一种治疗酒精性肝病的靶向性补体抗体微囊制剂及其制备方法与应用与流程

本发明涉及治疗酒精性肝病新药的开发，特别是一种治疗酒精性肝病的靶向性补体抗体微囊制剂及其制备方法与应用。

背景技术：

酒精性肝病（alcohol-inducedliverdisease，ald）是由于长期大量饮酒所导致的肝脏疾病，包括脂肪肝、酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化等。酒精中毒是仅次于肝炎病毒导致肝损害的第二大病因。近年来ald在中国的发病率呈上升趋势，已成为严重威胁人类健康的多发病和常见病。乙醇80%～90%在肝脏代谢，经过乙醇脱氢酶的催化，氧化为乙醛，再经乙醛脱氢酶催化转成乙酸，最终形成二氧化碳。在乙醇氧化过程中脱下大量的氢离子与辅酶ⅰ（nicotinamideadeninedinucleotide，nad）结合，nad被还原成为还原型辅酶ⅰ（nadh），即nad⁺+h⁺+2e^-=nadh，使nadh/nad上升，从而使细胞的氧化、还原反应发生变化，造成依赖于nadh/nad的物质代谢发生障碍，而成为代谢紊乱和致病的基础。一方面乙醇促进体内活性氧簇（reactiveoxygenspecies,ros）与活性氮自由基（reactivenitrogenspecies，rns）产生过多，超出机体抗氧化物的清除能力，另一方面受多因素影响体内还原型谷胱甘肽（glutathione,gsh）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,sod）等抗氧化成分减少,最终导致氧化与抗氧化系统的动态平衡失衡，从而促发氧化应激。该过程生成的自由基可引起生物膜脂质过氧化、细胞内蛋白酶变性、dna氧化修饰等一系列毒性作用，最终导致肝细胞坏死或凋亡。氧化应激产生的自由基可使线粒体膜通透性增加，使线粒体dna、gsh、氧化磷酸化蛋白及脂质等成分改变，最终引起细胞能量代谢障碍，导致细胞死亡。此外，乙醛在生理状态下能与多种蛋白发生共价结合，并主要在中央静脉周围的肝细胞中形成稳定的和不稳定的乙醛蛋白加合物（acetaldehydeproteinadducts,apa），造成损伤性效应:①apa形成导致蛋白质结构改变和功能异常，如蛋白酶失活、dna修复蛋白功能障碍、gsh耗竭、线粒体损伤、氧利用障碍等，从而导致肝细胞脂肪变、肝脏纤维化等病理变化。②apa可作为抗原诱导免疫反应，产生相应抗体，引起肝细胞炎症、坏死及纤维组织增生等病理变化。对酒精性肝病的治疗目前尚无特效药，维生素，还原型的谷胱甘肽等药物对于预防酒精性肝病及延缓病程有一定作用。

近年来证明有免疫炎症因素参与ald的发病机制且越来越受到重视，其中补体成分发挥重要作用。

补体是存在于人和脊椎动物血清及组织液中的一组30多种具有酶样活性的球蛋白，补体固有成分加上其相关受体和调节因子共同组成补体系统，参与炎症及免疫调节等效应，具有重要的病理生理功能。补体系统的激活与调控是一个复杂的过程，其激活、生物学活性与补体抑制剂的调控位点简单概括如图1。其中c5b与补体途径终末部分（c6、c7、c8和c9）结合，形成膜攻击复合物(membraneattackcomplex,mac)。mac既能直接导致细胞溶解，又能刺激细胞释放炎性细胞因子。

