本发明涉及一种用于脑部疾病诊疗的功能性姜黄素纳米药物的制备方法与应用，此纳米药物能够应用于脑部的疾病诊断与治疗，属于药物制剂及其应用领域。
背景技术：
目前，高效药物递送是脑部疾病诊断与治疗的主要障碍之一。这主要是由于脑部血脑屏障(bbb)限制了药物从血液向脑内转运，导致大部分药物不能进入脑部病变部位而发挥疗效。脑部给药设计策略通常包括使用a法：亲脂的前药(pro-drugs)；b法：bbb开放法；c法：鼻腔给药；d法：纳米技术递送等。但这些策略仍存在不足或局限：a法中使用的亲脂前药分子的结构和分子量都受到严格限制，适用范围窄；b法利用bbb开放法完全打开血脑屏障，很可能导致一些有害物质进入脑部；c法鼻腔给药的过程中，药物及辅料对鼻粘膜以及纤毛均可能产生毒性作用，严重时会影响鼻腔的正常功能；d法纳米技术递送法是一种具有广泛应用前景的非侵入性药物脑内递送策略，如采用脂质体、固体脂质纳米粒以及聚合物纳米粒等。然而，脂质体和固体脂质纳米粒容易被体内res系统识别吞噬，从而影响脑部药物分布；同时，脂质体等纳米载体还存在载药量和稳定性的限制。相比而言，两亲性聚合物胶束在脑部靶向递送小分子药物方面显示出更大的优势，具体表现在：(1)载药量高，可显著增加疏水性药物溶解度，载药量最高可达30％以上；(2)具有较低的临界聚集浓度，可保护药物避免被酶解或降解，稳定性更好；(3)纳米尺度的粒径更易于透过bbb，提高脑部药物转运效率；(4)易于表面修饰，通过在其表面修饰靶向分子如单抗、肽类、凝集素、糖类、激素类以及低分子量的化合物等，从而增加靶部位的药物蓄积。
姜黄素是一种低分子量的多元酚，其具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、保肝、抑制血栓、预防心血管疾病、抗关节炎、抑制新生血管生成等多种药理作用，且毒性低，具有良好的临床应用潜力，因此受到国内外广泛的关注。另有研究证实，姜黄素可以通过降低n-甲基-d-天门冬氨酸受体亚单位(nr2a)的表达和增加nr2b的表达，进一步抑制海马区神经元凋亡，从而起到神经保护作用，减轻缺血性脑损伤。临床上，姜黄素较差的水溶性和化学上的不稳定性影响其实际应用。目前发展了很多的递药系统来解决姜黄素的低溶解度和稳定性差的缺陷，其中包括将姜黄素制备成磷酸复合物、环糊精包合物、纳米凝胶或纳米乳以及利用纳米粒子包裹等，其中最好的策略之一是将姜黄素包裹在纳米粒子的疏水内核中。这主要是由于亲水性高分子外壳会包裹在姜黄素的外部，不仅极大地提高了姜黄素的水溶性，还可基于亲水性外壳的保护作用而增加其稳定性，从而大大提高姜黄素的生物利用度。
低分子量肝素(lowmolecularweightheparins，lmwh)是由肝素(hp)经酶解或化学降解的方法而得，分子量在2-9kda，其与hp相比，两者的抗凝活性大致相同，但其具有较强抗血栓活性、较高的生物利用度、半衰期长、副作用更小、不需实验室监测等优点，在临床中得到较广泛的应用。值得注目的是，从上世纪90年代初，就有人开始探讨肝素类药物在阿尔兹海默病中的作用，并取得了一些研究成果，实验结果发现肝素及其衍生物可以通过下列途径对抗ad等神经退行性疾病：(1)调节神经细胞内钙水平；(2)抑制β淀粉样蛋白(aβ)；(3)调控载脂蛋白e(apoe)的功能；(4)影响tau蛋白的磷酸化等等。同时，低分子量肝素的抗血管生成活性已被广泛认可，其主要是通过影响血管内皮生长因子与其受体的结合以及影响纤维蛋白的结构等途径而发挥血管生成抑制作用，可用于脑血管疾病的治疗。
