本发明涉及一种羧甲基壳聚糖的新用途，具体涉及羧甲基壳聚糖在制备或筛选用于提高免疫力的产品中的用途。
背景技术：
羧甲基壳聚糖是一种水溶性壳聚糖衍生物，有许多特性，如抗菌性强，具有保鲜作用，是一种两性聚电解质等。在化妆品、保鲜、医药等方面有多种应用，也是近年来研究得较多的壳聚糖衍生物之一。
羧甲基甲壳素的羧甲基是在糖残基的c6-oh上发生取代，有少量羧甲基在c3-oh上发生取代，生成的是o-羧甲基甲壳素。壳聚糖中，羧甲基既会在-oh上发生取代，也会在-nh上发生取代，生成o-羧甲基和n-羧甲基壳聚糖，实际上的取代情况有：c6-o-羧甲基、c2-n-羧甲基、c3-o-羧甲基、c6-o、c2-n-羧甲基等。由于c3上的位阻效应以及c2和c3之间的分子内氢键，使c3位上的羧甲基化比较难发生，所以羟基上的羧甲基取代，c3-o羧甲基较少一些，而以c6-o羧甲基为主。对于c6-oh与c2-nh来说，在碱性条件下羧甲基在羟基上的取代活性要高于氨基，因此，当取代度小于1时，羧甲基的取代主要是在羟基上而不是氨基上，只有取代度接近1和高于1时，才会同时在氨基上发生羧甲基取代，形成o,n-羧甲基壳聚糖。羧甲基壳聚糖的水溶性，除了因为它是一种羧酸钠盐而溶于水外，还有一个原因是羧甲基的导入，破坏了壳聚糖分子的二次结构，使其结晶度大大降低，几乎成为无定形。
现有技术中公开了羧甲基壳聚糖具有吸湿、保湿、抑菌的用途，但并没有公开其具有提高免疫力的用途。
技术实现要素：
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种羧甲基壳聚糖的新用途。
为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现的。
本发明公开了一种羧甲基壳聚糖在制备或筛选用于提高免疫力的产品中的用途。
具体地，所述羧甲基壳聚糖为o-羧甲基脱乙酰壳多糖。所述o-羧甲基脱乙酰壳多糖为羧甲基甲壳素脱乙酰化后或壳聚糖的6-羟基氢被羧甲基取代后的部分羧甲基化的脱乙酰壳多糖。
更为具体地，所述o-羧甲基脱乙酰壳多糖的结构式如下所示：
其中r1为ch2coona；r2为ch2coona或h；r3为ch2coona或h或coch3。
现有技术中羧甲基壳聚糖的种类很多，但是并不是所有的羧甲基壳聚糖具有治疗皮肤瘙痒的效果。具体地，所述羧甲基壳聚糖的数均分子量为1000～20000。所述数均分子量是按照《中华人民共和国药典(四部)》(2015年版)通则0401“紫外-可见分光光度法”方法测定a525。其原理为：乙酰丙酮试剂与标准氨基葡萄糖、羧甲基脱乙酰壳多糖或其水解液的还原性端基反应产生色原；一定条件下，吸光度a525与相应糖的摩尔浓度具有线性关系。水解后比水解前增加的还原性端基的倍数就是该羧甲基脱乙酰壳多糖的平均聚合度n，结合分子中糖单元平均分子质量可以计算出该糖的数均分子质量。
优选地，所述羧甲基壳聚糖为o-羧甲基脱乙酰聚多糖；所述羧甲基壳聚糖的数均分子量为221～20000。更优选地，所述羧甲基壳聚糖的数均分子量为1000～20000。
优选地，所述羧甲基壳聚糖的制备方法包括将数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料通过双氧水降解、酶解或酸解。优选地，所述数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料中羧甲基壳聚糖的数均分子量30～70万。更优选地，所述数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料中羧甲基壳聚糖的数均分子量20～130万。
优选地，所述用途包括以下特征中的一种或多种：
所述数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料中羧甲基取代度为0.8～1.3；
所述数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料中羧甲基o位取代度为0.7～1.3，n位取代度不
超过0.3；
双氧水降解的工艺为：将双氧水在搅拌条件下加入数均分子量较高的羧甲基壳聚糖中进
行降解反应，降解反应过程中加碱使得反应体系的ph为8.0～8.5，直至反应体系的粘度
为80～120cp时加入亚硫酸钠停止反应；
所述羧甲基壳聚糖的制备方法包括对双氧水降解后的羧甲基壳聚糖进行酸析洗涤。
