本发明属于兽用生物制品
技术领域：
，具体涉及一种用LMH细胞系生产禽腺病毒灭活疫苗的方法。
背景技术：
：禽I群腺病毒是家禽常见的感染病原体，呈世界性分布，目前发现所有年龄的家禽均易感，只是鉴于家禽的品种、年龄所形成的致病力不同。目前发现禽I群腺病毒对鸡具有强致病性，主要病变表现为包涵体肝炎及心包积液-肝炎综合征，该病可直接引发养鸡场20～40天龄鸡只出现30％以上的死亡率，此外其临床上也常常与传染性支气管炎病毒，呼肠孤病毒，H9亚型禽流感病毒等并发感染，导致种蛋鸡出现明显呼吸道病，关节炎，及严重的产蛋下降及畸形蛋等问题。因此目前该病已经成为严重影响养鸡场生产性能的重大疫病之一。禽I群腺病毒中的禽腺病毒4型(FAV-4)目前是世界上的研究热点，其具备高致病性，可直接引发的心包积液-肝炎综合征(或安卡拉病)，该病于1987年首发于巴基斯坦，在不到一年的时间内殃及整个巴基斯坦肉鸡养殖企业，之后在科威特、伊朗、前苏联，日本，中南美洲及墨西哥等地具有发生，甚至该病在鸽子也曾大面积爆发。目前已经证明，禽I群腺病毒，特别是针对高致病性的FAV-4型可通过灭活疫苗进行有效防控，其中巴基斯坦采取感染鸡的肝脏匀浆制备的甲醛灭活疫苗防控心包积液-肝炎综合征获得了显著成功。现有技术对禽I群腺病毒灭活疫苗的制备多采用鸡胚成纤维细胞(CEF)、鸡胚肾细胞(CEK)、雏鸡肾细胞(CK)、鸡胚肝细胞(CEL)4种原代细胞分离和增殖病毒。但原代肝肾细胞制备繁琐、易污染、不易转染，且在制备细胞过程中易混入CEF，不利于实验操作。鸡肝癌细胞系(LMH细胞系)是由一位日本学者在1981年所建立的。通过使用二乙基亚硝胺对雄性来航鸡长期进行诱导，导致鸡体产生肝癌，再从肝癌组织中分离细胞而得到的。LMH呈典型上皮细胞特征，该细胞系保持了鸡肝细胞分化的大量表型特征，主要用于重组腺病毒的构建。公开号为CN105420198A的中国专利申请“鸡肝癌细胞系作为鸭瘟病毒宿主的应用”以鸡肝癌细胞系作为鸭瘟病毒宿主，证明鸡肝癌细胞系适用于病毒培养。目前虽然有相关研究表明LMH细胞系是禽I群腺病毒较适合的培养系统，但未见优化LMH细胞系培养禽I群腺病毒条件以获得较高病毒滴度的灭活疫苗相关研究。采用传统的胰酶-EDTA浓度消化细胞进行传代后细胞活性较差且容易老化，用此种状态下的细胞采取不同的生产条件来制备禽腺病毒疫苗，进行动物免疫效力试验，得出的结论是疫苗的保护率很低。此外，采用传统的细胞培养时间、病毒接种浓度、病毒收获时间，均存在病毒滴度不高，制作的疫苗保护率较低的问题。技术实现要素：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种用LMH细胞系生产禽腺病毒灭活疫苗的方法。该方法生产工艺简单且稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量。本发明提供的技术方案为如下：本发明提供一种用LMH细胞系生产禽腺病毒灭活疫苗的方法，其包括以下步骤：(1)传代细胞系LMH细胞的制备：将LMH细胞用胰酶-EDTA消化液进行消化分散传代，加入DMEM培养液在37℃、5％CO2培养箱中培养，直至形成生长良好的细胞单层；(2)种毒繁殖：用禽腺病毒4型毒种按终体积1:200接种到步骤(1)制备的LMH细胞单层中，并在37℃吸附30分钟后吸弃病毒液，加入细胞维持液，于37℃、5％CO2培养58±2小时，直至细胞病变CPE达80％以上，收获细胞毒液；(3)病毒收集、浓缩和纯化：将收获的细胞毒液于-20℃反复冻融两次，5000rpm，4℃离心10min后收集上清液，即病毒原液，将病毒原液通过50K的中空纤维柱超滤浓缩10倍，即为制苗病毒液；(4)疫苗成品的配制：往制苗病毒液中加入终浓度为0.1～0.2％(v/v)的福尔马林进行灭活，即为疫苗抗原；然后将疫苗抗原乳化制成乳剂型灭活疫苗。进一步地，上述步骤(1)的DMEM培养液中含5～10％(v/v)新生牛血清、1.0～1.2％(v/v)双抗和0.5～2.5％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。进一步地，上述步骤(1)中胰酶-EDTA消化液为含有0.025％(m/v)的胰酶，0.02％(m/v)EDTA的Hank’s溶液。