本发明将姜黄素和低分子量肝素通过化学接枝后形成两亲性姜黄素衍生物，基于两亲性聚合物的自组装原理，其可形成纳米结构粒子，从而构建多功能纳米药物，其在体内递送方面的优势体现在：(1)亲水性低分子量肝素包裹在姜黄素的外部，不仅极大地提高了姜黄素的水溶性，还可基于亲水性外壳的保护作用而增加姜黄素的化学稳定性，从而大大提高姜黄素的生物利用度；(2)姜黄素和低分子量肝素自身具有的抑制血管生成活性及脑内神经保护等药理活性，同时，该纳米药物的疏水内核可载入其他治疗或诊断药物，发挥药物载体的功能，从而协同治疗达到更好的疗效，或实现诊疗一体化；(3)该纳米药物能以静脉注射给药方式实现将药物递送入脑，避免了侵袭性给药方式潜在的风险和复杂的给药过程，具有给药量大、给药方式简单、病人顺应性强等优点；(4)更重要的是，经研究发现，该纳米药物能够有效地将药物递送至脑内，提高脑部药物的蓄积效率，解决脑部疾病治疗的最大局限即药物递送问题。该纳米药物高效的脑部递送主要源于以下几个原因：(1)较小的纳米粒径。该纳米药物的粒径为50～500nm左右，能够通过延长其在毛细血管壁的滞留时间及提高血管内外药物的浓度梯度，促进药物被动扩散入脑；(2)姜黄素对p-gp的抑制作用。脑毛细血管内皮上的p-gp参与了血脑屏障的作用，而姜黄素可显著抑制p-gp的外排，使得血脑屏障通透性增加，从而增加了纳米药物的入脑量，达到了靶向的作用；(3)通过与低分子量肝素化学连接，姜黄素的稳定性显著提高，极大提高了体循环过程中姜黄素向脑部递送的机会和效率，从而增加递送至脑部的药物量，进而发挥治疗作用。同时，纳米药物性质稳定、处方工艺简单，具有极大应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于脑部疾病诊疗的功能性姜黄素纳米药物，其为通过化学方法合成的一种两亲性姜黄素衍生物，在水性介质中能够自组装形成兼具治疗活性和药物荷载功能的纳米药物该纳米药物不仅具有针对脑部疾病诊断与治疗的药理活性，还可增加血脑屏障通透性和脑部靶向药物递送，从而达到更好的脑部疾病诊断与治疗的效果。本发明具有广泛的应用前景。
本发明的另一个目的是提供形成上述姜黄素衍生物的制备方法。
本发明还有一个目的是提供上述功能性姜黄素衍生物纳米药物的应用。
为了达到上述目的，本发明提供了一种新型的功能性姜黄素衍生物纳米药物，该纳米药物是由姜黄素和低分子量肝素通过化学接枝而得到的姜黄素-低分子量肝素两亲性聚合物在水溶液中自组装而成。基于亲水性低分子量肝素外壳的保护作用，能够大大提高姜黄素的水溶性和化学稳定性；基于姜黄素和低分子量肝素自身具有的抑制血管生成活性及脑内神经保护等药理活性，以及利用其疏水内核荷载的其他治疗或诊断药物，可发挥单独或协同治疗作用或诊疗一体化治疗模式；更重要的是，该纳米药物能够有效地将药物递送至脑内，提高脑部药物的蓄积效率，解决脑部疾病治疗的最大局限即药物递送问题。
所述的姜黄素衍生物的制备方法，包括下列两种：
一、姜黄素和低分子量肝素的化学基团在催化剂的作用下直接连接，包括形成酯键和醚键：
a、形成酯键
将低分子量肝素(lmwh)溶于适当反应溶剂中，加入催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci)及n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化其羧基，将姜黄素溶解于反应溶剂中，加入碱化试剂4-二甲氨基吡啶(dmap)活化酚羟基；随后冰浴条件下，将活化的姜黄素缓慢加入活化的低分子量肝素溶液中，继续冰浴反应一定时间后，移至室温下反应；反应结束后，加入冰丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，在水中透析，冷冻干燥即得最终产物-姜黄素衍生物。
其中，lmwh、edci、nhs、dmap、姜黄素的摩尔比为1∶1～3∶1～3∶1～3∶1～3，冰浴反应的时间为0.5～2h，置于室温下的反应时间为6～72h，于水中透析的时间为0.5～3d，适当的溶剂选自n，n-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜或上述的混合溶剂。
