一种生物膜的制备方法以及生物膜与流程

本发明涉及引导组织再生技术领域，尤其涉及一种生物膜的制备方法以及生物膜。

背景技术：

引导组织再生术是一种理想的促进牙周新附着的技术；该技术是将引导组织再生膜覆盖于牙周组织缺损上方，以阻挡生长较快的上皮细胞和成纤维细胞长入缺损区，从而为牙周膜细胞和骨细胞的生长提供一定的空间，促进牙周组织再生。理想的引导组织再生膜应为具有致密层和疏松层的双层结构，所述致密层可以阻挡软组织的侵入，而疏松层的多孔结构更有利于骨细胞的贴附和生长。

在现有技术中，通常采用脱细胞后的动物膜组织作为引导组织再生膜用于临床治疗，在实际生产中，市售的引导组织再生膜基本采用冷冻干燥的形式，冷冻干燥是通过将材料冷冻为固体，在低温低压下将材料中水分升华的一种干燥形式，所得到的材料呈疏松多孔状，能够保持其天然的三维空间结构，有利于细胞的粘附和新生组织的再生。然而，现有技术中直接进行冷冻干燥后所获得的疏松多孔材料的力学性能下降、降解速度较快，在应用于临床时，不能起到很好的阻隔作用，限制了膜组织在临床方面的应用。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于，提供一种生物膜的制备方法以及生物膜。能够在不影响细胞的粘附、迁入和生长的同时，提高所述生物膜的力学性能和降解性能，在应用于临床时，能够起到良好的阻隔作用，为膜组织在临床上的应用创造了条件。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供一种生物膜的制备方法，包括：

步骤1)对哺乳动物膜组织进行脱细胞处理，获得脱细胞处理后的膜组织；所述脱细胞处理后的膜组织为具有致密层和疏松层的双层结构；

步骤2)对所述脱细胞处理后的膜组织进行干燥处理，将所述膜组织中的部分水分挥发出来，使得所述膜组织发生塌陷和收缩，获得收缩后的膜组织，其中，所述收缩后的膜组织的水分含量为20-30％；

步骤3)将收缩后的膜组织进行冷冻干燥，灭菌，获得生物膜。

可选的，所述收缩后的膜组织的疏松层表面的孔径在30-100微米的范围内。

可选的，所述步骤2)中干燥的温度为40-50℃。

可选的，所述步骤2)中干燥的时间为2-3h。

可选的，所述哺乳动物膜组织选自小肠粘膜、腹膜、心包膜、羊膜或者隔膜中的任意一种。

另一方面，本发明实施例提供一种生物膜，采用如上所述的制备方法制备获得。

可选的，所述生物膜的疏松层表面的孔径在30-100微米的范围内。

本发明实施例提供的一种生物膜的制备方法以及生物膜。通过将动物膜组织进行脱细胞处理，并将脱细胞处理后的膜组织进行干燥，以使所述膜组织发生塌陷和收缩，能够使所述膜组织变致密，同时，通过控制所述收缩后的膜组织的水分含量，并在此基础上对收缩后的膜组织进行冷冻干燥，能够对所述膜组织的致密程度进行有效控制，与现有技术中直接采用冷冻干燥相比，能够在不影响细胞的粘附、迁入和生长的情况下，提高所述生物膜的力学性能和降解性能，在将所获得的生物膜用于引导组织再生时，所述生物膜能够起到良好的阻隔作用，为膜组织在临床上的应用创造了条件。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例提供的一种生物膜的制备方法的流程示意图；

图2为本发明实施例提供的直接进行冷冻干燥后所获得的生物膜的疏松层表面的扫描电镜图；

图3为本发明实施例提供的实施例1所获得的生物膜的疏松层表面的扫描电镜图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例所涉及的材料均可以通过商业途径或通过申请人获取。

一方面，本发明实施例提供一种生物膜的制备方法，参见图1，包括：

步骤1)对哺乳动物膜组织进行脱细胞处理，获得脱细胞处理后的膜组织；所述脱细胞处理后的膜组织为具有致密层和疏松层的双层结构；

步骤2)对所述脱细胞处理后的膜组织进行干燥处理，将所述膜组织中的部分水分挥发出来，使得所述膜组织发生塌陷和收缩，获得收缩后的膜组织，所述收缩后的膜组织的水分含量为20-30％；

