一种负载蛋白质药物的可降解聚合物核壳微球的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种负载蛋白质药物的可降解聚合物核壳微球。

背景技术：

近年来，载多肽、蛋白质药物的缓释和控释给药系统发展很快，尤其是使用可生物降解的材料为载体的微球体或微球长效注射剂的制备。乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）作为骨架材料包裹抗癌药、多肽、蛋白质类药物制成可注射微球制剂，成为研究热点。目前，多肽和蛋白药物微球可以由很多方法制备，但肽和蛋白质复杂的结构使蛋白质的稳定性可以很容易被破坏，可能会导致蛋白质活性的丧失。在蛋白质药物的微球的制备中，如何根据特征选择一个制备药物合适的材料，设计一种安全有效和稳定的肽和蛋白质药物递送系统是制药工业面临的技术核心问题。

微球制备的常规方法有很多，分为相分离法、复乳法、超临界流体和喷雾干燥法等新技术。然而，还有一些突出问题存在于微球制剂技术，特别是在制备抗癌药、蛋白质药物微球给药系统中，比如在制备过程中的多肽和蛋白质药物存在包封率低、易失活、体内外释药有较明显突释等问题。与传统的制备方法相比较，电喷雾技术具有制备固体分散体较大的优势。

干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。作为一种广谱抗病毒剂，其类型分为三类，α-（白细胞）型、β-（成纤维细胞）型，γ-（淋巴细胞）型。在进行肝纤维化等相关疾病治疗时，需要每周注射干扰素注射液三次，处于治疗周期的病人负担重。随着生物药物研究技术的发展，针对目前干扰素长效控释微球尚处于实验室研究初期阶段，预期其药物微球缓释给药系统具有较好的改善效果，应用潜力大。

技术实现要素：

要解决的技术问题：针对目前干扰素长效控释微球的问题，本发明公开了一种负载蛋白质药物的可降解聚合物核壳微球，能够达到药物持续长久释放的目的，且制备的凝胶微球粒径均匀，形貌良好。

技术方案：一种负载蛋白质药物的可降解聚合物核壳微球，包括下述成分：质酸和羟乙基壳聚糖物理凝胶内核，乳酸-乙醇酸共聚物、聚己内酯或聚乳酸外壳。

上述负载蛋白质的可降解聚合物核壳微球的制备方法包括下述步骤：

步骤1）称取适量羟乙基壳聚糖溶解于乙酸溶液中得浓度为5-10mg/L的羟乙基壳聚糖溶液，配制浓度为1-2mg/L的质酸衍生物溶液，搅拌下加入羟乙基壳聚糖溶液中，控制羟乙基壳聚糖溶液与质酸衍生物溶液体积比为1:1，溶解适量蛋白质药物实现药物负载，由电喷雾同轴针头内口喷射获得，其中，质酸衍生物的制备方法为：将50.65mg的质酸、58.85mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和65.45mg的N-羟基丁二酰亚胺或N-羟基磺基丁二酰亚胺混合在10mL去离子水中，室温下在500rpm下搅拌24小时后，将活化的透明质酸聚合物沉淀在冷的乙醇中，沉淀物通过过滤收集并用乙醇洗涤以除去残余的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺/N-羟基磺基丁二酰亚胺，然后，冷冻干燥以蒸发任何残留在透明质酸聚合物表面的乙醇和水即得；

步骤2）将聚合物溶解于有机溶剂中，即得外壳材料：称取50~200mg聚合物，加1mL有机溶剂配置聚合物溶液，由电喷雾同轴针头外口喷射获得，其中聚合物为乳酸-乙醇酸共聚物、聚己内酯或聚乳酸，有机溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯；

步骤3）搭建实验装置，同轴电喷雾制备工艺参数为：内核凝胶溶液流速为0.2mL/h，外壳聚合物流速为2mL/h，喷头尖端与收集台之间的距离为15cm，高压电为4~8kV。

进一步的，所述的负载的蛋白质药物可以是干扰素或牛血清蛋白或细胞色素C。

进一步的，所述的步骤1）中蛋白质药物的负载量为外壳聚合物质量的0.5-20%。

有益效果：本发明结合亲水性聚合物和可降解聚合物的优势特性，利用电喷雾法制备一种微型状制剂药物，开发研究双层微球，制备具有质酸衍生物和羟乙基壳聚糖化学凝胶内核，PLGA等为聚合物外壳的双层结构微球，用做干扰素等蛋白质药物载体，并通过适当的优化与控制各影响因素，微球的性能得到了改善，能够达到药物持续长久释放的目的，且制备的凝胶微球粒径均匀，形貌良好。

附图说明

图1为实施例1制备载蛋白质酸衍生物-羟乙基壳聚糖凝胶内核PLGA微球扫描电镜照片。

图2为实施例1制备载蛋白质酸衍生物-羟乙基壳聚糖凝胶内核PLGA微球激光共聚焦显微镜观测图。

具体实施方式

实施例1

将1mg/mL的质酸衍生物溶液、5mg/mL的羟乙基壳聚糖溶液和牛血清蛋白混合凝胶，质酸衍生物溶液和羟乙基壳聚糖溶液体积比为1:1，牛血清蛋白的浓度为2%。利用同轴电喷雾技术制备核-壳颗粒，打开电压发生器，将所要喷射的各组分放于5mL注射器中，连接同轴喷雾针头，调整高压4，4.5，5，5.5，6，7kV电喷核壳溶液。一注射器载的是质酸衍生物、羟乙基壳聚糖和牛血清蛋白溶液，一注射器载的是PLGA溶液为外壳。采用同轴电喷雾技术制备核壳微粒，控制内核凝胶溶液流速为0.2mL/h，外壳聚合物流速为2mL/h，喷头尖端与收集台之间的距离为15cm，调整高电压参数，进行电喷操作，将收集的微球冷冻后真空干燥4h，以除去残余有机溶剂待测试。