b、形成醚键
分别将低分子量肝素和姜黄素溶于适当反应溶剂中，往姜黄素溶液中加入一定量的碱化试剂4-二甲氨基吡啶(dmap)活化酚羟基；随后将活化的姜黄素缓慢加入低分子量肝素溶液中，加入浓硫酸作为吸水剂，于室温下搅拌24h，反应结束后，加入冰丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，在水中透析1d，冷冻干燥即得最终产物-姜黄素衍生物。
其中碱化试剂4-二甲氨基吡啶(dmap)的用量为姜黄素摩尔量的0.5～3倍，吸水剂浓硫酸的用量为低分子量肝素摩尔量的0.1～5％，低分子量肝素和姜黄素的摩尔比为1∶1～3，适当的溶剂选自n，n-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜或上述的混合溶剂。
二、通过亚烷基二胺作为连接臂相连接：
取低分子量肝素溶于适量反应溶剂中，加入适宜比例的二胺类连接臂，磁力搅拌溶解后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)和羟基琥珀酰亚胺(nhs)作为活化剂，室温反应，反应结束后加入冰丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀，加水复溶，超声透析，冷冻干燥得到游离一端氨基的低分子量肝素活性中间体。取上述所得低分子量肝素活性中间体溶于甲醇-水混合溶液中，避光，缓慢滴加姜黄素的甲醇溶液，滴完后继续反应，取产物除去甲醇，加少量水混匀后抽滤，除去未反应的姜黄素及其降解产物，取滤液，离心，取上清液，避光条件下透析，冷冻干燥即得最终产物-姜黄素衍生物。
其中低分子量肝素、二胺类连接臂、edc、nhs的摩尔用量比为1∶1～6∶1～5∶1～5，低分子量肝素和连接臂室温反应时间为6～24h，透析时间为0.5～3d，滴加姜黄素的速度控制为每滴间隔2～30s，滴完姜黄素后继续反应时间为1～6h。
姜黄素衍生物纳米药物的制备方法：
按照姜黄素衍生物和水按重量比为1∶1000～3∶1000的比例溶解，将制得的姜黄素衍生物溶于水中，经超声或高压均质处理，制备成粒径为50～500nm的姜黄素衍生物纳米药物。
以姜黄素衍生物作为载体制备难溶性药物的载药纳米药物
姜黄素衍生物溶于水，将难溶性药物用适当溶剂溶解，与姜黄素衍生物水溶液混合，经超声或高压均质处理，通过透析或超滤等方法除去有机溶剂及小分子，制得粒径为50～500nm的纳米药物。所谓适当溶剂，指药学上使用的能溶解该药物的溶剂。
所述的姜黄素衍生物，可单独用作高分子新药，也可用作注射、口服、外用或者粘膜给药的药学活性或药理活性分子的载体。所述的药学活性或药理活性分子选自以下药物中的任一药物或其衍生物：脑肿瘤治疗药物，包括紫杉烷类、喜树碱类、长春新碱类、蒽醌类、阿霉素类、鬼臼毒素类或维a酸类；帕金森病治疗药物，包括左旋多巴胺类、麦角类、非麦角类或金刚烷胺类；阿尔兹海默症治疗药物，包括石杉碱甲类、吲哚美辛类、维生素e类、双氢吡啶类以及苯烷胺类；血管病变治疗药物，包括环扁桃酯类、链激酶类及尿激酶类。
本发明的有益效果：
一、该功能性姜黄素衍生物纳米药物能够有效地促进药物靶向脑部，这主要源于以下几个原因：1、较小的纳米粒径，该纳米药物的粒径为50～500nm左右，能够通过延长其在毛细血管壁的滞留时间及提高血管内外药物的浓度梯度，促进药物被动扩散入脑；2、姜黄素对p-gp的抑制作用，脑毛细血管内皮上的p-gp参与了血脑屏障的作用，而姜黄素可显著抑制p-gp的外排，从而使得血脑屏障通透性增加，从而增加了纳米药物的入脑量，达到了靶向的作用；3、通过与低分子量肝素连接，姜黄素的稳定性得到较大的提高，从而使得到达脑部的姜黄素量增加，获得更好的入脑作用。