更优选地，降解反应中，反应温度为25～45℃。由上述降解反应即获得降解后的羧甲基壳聚糖。
优选地，所述酸析洗涤是指用酸调整双氧水降解后的羧甲基壳聚糖料体至ph为6～7，加入乙醇至淡黄色晶体析出，再用酒精反复洗涤，甩干，干燥获得羧甲基壳聚糖。
所述数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料为由国内申请号为2013105362023的发明专利公开的方法制备获得，其公开了一种制备羧甲基壳聚糖的方法，所述的方法是以甲壳素为原料，先将甲壳素碱化，使用冷热交替法进行脱乙酰化反应，生产壳聚糖钠盐，再在碱性条件下进行羧化反应，获得数均分子量较高的羧甲基壳聚糖产品。本发明方法工艺简单且易于控制，避免了壳聚糖分子链脱乙酰化反应时因长期高温反应出现的断链现象，从而获得了一种高粘度、高取代度和水溶性更好的羧甲基壳聚糖，适合大规模工业化生产。所述分子量较高的羧甲基壳聚糖溶解的ph范围为4.5～14.0。所述的数均分子量较高的羧甲基壳聚糖可以溶解在ph为4.5～6.5的酸性溶液中。与传统工艺获得的羧甲基壳聚糖溶解的ph范围为7.0～14.0相比，上述专利方法获得的数均分子量较高的羧甲基壳聚糖溶解的ph范围更宽，拓宽了其应用领域。
本发明还公开了一种用于提高免疫力的组合物，所述组合物的原料组分包括羧甲基壳聚糖，所述组合物包括以下原料组分及重量份：
本发明还公开了一种如上述所述组合物的制备方法，包括如下步骤：将各原料组分干燥后粉碎过网筛获得，然后混合均匀后装入胶囊中获得胶囊制剂。
优选地，所述过网筛为过60～100目网筛。更优选地，所述过网筛为过60～80目网筛。
优选地，所述干燥的温度为20～35℃，干燥至颗粒水分含量低于1.5％。
本发明还公开了如上述所述组合物在制备或筛选提高免疫力的药物中的用途。
本申请中所采用的羧甲基壳聚糖溶解的ph范围为4.5～14.0；人体摄入本申请中的羧甲基壳聚糖后，由于其能够很好的溶于水和血液中，在胃中ph＜4.5的酸性环境下是絮状物，不溶解，则羧甲基壳聚糖在胃中酸性条件下并没有被破坏，达到小肠之后在小肠内ph≥8开始被吸收，从而可以进入血液，其在血液和体液的碱性条件下溶解性能好，此时能够很好发挥其生物活性，羧甲基壳聚糖可以作为保健品长期服用，其对于人体高血压疾病有很好的预防效果和提高免疫力效果。本发明中还公开了将其与其他物质组合形成组合物形成一种提高免疫力的药片；这种药片含有环糊精作为吸收促进剂、以海藻酸钠作为粘结剂和崩解剂与具有提高免疫力效果又易于崩解的羧甲基壳聚糖共同作用使得最终获得的组合物具有更好的提高免疫力效果；其也可以与其他的提高免疫力药联合使用，大大减少通常提高免疫力西药的使用量和副作用，而且治疗效果明显，可显著地减缓或消除其他并发症。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1
本实施例中为制备数均分子量为2000的羧甲基壳聚糖。
采用数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料用双氧水降解，所述数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料的数均分子量为30w、羧甲基取代度为0.8～1.3，其中，o为羧甲基取代度为0.7～1.0，n位取代度不超过0.3。
双氧水降解的工艺为：将双氧水在搅拌条件下加入数均分子量较高的羧甲基壳聚糖中进行降解反应，降解反应过程中加碱使得反应体系的ph为8.0，直至反应体系的粘度为80～120cp时加入亚硫酸钠停止反应，本实施例中当粘度达到88cp时停止反应。降解反应中，反应温度为室温。
所述羧甲基壳聚糖的制备方法包括对双氧水降解后的羧甲基壳聚糖进行酸析洗涤。所述酸析洗涤是指用酸调整双氧水降解后的羧甲基壳聚糖料体至ph为6.5，加入乙醇至淡黄色晶体析出，再用酒精反复洗涤，甩干，干燥获得羧甲基壳聚糖。
实施例2
本实施例中采用数均分子量为8000的羧甲基壳聚糖。
采用数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料用双氧水降解，所述数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料的数均分子量为40w、羧甲基取代度为0.8～1.3，其中，o为羧甲基取代度为0.7～1.0，n位取代度不超过0.3。