扫描电子显微镜观测微粒的表面形态和大小，利用QUANTA400FEG热场发射扫描电镜对实验过程中所需要的样品进行扫描，得到扫描图像后分析。具体的操作步骤为：将制得的凝胶微球进行制样并粘贴在导电胶上，把四个标本待用，开机并对扫描电镜仪进行调试，抽真空，达到扫描条件，将喷金后的样品放入仪器中，观察样品，调节放大倍数通过选择需要的图像并记录，逐个观察与保存所需图像，取出样品并关机。

在对收集样品做表面喷金处置，进行电镜扫描分析，参见图1，发现在6kV条件2%牛血清蛋白负载率下制得的微球表面光滑，形貌完整，呈球形态，说明该条件下制得的微球比较理想。

将制得的样品进行共聚焦激光扫描图像的获取，见图2，荧光显示蛋白质药物分布均匀且集中于凝胶内核处。

实施例2

将实验配置2mg/ml的质酸衍生物溶液、10mg/ml羟乙基壳聚糖溶液和牛血清蛋白混合凝胶，质酸衍生物溶液和羟乙基壳聚糖溶液体积比为1:1，牛血清蛋白的浓度分别为2%、4%和10%，将所要喷射的溶液吸入注射器中，一注射器载的是质酸衍生物、羟乙基壳聚糖和牛血清蛋白溶液，一注射器载的是PLGA溶液为外壳，打开电压发生器，连接同轴喷雾针头，调整电压4、4.5、5、5.5、6、7kV，电喷核壳溶液。

配置质酸衍生物与羟乙基壳聚糖溶液，因两者不容易溶于水，所以需测试前提前配置，质酸衍生物不稳定，不可以放置超过2天，否则，凝胶效果受到影响。测定HA-NHS与GC混合凝胶流变趋势图，可以得到凝胶曲线变化波动，前期G’变化曲线波动较大，可能是由于凝胶过程中混入空气，影响到凝胶变化曲线。质酸衍生物与羟乙基壳聚糖凝胶时间为26min。

对比SEM结果，BSA浓度影响微球形态。2%BSA在电压为6kV控制条件下，制备出的凝胶小球，表面光滑，形态呈球形态，但是仍然会有棒形出现；10%BSA在6kV电压的控制条件下，制备出的微球形态较差；4%BSA在电压5.5-6kV的控制条件下，制备出的凝胶微球形态很好，作为微球制备优选条件。

实施例3

将5mg/mL的羟乙基壳聚糖溶液、1mg/mL的质酸衍生物溶液和干扰素混合凝胶，质酸衍生物溶液和羟乙基壳聚糖溶液体积比为1:1，干扰素的浓度分别为2%、4%、6%、8%、10%，采用同轴电喷雾技术制备核壳微粒，控制内核凝胶溶液流速为0.2mL/h，外壳PLGA聚合物流速为2mL/h，喷头尖端与收集台之间的距离为15cm，实验温度控制在2-8℃，高电压为6kV，进行电喷操作，将收集的微球冷冻后真空干燥4h，以除去残余有机溶剂待测试。

用干扰素代替牛血清蛋白，进行化学交联凝胶内核双层结构微球的制备。SEM测试可以看出表面光滑，形态呈球形态。进行激光扫描图像的获取，观测到具有壳聚糖凝胶内核、PLGA为聚合物外壳的双层结构微球。通过电镜扫描和共聚焦测试表明制得的微球粒径均一，形貌完整，负载了蛋白质。亲水性凝胶内核改善了蛋白质药物的负载和释放性能、药物稳定性的影响，以及亲疏水界面结构对载体结构性能的影响。

通过电喷雾法制备双层微球，用质酸衍生物和羟乙基壳聚糖混合凝胶包载2%浓度的干扰素，采用电喷雾技术制备具有特定亲、疏水性结构比例的微球，制备的凝胶微球粒径均匀，形貌良好，包封率良好，释药性能好的凝胶微球。

实施例4

将5mg/mL的羟乙基壳聚糖溶液、1mg/mL的质酸衍生物和细胞色素C混合凝胶，质酸衍生物溶液和羟乙基壳聚糖溶液体积比为1:1，PLGA溶液为外壳，细胞色素C的浓度分别为2%和4%，分别为A组和B组，A组在6kV的电压下做电喷雾，B组则在5.5kV的电压下做电喷，最后得到两组微球。控制内核凝胶溶液流速为0.2mL/h，外壳聚合物流速为2mL/h，喷头尖端与收集台之间的距离为15cm，进行同轴电喷雾操作制备核壳微粒。将收集的微球冷冻后真空干燥4h，以除去残余有机溶剂，然后进行分析测试。

制备得到的结构微球，研究其对模型蛋白质细胞色素C的负载效果，以及对蛋白质药物的负载和释放性能、药物稳定性的影响，以及亲疏水界面结构对载体结构性能的影响。在对收集实验样品进行电镜扫描分析，观测制得的微球球形粒径均一，形貌完整，表面光滑。

以上对本发明实施例进行了详细介绍，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。