二、本发明采用简单的化学键连接了姜黄素和低分子量肝素，不仅增加了低分子量肝素和姜黄素的药理活性，而且大大提高了姜黄素的水溶性和稳定性，合成条件温和，反应简单，原料成本低，易于工业化生产。
三、本发明的功能性姜黄素纳米药物在用作脑部诊断或治疗药物载体时，不仅其疏水性内核可以荷载药物(所述的药学活性或药理活性分子选自以下药物中的任一药物或其衍生物：脑肿瘤治疗药物，包括紫杉烷类、喜树碱类、长春新碱类、蒽醌类、阿霉素类、鬼臼毒素类或维a酸类；帕金森病治疗药物，包括左旋多巴胺类、麦角类、非麦角类或金刚烷胺类；阿尔兹海默症治疗药物，包括石杉碱甲类、吲哚美辛类、维生素e类、双氢吡啶类以及苯烷胺类；血管病变治疗药物，包括环扁桃酯类、链激酶类及尿激酶类。)，改善疏水药物的水溶性和稳定性，同时基于姜黄素和低分子量肝素针对脑部疾病诊断与治疗的药理活性，能够发挥脑部疾病协同治疗作用。
四、本发明能够以静脉注射给药方式实现将药物递送入脑，避免了侵袭性给药方式潜在的风险和复杂的给药过程，具有给药量大、给药方式简单、病人顺应性强等优点。
五、姜黄素衍生物纳米药物的亲水端低分子量肝素结构上存在很多羟基和羧基基团，故可在纳米药物表面修饰其他靶向分子，例如单抗、肽类、凝集素、糖类、激素类以及低分子量的化合物等，进一步增加靶部位的药物蓄积。
附图说明
图1：姜黄素衍生物纳米药物在小鼠体内的分布图(无肿瘤小鼠)
具体实施方式
下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。
实施例1：酯键为连接臂的姜黄素衍生物的合成及接枝率
姜黄素和低分子量肝素溶于适当的溶剂中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edci)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，4-二甲氨基吡啶(dmap)作为活化剂。将低分子量肝素在油浴40℃下溶解于甲酰胺中，约1h，然后在冰浴下加入edci，活化30min后加入nhs，冰浴活化2h，然后同时加入已经溶解于甲酰胺的姜黄素和dmap，避光，冰浴活化30min后，移至室温下避光反应24h，上述过程均用氮气保护。反应结束后，加入过量冰丙酮(3-5倍量)沉淀产物，抽滤得沉淀。所得沉淀用水复溶，探头超声30min，0.8μm滤膜过滤，转置于透析袋(mwco＝3500)中透析24h，冷冻干燥即得酯键为连接臂姜黄素衍生物。其中，lmwh、edci、nhs、dmap、姜黄素的摩尔比为1∶1～3∶1～3∶1～3∶1～3。所得产物的接枝率见表1。
表1酯键为连接臂的姜黄素衍生物的接枝率
实施例2：醚键为连接臂的姜黄素衍生物的合成及接枝率
分别将低分子量肝素和姜黄素置于圆底烧瓶中，加入n，n-二甲基甲酰胺，搅拌使其溶解，将碱化试剂4-二甲氨基吡啶(dmap)加入姜黄素溶液中，达到活化酚羟基的目的；将活化的姜黄素以每滴间隔5s缓慢加入低分子量肝素溶液中，同时加入浓硫酸作为吸水剂，于室温下搅拌24h，反应结束后，加入冰丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，在水中透析1d，冷冻干燥即得最终产物-姜黄素衍生物。所得产物的接枝率见表2。
表2醚键为连接臂的姜黄素衍生物的接枝率
实施例3：乙二胺为连接臂的姜黄素衍生物的合成