步骤3)将收缩后的膜组织进行冷冻干燥，灭菌，获得生物膜。

其中，需要说明的是，由于哺乳动物膜组织本身就具有致密层和疏松层，所述致密层由较细小的胶原纤维束紧密排列而成，可以防止软组织长入骨缺损区域，为新骨的生长预留空间；所述疏松层由较粗大的胶原纤维束稀疏排列而成，形成具有多孔结构的粗糙表面，能够提供更大的接触面积，有利于细胞因子吸附及成骨类细胞的贴附生长，加快新骨形成。所述膜组织的力学性能和降解性能与所述膜组织的致密程度有关，通常来讲，所述膜组织越致密，其力学性能和降解性能越好，然而，所述膜组织并不是越致密越好，在实际应用中，需要考虑疏松层表面是否有利于细胞的粘附、迁入和生长，因此，在一定程度上提高所述膜组织的致密程度，以使得生物膜能够起到良好的阻隔作用的情况下，还需要考虑细胞在所述疏松层表面的粘附、迁入和生长情况。

通过实验发现，所述收缩后的膜组织的水分含量控制在该范围内时，所获得的膜组织由乳白色或者粉白色变为半透明状，其能够在保证疏松层表面的孔径适合细胞的粘附、迁入和生长的同时，提高所述膜组织的力学性能和降解性能，在将所获得的生物膜用于临床时，能够起到良好的阻隔作用，还能够延长所述生物膜的降解周期，防止成纤维细胞的长入，保护成骨细胞生长。

本发明实施例提供的一种生物膜的制备方法。通过将动物膜组织进行脱细胞处理，并将脱细胞处理后的膜组织进行干燥，以使得所述膜组织发生塌陷和收缩，能够使所述膜组织变致密，同时，通过控制所述收缩后的膜组织的水分含量，并在此基础上对所述收缩后的膜组织进行冷冻干燥，能够对所述膜组织的致密程度进行有效控制，与现有技术中直接采用冷冻干燥相比，能够在不影响细胞的粘附、迁入和生长的情况下，提高所述生物膜的力学性能和降解性能，使得在将所获得的生物膜用于引导组织再生时，所述生物膜能够起到良好的阻隔作用，为膜组织在临床上的应用创造了条件。

进一步优选的，所述收缩后的膜组织的疏松层表面的孔径在30-100微米的范围内。疏松层表面的孔径在该范围内时，能够在不影响细胞的粘附、迁入和生长的情况下，延长该生物膜的降解周期。

这里，由于膜组织是一种天然材料，本身其疏松层表面的孔径分布并不均匀，有的大，有的小，在本发明实施例中，通过对膜组织进行收缩处理，能够从整体上减小每个孔径的大小，使得所述收缩后的膜组织的疏松层表面的孔径小于仅通过冷冻干燥所获得的膜组织，并且，所选用的膜材料的种类不同，其孔径的分布范围也有所差异，因此，30-100微米仅仅是所述疏松层表面的孔径的一个分布范围。

其中，对所述步骤2)中干燥的温度和干燥方式不做限定，只要能够将所述膜组织中的部分水分挥发出来，使得所述膜组织发生塌陷和收缩即可。因此，在进行干燥处理时，可以通过晾干或者烘干的方式将所述膜组织中的部分水分挥发出来。

在避免胶原发生变性的情况下，为了提高干燥速率，优选的，所述步骤2)中干燥的温度为40-50℃。

优选的，所述步骤2)中干燥的时间为2-3h。通过实验发现，通过对干燥的时间进行有效控制，能够获得具有一定收缩程度的膜组织，从而能够对成品的质量进行有效控制。

其中，还需要说明的是，在通过烘干进行处理时，可以在常压下进行烘干，也可以抽真空进行烘干，在真空条件下进行烘干处理时，能够提高干燥效果。

进一步地，对所述冷冻干燥的温度和时间均不做限定，只要能够将生物膜能够保持收缩后的膜组织的结构即可。

其中，对所述哺乳动物膜组织的种类不做限定，所述哺乳动物膜组织可以通过商业途径获得。优选的，所述哺乳动物膜组织选自小肠粘膜、腹膜、心包膜、羊膜或者隔膜中的任意一种。这些哺乳动物膜组织在脱细胞处理后，能够保持原有的双层结构。

其中，对所述步骤1)中脱细胞处理的具体操作不做限定，由于刚采购回来的膜组织为乳白色或粉白色组织，上面含有成纤维细胞、脂肪组织、结缔组织、污物、纤维、杂质等，因此，需要对所述膜组织进行脱细胞处理，去除膜组织上的活细胞以及免疫原性物质，以获得具有致密层和疏松层的双层膜结构。

