白藜芦醇寡聚体DipG在制备治疗急性髓性白血病的药物中的应用的制作方法

本发明专利涉及白藜芦醇寡聚体Dip G在制备治疗急性髓性白血病的药物中的应用，属于药学领域。

背景技术：

急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种恶性血液系统疾病，表现为骨髓细胞异常增殖，正常造血细胞分化的能力受到抑制。目前AML的常规治疗方法是使用细胞毒性药物靶向迅速增殖的细胞从而控制疾病的发展，但是这种治疗方法效果有限且具有较大的副作用。全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)通过促进白血病细胞分化，在治疗AML的亚型——急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)中取得了良好的疗效，提出了分化疗法的新观点。然而，ATRA介导的细胞分化疗法在其他类型的AML中并没有效果。因此目前急需新型、低毒性的治疗药物，可以打破白血病细胞的分化障碍，为AML提供有效的治疗方法。

Diptoindonesin G(Dip G)是白藜芦醇(resveratrol,Rev)的非整倍体，可从热带植物如狭叶坡垒(Hopea chinensis)的树皮中分离获得或人工合成。目前尚未发现关于Dip G对治疗AML作用的报导。

技术实现要素：

本发明的目的是提供白藜芦醇寡聚体Dip G在制备治疗急性髓性白血病的药物中的应用。

本发明首次发现白藜芦醇寡聚体Dip G可以通过促进白血病细胞分化和成熟，并抑制细胞增殖，从而达到治疗急性髓性白血病的作用，为急性髓性白血病提供了新的治疗策略。

附图说明

图1为Dip G的结构式。

图2为Dip G对AML细胞增殖的影响。

图3为Dip G对AML细胞形态的影响。

图4为Dip G对AML细胞分化标记分子CD11b和CD14表达的影响。

图5为给予Dip G对小鼠AML异种移植模型中移植瘤生长的影响。

图6为给予Dip G对小鼠AML异种移植模型中移植瘤重量的影响。

下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。

具体实施方式

实施例1

一.Dip G的药理试验

1、细胞培养

人源AML细胞株HL-60、U937来自中国医学科学院血液学研究所，用RPMI 1640培养基(含10％FBS)培养于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中。

2、细胞增殖实验

取HL-60和U937细胞种于96孔板中，每个孔种5×10³个细胞，分别用0、1.875、3.75、7.5、15μM的Dip G或50μM的Rev处理0、24、48、72、96小时后，进行台盼蓝染色，用血细胞计数器对细胞进行计数。

3、细胞形态分析

在24孔板内放上圆形盖玻片，用HL-60和U937细胞制作细胞爬片，分别用0、3.75、7.5、15μM的Dip G或50μM的Rev处理72小时。使用瑞氏-姬姆萨染色试剂盒对细胞进行染色，然后在光学显微镜下放大200倍进行拍照。

4、流式细胞术检测细胞分化

取HL-60和U937细胞种于六孔板，分别用0、3.75、7.5、15μM的Dip G或50μM的Rev处理。72小时后收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，然后用100μL结合缓冲液重悬，加入CD11b和CD14的抗体后轻轻混匀，室温避光孵育40分钟，然后再加入500μL结合缓冲液，转至流式管中并立即进行流式检测，每个样品收集l×10⁴个细胞，使用FACScan软件(Becton Dickinson，USA)进行分析。

5、NOD/SCID小鼠AML异种移植模型建立及给药

收集对数生长期的HL-60细胞，用预冷的PBS洗涤和重悬，使细胞浓度为1×10⁸个/mL，每只NOD/SCID小鼠在右翼部位皮下注射100μL(1×10⁷个细胞)的细胞悬液。接种两周后，肿瘤平均大小约为50mm³，将小鼠随机分为四组：PBS对照组、Dip G 10mg/kg组、Dip G 20mg/kg组、ATRA 5mg/kg组，每组8-10只。腹腔注射给药，每天一次，持续12天。分组后每两天用游标卡尺测量肿瘤的大小。肿瘤体积计算公式：V＝0.5236×L1×(L2)²(L1是肿瘤的长度，L2是肿瘤的宽度)。第13天时脱颈处死小鼠，剥离肿瘤，称重并拍照。

6、统计分析

数据以mean±MED表示。各组间的比较采用Student’s t test和one-way ANOVA。所有的统计学分析是运用SPSS软件(版本10.0)。*代表P<0.05，**代表P<0.01。P<0.05认为具有统计学意义。

二.Dip G的体外与体内药理试验结果及分析

如图2所示，细胞增殖实验结果表明Dip G(1.875-15μM)可以剂量且时间依赖性地抑制AML细胞株HL-60和U937的增殖，15μM的Dip G与50μM的Rev效果相当。

如图3所示，瑞氏-姬姆萨染色结果表明在Dip G(3.75-15μM)处理72小时后，AML细胞中胞浆/核的比例上升，染色质凝聚增加，显示出更加成熟的细胞形态。而ReV(50μM)的效果不明显。提示Dip G可以促进AML细胞的分化和成熟。

如图4所示，流式细胞术结果表明，AML细胞经Dip G(3.75-15μM)处理72小时后，反映AML细胞分化程度的细胞表面标记分子CD11b和CD14的表达明显增加。进一步证明Dip G可以促进AML细胞的分化。

如图5和图6所示，在小鼠异种移植模型中，与PBS对照组相比，10mg/kg和20mg/kg的Dip G均能够显著抑制肿瘤的生长(*P<0.05)，在治疗终点(给药后第13天)其肿瘤的平均重量比PBS对照组小2倍左右(**P<0.01)。而5mg/kg的ATRA对小鼠肿瘤生长的抑制作用并不明显。这些体内实验数据说明Dip G可以有效地抑制AML的发展。

采用白藜芦醇寡聚体Diptoindonesin G来治疗急性髓性白血病，体外实验发现Dip G能够显著抑制人源AML细胞株的增殖，并促进细胞的分化与成熟。在NOD/SCID小鼠异种移植实验中发现给予Dip G可以显著抑制肿瘤的生长，肿瘤的平均重量也明显下降。DipG处理后肿瘤组织中CD11b阳性的细胞明显增加，表明Dip G可以通过促进AML细胞的分化，从而抑制其体内生长。

以上结果表明Dip G可以通过抑制AML细胞的增殖，促进AML细胞的分化与成熟，从而抑制AML的发展，可用于制备治疗AML的新型药物。