取2mol低分子量肝素置于圆底烧瓶中，加入50ml甲酰胺溶解，加入8mol乙二胺，磁力搅拌2min，再加入3mol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)和4.5mol羟基琥珀酰亚胺(nhs)，室温反应12h，反应结束后加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀，加水复溶，透析2d，冷冻冻干得到游离一端氨基的肝素活性中间体。取上述所得肝素活性中间体溶于甲醇-水混合溶液中，避光，50℃磁力搅拌下，缓慢滴加6mol的姜黄素的甲醇溶液，滴加时间为1.5h，滴完后继续反应2h，取产物旋转蒸发挥去甲醇，加少量水混匀后抽滤，除去未反应的姜黄素及其降解产物，取产物旋转蒸发挥发去甲醇，加少量水混匀后抽滤，除去未反应的姜黄素及其降解产物，取滤液，3000r/min离心10min后取上清液，避光条件下于pbs缓冲液(ph＝6.8)中透析8h，小心移取透析袋内澄清液，冻干得最终产物乙二胺为连接臂的姜黄素衍生物。
实施例4：丙二胺为连接臂的姜黄素衍生物的合成
取2mol低分子量肝素溶于适量甲酰胺中，加入8mol丙二胺，磁力搅拌3min，再加入3mol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)和4.5mol羟基琥珀酰亚胺(nhs)，室温反应12h，反应结束后加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀，加水复溶，透析2d，冷冻干燥得到游离一端氨基的肝素活性中间体。取上述所得肝素活性中间体溶于甲醇-水混合溶液中，避光，50℃磁力搅拌下，缓慢滴加6mol的姜黄素的甲醇溶液，滴加时间为1.5h，滴完后继续反应2h，取产物旋转蒸发挥去甲醇，加少量水混匀后抽滤，除去未反应的姜黄素及其降解产物，取产物旋转蒸发挥发去甲醇，加少量水混匀后抽滤，除去未反应的姜黄素及其降解产物，取滤液，3000r/min离心10min后取上清液，避光条件下于pbs缓冲液(ph＝6.8)中透析8h，小心移取透析袋内澄清液，冻干得最终产物丙二胺为连接臂的姜黄素衍生物的合成。
实施例5：苯二胺为连接臂的姜黄素衍生物的合成
取2mol低分子量肝素溶于适量甲酰胺中，加入8mol苯二胺，磁力搅拌5min，再加入3mol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)和4.5mol羟基琥珀酰亚胺(nhs)，室温反应15h，反应结束后加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀，加水复溶，透析2d，冷冻干燥得到游离一端氨基的肝素活性中间体。取上述所得肝素活性中间体溶于甲醇-水混合溶液中，避光，50℃磁力搅拌下，缓慢滴加6mol的姜黄素的甲醇溶液，滴加时间为1.5h，滴完后继续反应2h，取产物旋转蒸发挥去甲醇，加少量水混匀后抽滤，除去未反应的姜黄素及其降解产物，取产物旋转蒸发挥发去甲醇，加少量水混匀后抽滤，除去未反应的姜黄素及其降解产物，取滤液，3000r/min离心10min后取上清液，避光条件下于pbs缓冲液(ph＝6.8)中透析8h，小心移取透析袋内澄清液，冻干得最终产物丙二胺为连接臂的姜黄素衍生物的合成。
实施例6：姜黄素衍生物纳米药物的制备
称取10mg姜黄素衍生物溶解于适量蒸馏水中，室温下搅拌5～60min，冰浴下探头超声或高压均质10～30min，0.8或0.45μm滤膜过滤，即得姜黄素衍生物纳米药物。
实施例7：姜黄素衍生物纳米药物的表征
将实施例6中制备得到的姜黄素衍生物纳米药物溶液，取1ml用水稀释到3ml，用粒径测定仪(malveminstruments，malvern，uk)进行测定，结果见表3。由表可知，制备得到的姜黄素衍生物纳米药物溶液，颗粒粒径达到纳米级，且粒径分布小。
表3姜黄素衍生物纳米药物的表征
实施例8：超声法包载疏水性药物的姜黄素衍生物纳米药物的制备
姜黄素衍生物18mg，溶解在3ml水中搅拌1h。取疏水性药物10mg溶解在乙醇(或者甲醇、乙腈)中。然后二者混合，探头超声30min后，双蒸水透析过夜，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。所得产物的载药量见表4。