进一步地，上述步骤(2)的细胞维持液为包含有0.5～1.5％(v/v)新生牛血清、0.2～0.5％(m/v)谷氨酰胺、1.0～1.2％(v/v)双抗、1～3％(v/v)脂质体复合物和1～2％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。进一步地，所述步骤(2)的细胞维持液为还包含有0.05～0.2％(m/v)硫辛酸。其中，所述的脂质体复合物为内部包含过氧化氢酶的复合物。所述的脂质体复合物的制备包括以下步骤：(1)称取0.2g磷脂酰胆碱、0.08g胆固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于50mL乙醇，超声处理5min；(2)然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去乙醇，静置30min，加入100mLpH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，该磷酸盐缓冲溶液中含0.2～0.6％(m/v)过氧化氢酶，在35℃水浴中振荡水化反应约1h，得脂质体悬浮液；(3)使用注射器式滤器调整脂质体悬浮液的粒径至150～200nm，得到内部包含有过氧化氢酶的脂质体。进一步地，所述步骤(3)中病毒原液经浓缩后，进行病毒含量的测定，测得每0.1mL制苗病毒液含量为108.0TCID50以上，方可用于制备疫苗。进一步地，所述步骤(4)将疫苗抗原乳化制成乳剂型灭活疫苗具体为：(1)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司盘-804份，先将白油缓慢加温，加入司盘-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；(2)水相制备：取疫苗抗原96份加入灭菌后的吐温-804份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；(3)乳化：将水相加入到油相中，利用IKA乳化剂进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；(4)分装：将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。本发明人在试验中发现，采用传统使用的胰酶-EDTA消化液(0.25％(m/v)胰酶-0.02％(m/v)EDTA)对LMH细胞进行消化传代培养，传代后的细胞活性较差且容易老化，制得的禽腺病毒疫苗效价较低，保护效果差。将消化液中胰酶的浓度降低10倍，即使用质量体积比为0.025％胰酶-0.02％EDTA消化液，对LMH贴壁细胞消化更彻底，细胞传代既稳定又生长良好。同时，本发明人发现在LMH细胞单层进行禽腺病毒4型毒种接毒后，加入常规的细胞维持液，LMH细胞很快出现死亡，导致最终制得的禽腺病毒疫苗效价较低。本发明人通过大量的试验和筛选对细胞维持液的配方进行改进，发现在低含量新生牛血清的DMEM培养液中加入一定量的过氧化氢酶脂质体复合物和硫辛酸，可显著改善LMH细胞的生长状态，避免LMH细胞过早出现死亡，从而获得较高病毒滴度的制苗病毒液。经接毒后的细胞培养58±2小时得到的病毒液中病毒的含量高达107.0TCID50以上，进一步经浓缩后，病毒的含量高达108.0TCID50以上，远远高于采用常规鸡胚法及原代细胞法制备禽腺病毒疫苗的效价，取得了意料不到的技术效果。同时，采用的LMH细胞背景清楚，无外源病原，易增殖性，非常适用生物反应器进行大规模培养，符合未来疫苗生产趋势，并且细胞活性高，半抗原高度澄清，容易进行浓缩处理，非常适合进行高抗原滴度的优质灭活疫苗生产。与现有技术相比，本发明的优势在于：(1)采用本发明疫苗制备方法可以稳定获得高滴度抗原，其制备的抗原半成品TCID50可以稳定达到107/0.1mL，病毒滴度是常规鸡胚法及原代细胞法的10倍以上，如采用生物反应器进行病毒增殖，其病毒滴度届时可以达到100倍水平。从经济效益角度评估，用此生产工艺对以后规模化生产该疫苗不仅能大大降低生产成本，而且疫苗免疫效果远比传统好。