盐核芯的平均粒径对比

图6、本发明试验例2所述包裹法制备的载戊肝蛋白微球混悬液制剂与吸附法制备的载戊肝蛋白微球混悬液制剂包封率（吸附率）的对比

图7、本发明中试验例3中所述五批混悬液与铝佐剂疫苗实验动物血清特异性IgG抗体阳转率对比（编号1~5相对应实施例1~5条件下制备制剂的微球微粒）

图8、本发明中试验例3中所述五批混悬液与铝佐剂疫苗实验动物血清特异性IgG抗体OD均值对比（编号1~5相对应实施例1~5条件下制备制剂的微球微粒）。

具体实施方式

以下所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

实施例1

本实施例优选浓度为1%经115℃高压灭菌30分钟的海藻酸钠水溶液100毫升为水相，以液体石蜡200毫升为油相，水相与油相体积比为1:2，以吐温80和司盘85混合乳化剂作为乳化剂，乳化剂添加量为2.02毫升（乳化剂体积/油相体积=1%），油水界面平衡值（HLB值）控制在4[HLB=（1.8*司盘85体积+15.0*吐温80体积）/（司盘85体积+吐温80体积）]，经计算，混合乳化剂构成为1.68毫升的司盘85和0.34毫升吐温80。上述混合物经200转/分钟预乳化10分钟， 1000转/分钟乳化30分钟。以8毫升/分钟滴速向搅拌中的乳液中滴入200毫升固化剂（115℃高压灭菌30分钟的15%氯化钙水溶液）固化液与乳液体积比为1:1.5，固化液滴完后，继续固化90分钟。经油水相分离后用无菌注射用水冲洗3~5遍，离心分离，得微球载体海藻酸盐核芯。

实施例2

本实施例优选浓度为1%经115℃高压灭菌30分钟的海藻酸钠水溶液100毫升为水相，以液体石蜡200毫升为油相，水相与油相体积比为1:2，以吐温80和司盘85混合乳化剂作为乳化剂，乳化剂添加量为8.33毫升（乳化剂体积/油相体积=4%），油水界面平衡值（HLB值）控制在5[HLB=（1.8*司盘85体积+15.0*吐温80体积）/（司盘85体积+吐温80体积）]，经计算，混合乳化剂构成为6.31毫升的司盘85和2.02毫升吐温80。上述混合物经200转/分钟预乳化10分钟， 1000转/分钟乳化30分钟。以8毫升/分钟滴速向搅拌中的乳液中滴入200毫升固化剂（115℃高压灭菌30分钟的15%氯化钙水溶液）固化液与乳液体积比为1:1.5，固化液滴完后，继续固化90分钟。经油水相分离后用无菌注射用水冲洗3~5遍，离心分离，得微球载体海藻酸盐核芯。

实施例3

本实施例优选浓度为1%经115℃高压灭菌30分钟的海藻酸钠水溶液100毫升为水相，以液体石蜡200毫升为油相，水相与油相体积比为1:2，以吐温80和司盘85混合乳化剂作为乳化剂，乳化剂添加量为4.08毫升（乳化剂体积/油相体积=2%），油水界面平衡值（HLB值）控制在6[HLB=（1.8*司盘85体积+15.0*吐温80体积）/（司盘85体积+吐温80体积）]，经计算，混合乳化剂构成为2.78毫升的司盘85和1.30毫升吐温80。上述混合物经200转/分钟预乳化10分钟， 1000转/分钟乳化30分钟。以8毫升/分钟滴速向搅拌中的乳液中滴入200毫升固化剂（115℃高压灭菌30分钟的15%氯化钙水溶液）固化液与乳液体积比为1:1.5，固化液滴完后，继续固化90分钟。经油水相分离后用无菌注射用水冲洗3~5遍，离心分离，得微球载体海藻酸盐核芯。