补体的激活、效应与调控简介，见图1。

肝脏是80-90％血浆补体成分的生物合成站点，并表达了多种补体受体。研究表明:补体系统的激活参与ald进程中的损伤与修复机制，但到目前为止，通过补体调控减轻酒精性肝损伤的研究未见报道。体内补体调控系统包括液相调节因子和膜结合性调节因子。液相调节因子为多种液相血清蛋白，不能定位于局部，其调控会不可避免的同时影响了对机体有利的调理、炎症和杀菌等作用，容易导致免疫调节失衡，且存在生物活性低等局限性，从而极大程度上限制了其实际临床应用价值。膜结合性调节因子锚定于特定细胞的膜表面，使自身细胞免受补体攻击损伤，分为两类：一类抑制c3转化酶活性,包括补体受体1(complementreceptor1,cr1)、衰变加速因子（decay-acceleratingfactor,daf）和膜辅蛋白（membranecofactorprotein,mcp）,表达于啮齿类动物的crry在结构和功能与人类的cr1类似；另一类抑制终末补体途径mac形成,主要通过cd59的活性来实现。cd59能与c8和c9结合，从而抑制mac的形成。利用补体受体2（complementreceptor2,cr2）连接膜结合性调节因子(fh,crry或cd59），通过cr2靶向性结合到补体活化和损伤局部，利用膜结合性调节因子特异性调节补体级联反应的不同阶段，具有靶向性强、高效、安全、不影响宿主全身免疫功能等优点。cr2的配体是c3裂解后产生的ic3b,c3dg和c3d等镶嵌于细胞表面的碎片。而c3裂解→c3b沉积在活化细胞表面→非活性的ic3b→c3dg这一过程相对缓慢，因而提供了相对长的作用时间。本专利旨在将前期研究的成果“双靶性补体抑制剂”转化应用于临床酒精性肝病的治疗。

cr2介导的靶性补体调节与分割性调控见图2。cr2与cr2配体（c3裂解产物ic3b、c3dg和c3d等）连接，引导至补体活化局部（病灶部位靶向）；fh、crry、cd59分别调节补体通路不同位点，发挥相应效应（靶向效应）。

技术实现要素：

本发明的目的是要提供一种治疗酒精性肝病的靶向性补体抗体胶囊制剂；

本发明的第二个目的是提供上述制剂的制备方法；

本发明的第三个目的是提供靶向性补体抗体胶囊的应用。

本发明目的通过下述技术方案来实现：

本发明一种治疗酒精性肝病的靶向性补体抗体胶囊制剂，是：将含有补体抗体蛋白基因克隆到能够在中国仓鼠细胞（cho,chinesehamsterovarycell）中高表达目的蛋白的表达载体pee14.1中，然后转染至cho细胞中，经传代培养、筛选出高产量的补体抗体蛋白表达细胞系，经细胞旋转培养技术扩大生产纯化，得到补体抗体蛋白（cr2-crry），再将补体抗体蛋白制成补体抗体脂质体微囊，最后经膜过滤、除菌、分装，即为可治疗酒精性肝病的靶向性补体抗体胶囊制剂。

所述表达载体pee14.1为商业化载体，可购买。

上述治疗酒精性肝病的靶向性补体抗体制剂cr2-crry的制备方法，包括如下步骤：

1.补体抗体蛋白基因的表达载体pee14.1构建：将补体抗体蛋白基因序列克隆扩张后通过hindiii和ecori这两个核酸内切酶插入的表达载体pee14.1中，经测序验证后抽提纯化，备用；

2.高产量的补体抗体蛋白表达细胞系构建：将上一步骤中构建好的补体抗体蛋白基因的表达载体转染至cho细胞中，经过细胞传代培养、筛选后鉴定补体抗体蛋白的表达量，挑选产量比较高的细胞系用液氮冷冻保存，备用；

3.补体抗体蛋白扩大生产、纯化及鉴定：将步骤2中构建的细胞系复苏培养，优化培养条件后转入工业化旋转培养罐扩大生产，然后将含有补体抗体蛋白的培养液经cr2特异性免疫球蛋白g纯化柱纯化，洗脱后浓缩鉴定，得到补体抗体蛋白原药，备用；

4.制备补体抗体脂质体微囊：采用反向滴定法制备胶囊：称取100mg的补体抗体蛋白原药与18mg/ml浓度的海藻酸钠溶液20ml混合均质，用容器抽取，逐滴滴入40ml含有37mg/ml的cacl2溶液的烧杯中，20分钟后抽滤，洗涤，冷冻干燥后得到液体状补体抗体微囊，最大胶囊包封率达到70%。

靶向性补体抗体制剂在治疗酒精性肝病中的应用，是将液体状补体抗体微囊过滤除菌，无菌水配成1.0g补体抗体/10ml浓度，加入0.25%的氯甲酚防腐剂（0.25g/100ml），手工或机械灌装，封盖，4℃储存，供酒精性肝病患者服用，补体抗体微囊的剂量为：2.0g补体抗体/日，分两次使用。