(2)本发明通过优化细胞培养液的配方，创造性地添加过氧化氢酶脂质体复合物和硫辛酸，使接毒后的LMH细胞在低含量新生牛血清的DMEM培养液中仍能保持良好的生长状态，避免细胞过早出现死亡，从而提高制毒疫苗的效价，并在较短的培养时间58±2小时，即可收获滴度较高的病毒液，大大节约了生产成本，提高生产效率。(3)本发明制备的疫苗保护率高，在疫苗的保护试验中，分别按照三种剂量0.3mL/只、0.5mL/只和1.0mL/只进行注射免疫，疫苗保护率均达到了100％，表明本发明生产的禽腺病毒4型灭活疫苗免疫效力高，对禽腺病毒4型具有完全的免疫保护作用。具体实施方式以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。实施例1脂质体复合物的制备：(1)称取0.2g磷脂酰胆碱、0.08g胆固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于50mL乙醇，超声处理5min；(2)然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去乙醇，静置30min，加入100mLpH为7.4含0.5％(m/v)过氧化氢酶的磷酸盐缓冲溶液，在35℃水浴中振荡水化反应约1h，得脂质体悬浮液；(3)使用注射器式滤器调整脂质体悬浮液的粒径至150nm，得到内部包含有过氧化氢酶的脂质体。实施例2消化LMH细胞最佳胰酶-EDTA浓度筛选和LMH细胞最佳培养时间的筛选将LMH细胞(ATCCLMH-CRL-2117)，分别用质量体积比为0.25％、0.05％、0.025％的胰酶-EDTA(0.02％)消化分散；加入含5～10％(v/v)新生牛血清、1.0～1.2％(v/v)双抗和0.5～2.5％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液在37℃、5％CO2培养箱中培养至细胞单层，用于传代。将三种不同浓度胰酶-EDTA消化得到的LMH细胞分别传代，不同代次细胞生长情况见表1。用质量体积比为0.025％胰酶-EDTA(0.02％)消化LMH细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养不同时间，对其细胞用MTT法进行细胞活性测定和用红细胞计数板对细胞进行计数，结果见表2。表1不同浓度胰酶-EDTA消化LMH细胞传代情况表2培养不同时间细胞活性和细胞计数结果表明：(1)用质量体积比为0.025％胰酶-EDTA(0.02％)消化传代的细胞比传统上常用的0.25％胰酶-EDTA(0.02％)消化传代生长良好，且传代稳定性要比传统的胰酶浓度强。(2)细胞活性和细胞计数结果表明，采用质量体积比为0.025％胰酶-EDTA(0.02％)浓度消化传代的细胞在培养48～60h之间细胞活性最高，且细胞数量跟72h相差不大。实施例3禽腺病毒4型的最佳接种浓度筛选将铺满单层的LMH细胞按不同浓度稀释进行禽腺病毒4型接种，分别于接毒后至细胞出现80％左右细胞病变时，收获细胞毒液于-20℃反复冻融两次，5000rpm，4℃离心10min后收集上清液，即病毒原液，测定其TCID50，其结果见表3。表3禽腺病毒4型接种浓度的筛选结果表明：采用不同稀释浓度的病毒液进行接种，细胞出现病变的时间有很大差异且其细胞毒液的效价有很大差异，由上表可知采用200倍稀释病毒进行接种并培养58小时，病毒的效价最高。实施例4禽腺病毒4型的最佳收获时间筛选采用200倍稀释病毒液接种铺满单层的LMH细胞，不同时间收获其细胞病毒液，测定不同时间收获的病毒液TCID50，从而确定其最佳收获病毒时间，结果见表4。表4不同时间收获的病毒液TCID50结果表明：以相同稀释浓度的病毒液接种LMH细胞后，分不同时间收获细胞病毒液，并对不同时间阶段收获的细胞病毒液进行TCID50病毒含量测定；同时根据细胞接毒后的细胞病变程度，得出60h收获细胞毒液是最佳收获时间。实施例5禽腺病毒4型制苗病毒液的制备(1)传代细胞系LMH细胞的制备：将LMH细胞用质量体积比为0.025％的胰酶-0.02％的EDTA消化分散传代，加入含10％(v/v)新生牛血清、1.0％(v/v)双抗和2.0％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液，在37℃、5％CO2培养箱中培养，直至形成生长良好的细胞单层，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。