表4超声法包载疏水性药物的姜黄素衍生物纳米药物的载药量
实施例9：高压均质法包载疏水性药物的姜黄素衍生物纳米药物的制备
姜黄素衍生物18mg，溶解在3ml水中搅拌1h。取疏水性药物10mg溶解在乙醇(或者甲醇、乙腈)中。然后二者混合，高压均质20min后，双蒸水透析过夜，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。所得产物的载药量见表5。
表5高压均质法包载疏水性药物的姜黄素衍生物纳米药物的载药量
实施例10：姜黄素衍生物溶解度的考察
称取过量的姜黄素衍生物置于10ml试管中，精确加入3ml水于试管中，充分震荡使其充分溶解，静置15min后，于3000rpm下离心10min后，过0.8μm滤膜，用紫外分光光度计法于420nm下测定其吸光度，利用标准曲线计算得到其溶解度。结果见表6。
表6姜黄素衍生物在水中的溶解度
实施例11：姜黄素衍生物稳定性的考察
用磷酸二氢钠、磷酸氢二钠作为缓冲体系，用40％甲醇溶液(姜黄素不溶于水，溶于一定浓度的甲醇溶液)，配成浓度为0.2mol/l，ph值分别为4.5，5.4，6.8，7.4的缓冲溶液作为稳定性考察介质。配制姜黄素含量为60μg/ml的下列不同缓冲溶液：姜黄素溶液、姜黄素纳米药物溶液，置于25℃恒温水浴中，定时取样400μl，溶于3.6ml的甲酰胺中，420nm测定吸光度值。以各溶液在0时间点的吸光度值作为基准吸光度值a0，相对吸光值比ai/a0(％)为各ph值下的吸光度值ai与基准透光率a0的百分比，ai/a0(％)也能代表各ph值下各时间点的cur的剩余百分比。其中24h时的具体试验结果如表7，可以看到不同实施例中姜黄素衍生物中的姜黄素的稳定性均显著高于游离姜黄素的稳定性。
表7姜黄素以及其衍生物在不同ph介质中的稳定性
实施例12：姜黄素衍生物纳米药物用于脑部疾病诊疗的应用
以实施例1中的姜黄素衍生物纳米药物来考察本发明在脑部诊疗中的应用。具体实施方案如下：将游离荧光染料dir和载dir的姜黄素衍生物纳米药物通过尾静脉注射给药给小鼠，10min、30min、24h后解剖小鼠，使用小动物活体成像仪器观察dir小鼠各个脏器的分布情况。结果如附图1，发现该纳米药物在各个时间点内，在小鼠脑部的分布都明显高于其他脏器，这说明该姜黄素衍生物纳米药物能够选择性的分布于机体的脑部，从而达到一定的脑部靶向作用，这说明其能够作为脑部疾病治疗药物的载体。
实施例13：姜黄素衍生物纳米药物应用于肿瘤治疗
以实施例3中的制备方法制得的姜黄素衍生物纳米药物来考察其对于体内肿瘤治疗的作用。具体实施方案如下：
一、建立荷瘤小鼠模型
取冻存heps腹水，37℃快速溶解后，离心(1000rpm，3min)，倾去上清液，用适量生理盐水重悬沉淀。接种于小鼠腹部，待小鼠腹部鼓起，处死腹水老鼠，立即剖开小鼠肚子，取出活性很大的腹水，离心后用生理盐水重悬，稀释至合适浓度后，接种于小鼠的右侧腋下。
二、给药方案
分别设置空白对照组(5％葡萄糖溶液)和姜黄素衍生物纳米药物组(实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例5组)。给药剂量是5mg/kg/day(以lmwh给药量计算)。将接种肿瘤后的小鼠，随机分成4组(n＝5)，每天用游标卡尺量瘤体积，当肿瘤体积长到50-100mm3左右时，开始给药，每隔两天给一次药，给药的方式是尾静脉注射，停药后第2天处死并解剖小鼠。
三、肿瘤抑制效果评价
通过测定该纳米药物的抑瘤率以及肿瘤组织mvd来综合评价该姜黄素衍生物纳米药物的肿瘤抑制效果。实验结果如表8中显示，实施例1～5的中姜黄素衍生物纳米药物对肿瘤抑制均具有较为显著的作用。
表8姜黄素衍生物对肿瘤的抑制效果