本发明所述补体抗体经对急、慢性酒精性肝脏损失的效应实验表明，补体抗体活化的同时能显著减少肝脏损伤和显著改善肝脏脂肪变性。

本发明的优点在于：

利用补体受体2连接膜结合性调节因子(fh,crry或cd59），通过cr2靶向性结合到补体活化和损伤局部，利用膜结合性调节因子特异性调节补体级联反应的不同阶段，具有靶向性强、高效、安全、不影响宿主全身免疫功能等优点。而c3裂解→c3b沉积在活化细胞表面→非活性的ic3b→c3dg这一过程相对缓慢，因而提供了相对长的作用时间。

附图说明

图1为补体的激活、效应与调控简介示意图；

图2为cr2介导的靶性补体调节与分割性调控示意图；

图3为野生型小鼠急性酒精性肝损伤模型术后6h的补体激活、肝脏损伤比较示意图；

图4为野生型小鼠通过喂养酒精饲料16天构建慢性酒精性肝病模型后补体激活、肝脏脂肪变性比较示意图；

图5为野生型小鼠通过喂养酒精饲料16天构建慢性酒精性肝损伤模型后行70%肝切除肝脏损伤和肝再生比较示意图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：

补体抗体cr2-crry对急性酒精性肝脏损伤的效应（见图3）。

使用c57bl/6野生型小鼠18只，随机分成三组，每组6只小鼠。酒精处理+补体抗体蛋白处理组在酒精灌胃前30分钟每只小鼠给予0.25mgcr2-crry腹腔注射，酒精处理组给予5g/kg酒精溶液灌胃，灌胃前给予等量生理盐水（ns）腹腔注射，而对照组仅给予等热量的糊精溶液灌胃，6小时后处死小鼠取血清标本和肝脏标本。血清标本用于肝功能的检测，肝组织样本采用免疫荧光的方法检测c3沉积。

检测结果如图3所示，检测结果证实：补体抗体抑制补体活化的同时，能显著减轻肝损伤。

实施例2：补体抗体cr2-crry对慢性酒精性肝脏损伤的效应。

使用c57bl/6野生型小鼠24只，随机分成三组，每组8只小鼠。酒精性脂肪肝变性模型（alcoholicfattyliver，afl）按niaaa法（nationalinstituteonalcoholabuseandalcoholism）给予液体酒精饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司，tp4030d）喂养,对照组给予等热量对照饲料喂养（南通特洛菲饲料科技有限公司，tp4030c），afl+cr2-crry组在酒精饲料喂养的第10天后每天给予0.25mgcr2-crry腹腔注射，afl组给予等量ns处理，连续6天后处死小鼠收集血清和肝脏样本。血清样本用于肝功能和补体水平检测，肝组织样本用于伊红苏木素染色检测肝脏脂肪沉积。

检测结果如图4所示，检测结果证实：在慢性酒精性肝病模型中，补体抗体抑制补体活化的同时能显著改善肝脏脂肪变性。

实施例3：

补体抗体cr2-crry在酒精性肝病背景下行肝切除对肝损伤和肝再生的影响。

具体造模过程如实例2，在慢性酒精肝病的基础上我们进一步采取70%肝切除模型，术后48小时候收集血清及肝组织样本进行相关检测。

检测结果如图5所示，检测结果证实：在慢性酒精性肝病背景下行肝切除，补体抗体抑制补体活化的同时能显著减轻肝切除后肝损伤和改善肝脏再生。

一种靶向性补体抗体胶囊口服液制剂的应用，主要是应用于治疗酒精性肝病。使用方法是：口服，每天二次，每次1ml(1.0g抗体)，一个月为1疗程。

通过实验表明，补体抗体在抑制抗体活化的同时，能显著减少肝损伤，其机制主要是：利用补体受体2连接膜结合性调节因子(fh,crry或cd59），通过cr2靶向性结合到补体活化和损伤局部，利用膜结合性调节因子特异性调节补体级联反应的不同阶段，具有靶向性强、高效、安全、不影响宿主全身免疫功能，而c3裂解→c3b沉积在活化细胞表面→非活性的ic3b→c3dg这一过程相对缓慢，因而提供了相对长的作用时间。