(2)种毒繁殖：用禽腺病毒4型毒种按终体积1:200接种到步骤(1)制备的LMH细胞中，并在37℃吸附30分钟后吸弃病毒液，加入含有1.0％(v/v)新生牛血清、0.4％(m/v)谷氨酰胺、1.0％(v/v)双抗、2.5％(v/v)脂质体复合物、0.15％(m/v)硫辛酸和2％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液，于37℃、5％CO2培养至60小时，此时，细胞病变CPE达80％以上，收获细胞毒液。(3)病毒收集、浓缩和纯化：将收获细胞毒液于-20℃反复冻融两次，5000rpm，4℃离心10min后收集上清液，即病毒原液，将病毒原液通过50K的中空纤维柱超滤浓缩10倍，即为制苗病毒液。(4)病毒含量测定：将制苗病毒液用DMEM培养液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞孔；每孔0.1mL，37℃吸附30min后，补加细胞维持液0.3mL，于37℃、5％CO2培养120小时，观察细胞病变(CPE)，计算TCID50，每0.1mL禽腺病毒4型病毒含量≥108.0TCID50方可用于制备疫苗。(5)禽腺病毒4型的灭活：将病毒含量符合要求的制苗病毒液导入灭活罐内，加入福尔马林溶液，充分混合，福尔马林溶液的终浓度为0.1％(v/v)，37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时)后取出，置6℃保存，应不超过1个月。(6)禽腺病毒4型病毒灭活检验：取灭活检验的样品，用DMEM营养液以10-1、10-2、10-3三个比例稀释待检样品，同时设立同样稀释比例的灭活前病毒样品用于阳性对照，分别接种于48孔LMH细胞单层细胞，每组重复接种5孔，每孔0.4mL37℃、5％CO2培养96小时。灭活样品各组稀释度孔中均没有出现细胞病变，阳性对照组各稀释度孔中细胞病变均明显，达80％以上，判定为灭活检验合格。实施例6疫苗成品的配制本发明可用于配制灭活疫苗的条件为：每0.1mL禽腺病毒4型病毒含量≥108.0TCID50方可用于制备疫苗，所述灭活疫苗的制备具体为：(1)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司盘-804份，先将白油缓慢加温，加入司盘-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；(2)水相制备：取实施例5制得的禽腺病毒4型灭活疫苗抗原96份加入灭菌后的吐温-804份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；(3)乳化：将水相加入到油相中，利用IKA乳化剂进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；(4)分装：将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。对比例1、2、3禽腺病毒4型制苗病毒液的制备对比例1禽腺病毒4型制苗病毒液的制备步骤与实施例5基本相同，区别在于，所述的步骤(2)种毒繁殖中，LMH细胞接入毒种后，加入的细胞维持液含有过氧化氢酶，而不是过氧化氢酶脂质体，即将过氧化氢酶直接加入到细胞维持液中。对比例2禽腺病毒4型制苗病毒液的制备步骤与实施例5基本相同，区别在于，所述的步骤(2)种毒繁殖中，LMH细胞接入毒种后，加入的细胞维持液不含过氧化氢酶脂质体。对比例3禽腺病毒4型制苗病毒液的制备步骤与实施例5基本相同，区别在于，所述的步骤(2)种毒繁殖中，LMH细胞接入毒种后，加入的细胞维持液不含硫辛酸。并观察按对比例1-3所述的方法制备禽腺病毒4型制苗病毒液，不同时间收获的病毒液TCID50，并与实施例5的方法制备禽腺病毒4型制苗病毒液比较，见下表5。表5不同时间收获的病毒液TCID50由对比例1可知，将过氧化氢酶直接加入到细胞维持液中，LMH细胞在较短时间内出现病变，培养36h后，CPE比例达到65％，48h后达到95％，收获病毒液中病毒的含量远低于实施例5制得病毒液中病毒的含量。