双氧水降解的工艺为：将双氧水在搅拌条件下加入数均分子量较高的羧甲基壳聚糖中进行降解反应，降解反应过程中加碱使得反应体系的ph为8.5，直至反应体系的粘度为100cp时加入亚硫酸钠停止反应。降解反应中，反应温度为室温。
所述羧甲基壳聚糖的制备方法包括对双氧水降解后的羧甲基壳聚糖进行酸析洗涤。所述酸析洗涤是指用酸调整双氧水降解后的羧甲基壳聚糖料体至ph为6，加入乙醇至淡黄色晶体析出，再用酒精反复洗涤，甩干，干燥获得羧甲基壳聚糖。
实施例3
本实施例中采用数均分子量为15000的羧甲基壳聚糖。
采用数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料用双氧水降解，所述数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料的数均分子量为55w、羧甲基取代度为0.8～1.3，其中，o为羧甲基取代度为0.7～1.0，n位取代度不超过0.3。
双氧水降解的工艺为：将双氧水在搅拌条件下加入数均分子量较高的羧甲基壳聚糖中进行降解反应，降解反应过程中加碱使得反应体系的ph为8.5，直至反应体系的粘度为90cp时加入亚硫酸钠停止反应。降解反应中，反应温度为室温。
所述羧甲基壳聚糖的制备方法包括对双氧水降解后的羧甲基壳聚糖进行酸析洗涤。所述酸析洗涤是指用酸调整双氧水降解后的羧甲基壳聚糖料体至ph为7，加入乙醇至淡黄色晶体析出，再用酒精反复洗涤，甩干，干燥获得羧甲基壳聚糖。
实施例4
本实施例中采用数均分子量为20000的羧甲基壳聚糖。
采用数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料用双氧水降解，所述数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料的数均分子量为70w、羧甲基取代度为0.8～1.3，其中，o为羧甲基取代度为0.7～1.0，n位取代度不超过0.3。
双氧水降解的工艺为：将双氧水在搅拌条件下加入数均分子量较高的羧甲基壳聚糖中进行降解反应，降解反应过程中加碱使得反应体系的ph为8.2，直至反应体系的粘度为120cp时加入亚硫酸钠停止反应。降解反应中，反应温度为室温。
所述羧甲基壳聚糖的制备方法包括对双氧水降解后的羧甲基壳聚糖进行酸析洗涤。所述酸析洗涤是指用酸调整双氧水降解后的羧甲基壳聚糖料体至ph为7，加入乙醇至淡黄色晶体析出，再用酒精反复洗涤，甩干，干燥获得羧甲基壳聚糖。
实施例5
本实施例中采用实施例1中制备的羧甲基壳聚糖形成提高免疫力组合物。
所述组合物包括以下原料组分及重量份：
将各原料组分干燥后粉碎过网筛，然后混合均匀后装入胶囊中获得胶囊制剂。所述过筛为过60～100目网筛。所述干燥的温度为35℃，干燥至颗粒水分含量低于1.5％。
实施例6
本实施例中采用实施例1中制备的羧甲基壳聚糖形成提高免疫力组合物。
所述组合物包括以下原料组分及重量份：
将各原料组分干燥后粉碎过网筛，然后混合均匀后装入胶囊中获得胶囊制剂。所述过筛为过80目网筛。所述干燥的温度为20℃，干燥至颗粒水分含量低于1.5％。
实施例7
本实施例中采用实施例1中制备的羧甲基壳聚糖形成提高免疫力组合物。
所述组合物包括以下原料组分及重量份：
将各原料组分干燥后粉碎过网筛，然后混合均匀后装入胶囊中获得胶囊制剂。所述过筛为过80目网筛。所述干燥的温度为30℃，干燥至颗粒水分含量低于1.5％。
实施例8
本实施例中采用实施例1中制备的羧甲基壳聚糖形成提高免疫力组合物。
所述组合物包括以下原料组分及重量份：
将各原料组分干燥后粉碎过网筛，然后混合均匀后装入胶囊中获得胶囊制剂。所述过筛为过80～100目网筛。所述干燥的温度为25℃，干燥至颗粒水分含量低于1.5％。
将实施例5～8中制备的羧甲基壳聚糖作为试验样品进一步阐释本发明所述保健品的提高免疫力效果。
实验组选择大鼠，9～10周龄，体重为170～190g，雌雄兼购200只，每个剂量组10只。
实验设有采用实施例1、实施例2、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8中的提高免疫力药物的实验组和1个空白对照组。
其中实施例1和实施例2中，以成人推荐量每日口服600mg/d，按照成人60kg体重计算，即10mg/(kg体重)，给予实验动物以10mg/(kg体重)的5倍、10倍、15倍进行实验观察，给予时间共4周；对照组采用空白对照。