实施例4

本实施例优选浓度为1.5%经115℃高压灭菌30分钟的海藻酸钠水溶液100毫升为水相，以液体石蜡200毫升为油相，水相与油相体积比为1:2，以吐温80和司盘85混合乳化剂作为乳化剂，乳化剂添加量为4.08毫升（乳化剂体积/油相体积=2%），油水界面平衡值（HLB值）控制在4[HLB=（1.8*司盘85体积+15.0*吐温80体积）/（司盘85体积+吐温80体积）]，经计算，混合乳化剂构成为3.40毫升的司盘85和0.68毫升吐温80。上述混合物经200转/分钟预乳化10分钟， 1000转/分钟乳化30分钟。以8毫升/分钟滴速向搅拌中的乳液中滴入200毫升固化剂（115℃高压灭菌30分钟的15%氯化钙水溶液）固化液与乳液体积比为1:1.5，固化液滴完后，继续固化90分钟。经油水相分离后用无菌注射用水冲洗3~5遍，离心分离，得微球载体海藻酸盐核芯。

实施例5

本实施例优选浓度为1%经115℃高压灭菌30分钟的海藻酸钠水溶液100毫升为水相，以液体石蜡200毫升为油相，水相与油相体积比为1:2，以吐温80和司盘85混合乳化剂作为乳化剂，乳化剂添加量为4.08毫升（乳化剂体积/油相体积=2%），油水界面平衡值（HLB值）控制在4[HLB=（1.8*司盘85体积+15.0*吐温80体积）/（司盘85体积+吐温80体积）]，经计算，混合乳化剂构成为3.40毫升的司盘85和0.68毫升吐温80。上述混合物经200转/分钟预乳化10分钟， 1000转/分钟乳化30分钟。以8毫升/分钟滴速向搅拌中的乳液中滴入200毫升固化剂（115℃高压灭菌30分钟的15%氯化钙水溶液）固化液与乳液体积比为1:1.5，固化液滴完后，继续固化90分钟。经油水相分离后用无菌注射用水冲洗3~5遍，离心分离，得微球载体海藻酸盐核芯。

实施例6

将实施例1~5中制备的海藻酸盐微球核芯沉淀分别悬入100毫升115℃高压灭菌30分钟的0.3%壳聚糖溶液中，在37℃摇床中以100转/分钟转速温育30分钟。3000转/分钟离心5分钟，弃去上清，收集海藻酸盐-壳聚糖微球沉淀。用无菌注射用水清洗海藻酸盐-壳聚糖微球沉淀3遍，每次均用3000转/分钟的转速离心5分钟，弃去上清清洗液，加入2.00毫升浓度为3毫克/毫升的重组戊肝蛋白原液，并用无菌注射用水定容至100毫升，使重组戊肝蛋白终浓度为60微克/毫升，在37℃，转速为100转/分钟摇床中温育30分钟，获得五批不同参数制备的载重组戊肝蛋白微球混悬液制剂，见图1。

混匀每批制剂，每批制剂中随机抽取100枚微粒用显微测微尺测量，经计算机SPSS软件统计微球粒径及其分布，其平均粒径6.73微米～8.39微米之间，形态均一，见图2.1~图2.5、图3。

对每批混悬液制剂取10毫升样品经6000转/分钟离心5分钟，收集上清液（外液），测量外液体积，并测量其中重组戊肝蛋白含量，计算重组戊肝蛋白的吸附率：

吸附率=（60微克/毫升*10毫升-外液中蛋白含量*外液体积）/600微克*100%

经检测，实施例1~实施例5五批混悬液制剂的重组戊肝蛋白吸附率均大于90%，见图4。

试验例1

选用两个不同批次的食用大豆油作为油相，和两个不同批次的液体石蜡作为油相，按实施例5中提供的方法制备海藻酸盐核心，以核心平均粒径及粒径分布作为指标对两种方法制备的微球核芯进行比较结果见图5。