由对比例2可知，细胞维持液中不含过氧化氢酶脂质体，LMH细胞在最短时间内出现病变，培养36h后，CPE比例达到85％，收获病毒液的病毒的含量最低。由对比例3可知，细胞维持液中不含硫辛酸，LMH细胞出现病变的时间与对比例1相当，培养36h后，CPE比例达到60％，48h后达到85％。以上结果表明在细胞培养液中加入过氧化氢酶脂质体和硫辛酸可显著改善LMH细胞接毒后的生长状态，延缓其出现细胞病变，提高病毒疫苗的效价。实施例7灭活疫苗成品检验(1)性状①外观：为乳白色乳剂。②剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均不扩散。③稳定性：吸取疫苗10毫升加入离心管中，以3000rpm离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5mL。④粘度：用出口内径为1.2mm的1.0mL吸管，吸取25℃左右1.0mL，令其垂直自然流出，记录流出0.4mL所需的时间，应不超过8秒。(2)无菌检验：取成品接种硫乙醇酸盐培养基小管和酪胨琼脂各两支，每支0.2mL，一支置37℃培养，一支置25℃培养，观察3～5日，应纯粹，无菌生长。(3)安全检验：用7日龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1mL，观察14日，结果试验鸡均健活，无任何局部和全身不良反应。(4)甲醛含量测定：①对照品溶液的制备：取已标定的甲醛溶液适量，配成每1.0mL含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5.0mL置50mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。②被测样本的制备：用5.0mL刻度吸管量取被检品5.0mL，置50mL量瓶中，用20％吐温-80乙醇溶液10mL，分次洗涤吸管，洗液并入50mL量瓶中，摇匀，加水稀释至刻度，强烈振摇，静止分层，下层液如果不澄清，滤过，弃去初滤液，取澄清续滤液，即得。③测定法：精密吸取对照品溶液和被检品溶液各0.5mL，分别加醋酸-醋酸铵缓冲液10mL，乙酰丙酮试液10mL，置60℃恒温水浴15分钟，冷水冷却5分钟，放置20分钟后，按紫外-可见分光光度计法，在410nm的波长处测定吸收度，计算即得。甲醛溶液(40％)含量％(g/mL)＝0.25×(被检样品溶液的吸收度/对照样本溶液的吸收度)×100％。甲醛含量符合国家标准，即检验合格。(5)装量检查：取供试品3个，使之恢复至室温，开启时注意避免损失。参照装量检查使用量取参考表，用经标化的吸管、注射器或量筒进行装量检查。实施例8疫苗效力试验取4日龄清远麻黄鸡55只，试验组每组15只，分别用0.3mL/只(A组)、0.5mL/只(B组)和1.0mL/只(C组)进行肌肉注射疫苗，剩余10只鸡进行肌肉注射生理盐水，作为对照组。免疫后21日，用禽腺病毒4型病毒细胞液(约含106.5/0.1mL)进行攻毒，每只肌肉注射1.0mL。观察7天，每天详细记录免疫鸡和对照鸡的发病情况。结果显示：对照组鸡攻毒7天内全部发病，死亡8只，不同剂量免疫组攻毒7天内没有出现任何症状；且死亡鸡及发病鸡(攻毒后7天进行剖检)剖检病理变化：均出现典型的心包积液、肝脏肿大、典型的胰腺炎。攻毒7日后对免疫鸡只进行剖检，未出现由禽腺病毒4型引起的一些病理变化，结果见表6。表6各组别攻毒结果组别数量免疫途径攻毒剂量攻毒保护率A15肌肉注射1mL/只15/15(100％)B15肌肉注射1mL/只15/15(100％)C15肌肉注射1mL/只15/15(100％)对照组10/1mL/只10/10发病(100％)，8/10死亡(80％)由上表可知，使用本发明制备的灭活疫苗分别按照三种剂量0.3mL/只、0.5mL/只和1.0mL/只进行注射免疫，疫苗保护率均达到了100％，表明本发明生产的禽腺病毒4型灭活疫苗免疫效力高，对禽腺病毒4型具有完全的免疫保护作用。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3