在此对哺乳动物膜组织进行脱细胞的处理方法不做限定，只要所获得的膜组织为具有致密层和疏松层的双层结构即可。

本发明的一优选实施例中，所述步骤1)具体包括：

步骤11)剔除哺乳动物膜组织表面的脂肪组织、结缔组织，获得初步处理后的膜组织；

步骤12)将初步处理后的膜组织用碱溶液浸泡进行脱细胞，获得脱细胞后的膜组织；

步骤13)将脱细胞后的膜组织用有机溶剂浸泡进行脱脂，获得脱细胞处理后的膜组织。

在本发明实施例中，通过采用碱溶液浸泡对初步处理后的膜组织进行脱细胞，能够有效去除所述膜组织中的细胞及杂蛋白成分，降低或去除膜组织的免疫原性，去除病毒，并能够同时保留膜组织的三维胶原纤维结构，碱溶液具有优良的脱细胞性能，而后，采用有机溶剂浸泡的方法进行脱脂，利用了“相似相容”原理，能够有效溶解脂肪或者脂溶性杂质，能够进一步有效降低或者去除免疫原性，提高产品的安全性。

其中，所述碱溶液可以为氢氧化钠、氢氧化钾或者氢氧化钙水溶液，为了避免碱溶液浓度过大，腐蚀性过强造成膜组织损坏，碱溶液浓度过小对免疫原性去除不彻底，优选的，所述碱溶液的浓度可以为0.1-1.0mol/l，脱细胞的时间可以为10-60分钟；在脱细胞处理完成之后，可以采用磷酸盐缓冲液对其进行清洗，去除碱溶液残留，优选的，采用纯水清洗2-4次，每次10分钟，以使最后一次清洗的水溶液的ph值为6.0-8.0。

在通过有机溶剂浸泡进行脱脂处理的过程中，可以采用摇床振荡、超声等辅助方式提高脱脂效率，节约脱脂时间。

其中，所述有机溶剂可以为氯仿、异丙醇、乙酸乙酯、正己烷等中的一种或几种混合物。

通过实验发现，采用丙酮或者异丙醇进行脱脂能够进一步节约脱脂时间，提高脱脂效率以及产品安全性，降低脱脂成本。优选的，脱细胞处理后的膜组织中的脂肪含量控制在1％以下。

另一方面，本发明实施例提供一种生物膜，采用如上所述的制备方法制备获得。

本发明实施例提供的一种生物膜。通过将动物膜组织进行脱细胞处理，并将脱细胞处理后的膜组织进行干燥，以使得所述膜组织发生塌陷和收缩，能够使所述膜组织变致密，同时，通过控制所述收缩后的膜组织的水分含量，并在此基础上对收缩后的膜组织进行冷冻干燥，能够对所述膜组织的致密程度进行有效控制，与现有技术中直接采用冷冻干燥相比，能够在不影响细胞的粘附、迁入和生长的情况下，提高所述生物膜的力学性能和降解性能，使得在将所获得的生物膜用于引导组织再生时，所述生物膜能够起到良好的阻隔作用，为膜组织在临床上的应用创造了条件。

优选的，所述生物膜的疏松层表面的孔径在30-100微米的范围内。疏松层表面的孔径在该范围内时，能够在不影响细胞的粘附、迁入和生长的情况下，延长所述生物膜的降解周期，保护成骨细胞生长。

实施例

下面的实施例用来说明本发明，并不是想限制本发明的范围。以下实施例仅以具体实施过程中各组分的实际添加浓度为例进行说明，实际使用时，各组分的浓度并不对本发明目的的实现构成影响。