经对比，食用大豆油批间差异对微球核芯的制备有较大影响，如使用食用大豆油作为乳化油相将无法获得稳定的制备工艺，而使用液体石蜡作为乳化油相，则制备出的微球核芯平均粒径较小，粒径分布范围更窄，可获得稳定的制备工艺。

试验例2

采用实施例5与实施例6所述方法制备两批次载戊肝蛋白海藻酸盐-壳聚糖微球混悬液制剂（吸附法），分别计算微球制剂的吸附率。

吸附率=（60微克/毫升*10毫升-外液中蛋白含量*外液体积）/600毫克*100%

将实施例5中的水相换成含有6毫克戊肝蛋白的水溶液，并按照实施例5所述方法制备出包裹戊肝蛋白的海藻酸盐微球核心，并用实施例6中所述方法包裹壳聚糖层，离心获得包裹戊肝蛋白的海藻酸盐-壳聚糖微球，加无菌注射用水定容至100毫升，获得包裹法制备的戊肝蛋白的海藻酸盐-壳聚糖微球混悬制剂，共用该方法制备两批次混悬制剂。每批次抽取10毫升混悬剂，离心分离微球，用PH8.0裂解液裂解微球，测定微球中蛋白含量，计算包封率

包封率=微球中蛋白含量/10毫升*100毫升/6毫克*100%

通过对两批次包裹法制备的戊肝蛋白微球混悬制剂及两批次吸附法制备的戊肝蛋白微球混悬制剂的包封率（吸附率）的对比，结果见图6，可以看出，吸附法制备的戊肝蛋白微球混悬制剂对蛋白的吸附更多，包裹法制备的戊肝蛋白微球混悬制剂戊肝蛋白在制备过程中损失较多，最后使得包封率低，从而证明用吸附法代替现普遍使用的包裹法可较为经济制备戊肝蛋白微球混悬制剂。

试验例3

将获得的实施例1~实施例5五批不同参数制备的载重组戊肝蛋白微球混悬液制剂与传统含氢氧化铝佐剂的重组HEV疫苗进行动物试验对比。

选取200只健康SPF级NIH小鼠，雌雄各半，分成7组，对照组20只，雌雄各半，其余6组为免疫组，每组30只，雌雄各半，组1免疫用药品为传统工艺制备的含有氢氧化铝佐剂的重组HEV抗原蛋白疫苗（重组戊肝蛋白终浓度为60微克/毫升），组2~6免疫用药品为实施例1~6所获得的五批不同参数制备的载重组戊肝蛋白微球混悬液制剂（重组戊肝蛋白终浓度为60微克/毫升）。

表1免疫程序

第21天摘除小鼠眼球采集血液制备血清，进行100倍稀释，并通过戊型肝炎病毒IgG抗体酶联免疫法诊断试剂盒检测小鼠血清相应抗HEV的IgG抗体阳转率，见图7，并通过相应抗体OD值的对比，见图8，发现载重组戊肝蛋白微球混悬液制剂在减少一次免疫的免疫程序下与传统工艺制备的含氢氧化铝佐剂的重组戊肝蛋白疫苗免疫比较，获得了相同或更好的免疫效果，可见载重组戊肝蛋白微球混悬液制剂可更好的激发实验动物针对HEV抗原的特异性免疫反应，并可简化免疫程序，这在实际应用中具有较大意义。

根据试验例1~3，可以看出，本发明采用液体石蜡代替食用油作为乳化油相成功避免了因食用油中油溶性杂质及食用油批间差异对制备微球核芯的影响，使得制备工艺更为稳定；采用吸附法代替包裹法制备载蛋白微球，避免了蛋白质因为在油水相中的分配而大量损失，使得制备的载蛋白微球更为经济，也使得微球制剂具有较高的吸附率；通过动物试验的对比，也可表明本发明制备的载戊肝蛋白海藻酸盐-壳聚糖微球混悬制剂，不仅没有破坏戊肝蛋白的免疫原性，甚至该制剂的免疫效果还要优于以氢氧化铝作为佐剂的同剂量免疫制剂。