对照例

s101、将牛心包表面的脂肪组织剔除，清洗表面异物，获得初步去脂后的牛心包；

s102、将初步去脂后的牛心包用5倍量的1m的氢氧化钠浸泡1.0h，获得脱细胞后的牛心包；

s103、用3份质量为所述脱细胞后的膜组织15倍的磷酸盐缓冲液分别对所述脱细胞后的牛心包清洗15min，使得所述牛心包的ph值为6.0；

s104、将步骤s103所获得的牛心包用5倍量的异丙醇振荡脱脂3h，获得脱脂后的牛心包，所述脱脂后的牛心包的脂肪含量为0.8％；

s105、用5份质量为所述脱脂后的牛心包15倍的水分别对所述脱脂后的牛心包清洗15min，使得所述异丙醇残留量的质量浓度为55μg/g；

s106、将脱脂后的牛心包冷冻干燥20h，辐照灭菌，得到生物膜；参见图2，通过扫描电镜观察获得：所述生物膜的疏松层表面的孔径在70-300微米的范围内。

实施例1

s101、将牛心包表面的脂肪组织剔除，清洗表面异物，获得初步去脂后的牛心包；

s102、将初步去脂后的牛心包用5倍量的1m的氢氧化钠浸泡1.0h，获得脱细胞后的牛心包；

s103、用3份质量为所述脱细胞后的膜组织15倍的磷酸盐缓冲液分别对所述脱细胞后的牛心包清洗15min，使得所述牛心包的ph值为6.0；

s104、将步骤s103所获得的牛心包用5倍量的异丙醇振荡脱脂3h，获得脱脂后的牛心包，所述脱脂后的牛心包的脂肪含量为0.8％；

s105、用5份质量为所述脱脂后的牛心包15倍的水分别对所述脱脂后的牛心包清洗15min，使得所述异丙醇残留量的质量浓度为55μg/g；

s106、将脱脂后的牛心包平铺，放入干燥箱中45℃干燥2.5h，使得所述牛心包发生塌陷和收缩，获得收缩后的膜组织，所获得的收缩后的膜组织的水分含量为25％；

s107、将收缩后的膜组织进行冷冻干燥8h，辐照灭菌，得到生物膜；参见图3，通过扫描电镜观察获得：所述生物膜的疏松层表面的孔径在30-80微米的范围内。

实施例2

以猪心包膜为原材料，按照以下方法制备生物膜。

按照实施例1的方法进行组织前处理、脱细胞、脱脂后，将猪心包膜平铺，放入干燥箱中40℃干燥2h，使得所述猪心包膜发生塌陷和收缩，获得收缩后的膜组织，所获得的收缩后的膜组织的水分含量为30％；将收缩后的膜组织进行冷冻干燥10h，辐照灭菌，得到生物膜；通过扫描电镜观察获得：所述生物膜的疏松层表面的孔径在30-100微米的范围内。

实施例3

以猪腹膜为原材料，按照以下方法制备生物膜。

按照实施例1的方法进行组织前处理、脱细胞、脱脂后，将猪腹膜平铺，放入干燥箱中在50℃抽真空干燥3h，使得所述猪腹膜发生塌陷和收缩，获得收缩后的膜组织，所获得的收缩后的膜组织的水分含量为20％；将收缩后的膜组织进行冷冻干燥6h，辐照灭菌，得到生物膜；通过扫描电镜观察获得：所述生物膜的疏松层表面的孔径在30-60微米的范围内。

实施例4

以猪小肠粘膜为原材料，按照以下方法制备生物膜。

按照实施例1的方法进行组织前处理、脱细胞、脱脂后，将猪小肠粘膜平铺，放入干燥箱中43℃干燥2h，使得所述猪小肠粘膜发生塌陷和收缩，获得收缩后的膜组织，所获得的收缩后的膜组织的水分含量为25％；将收缩后的膜组织进行冷冻干燥5h，辐照灭菌，得到生物膜；通过扫描电镜观察获得：所述生物膜的疏松层表面的孔径在40-80微米的范围内。

实验例

将对照例所获得的生物膜与实施例1-4所获得的生物膜进行复水，并对其进行拉伸强度测试，获得如下表1所示数据：

表1

由表1可知：本发明实施例的力学性能有明显的提高，在应用于临床时，能够起到良好的支撑和阻隔作用，有利于组织的再生。

结论：本发明实施例提供的生物膜的制备方法工艺简单，通过将动物膜组织进行脱细胞处理，并将脱细胞处理后的膜组织进行干燥，以使得所述膜组织发生塌陷和收缩，能够使所述膜组织变致密，同时，通过控制所述收缩后的膜组织的水分含量，并在此基础上对所述收缩后的膜组织进行冷冻干燥，能够对所述膜组织的致密程度进行有效控制，与现有技术中直接采用冷冻干燥相比，能够在不影响细胞的粘附、迁入和生长的情况下，提高所述生物膜的力学性能和降解性能，使得在将所获得的生物膜用于引导组织再生时，所述生物膜能够起到良好的阻隔作用，为膜组织在临床上的应用创造了条件。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。