实施例5、实施例6、实施例7和实施例8中，按照每个成年人每次服用2粒，每日需服用2次，2×2×(2粒胶囊中药物的重量)，按照成年人体重60kg换算，给予实验动物以(2粒胶囊中药物的重量)/15的1倍和5倍，每天摄入两次，两次摄入相同剂量。
具体结果见表1，其中表1中：
实施例1-1为每天采用实施例1中物质给予实验动物以10mg/(kg体重)的5倍的剂量；
实施例1-2为每天采用实施例1中物质给予实验动物以10mg/(kg体重)的10倍的剂量；
实施例1-3为每天采用实施例1中物质给予实验动物以10mg/(kg体重)的15倍的剂量；
实施例2-1为每天采用实施例2中物质给予实验动物以10mg/(kg体重)的5倍的剂量；
实施例2-2为每天采用实施例2中物质给予实验动物以10mg/(kg体重)的10倍的剂量；
实施例2-3为每天采用实施例2中物质给予实验动物以10mg/(kg体重)的15倍的剂量；
实施例5-1为每天采用实施例5中物质给予实验动物以10mg/(kg体重)的1倍的剂量；
实施例5-2为每天采用实施例5中物质给予实验动物以10mg/(kg体重)的5倍的剂量；
实施例6-1为每天采用实施例6中物质给予实验动物以10mg/(kg体重)的1倍的剂量；
实施例6-2为每天采用实施例6中物质给予实验动物以10mg/(kg体重)的5倍的剂量；
实施例7-1为每天采用实施例7中物质给予实验动物以10mg/(kg体重)的1倍的剂量；
实施例7-3为每天采用实施例7中物质给予实验动物以10mg/(kg体重)的5倍的剂量；
实施例8-1为每天采用实施例8中物质给予实验动物以10mg/(kg体重)的1倍的剂量；
实施例8-2为每天采用实施例8中物质给予实验动物以10mg/(kg体重)的5倍的剂量。
由表1中可以看出：将给予大鼠不同计量的本发明中的羧甲基壳聚糖及尤其形成的组合物，与对照组相比，采用本申请中的药物的高剂量组可以提高大鼠免疫力(p＜0.05)。给予大鼠不同计量的提高免疫力功能的制品第四周，与空白对照组相比，所述实施例5～8中的组合物形成的片剂能够更好的提高大鼠免疫力(p＜0.05)。
1)cona诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(mtt法)
无菌取脾，置于盛有适量无菌hank’s液的培养皿中，制成细胞悬液，经200目筛网过滤。用hank’s液洗2次，每次离心10分钟(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1ml完全培养液汇总，计数活细胞数，用rpmi1640培养液调整细胞浓度为3×106个/ml。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，没孔1ml，在其中一孔加75μlcona液，另一孔作为对照，置于5％二氧化碳，30℃培养72h。在培养结束前。每孔吸去上清液0.5ml，加入0.5ml不含小牛血清的rpmi1640培养液，同时加入mtt(5mg/ml)5μl/孔。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使得紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪，以570nm波长测定光密度值。淋巴细胞的增殖能力用加cona孔的光密度值减去不加cona孔的光密度值表示。具体实验结果如表1所示。
2)抗体生成细胞检测(jerne改良玻片法)
取羊血用生理盐水洗涤，并进行离心，将压积srbc用生理盐水配成2％(v/v)的细胞悬液，过200目网筛、洗涤、离心，最后将细胞悬浮在8mlhanks液中。计数细胞，将细胞浓度调整为5×106个/ml。将表层培养基加热溶解后与等量的ph为7.1,2倍浓度的hanks液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加入用sa液配制的10％srbc50μl(v/v)、20μl脾细胞悬液(5×106个/ml)，迅速混匀后倾倒于已刷薄层琼脂糖的玻片上，放入二氧化碳培养箱中温育1.5h，将用sa液稀释的补体(1:8)加入到玻片凹槽内继续温育1.5h后计数溶血空斑数。具体结果如表2所示。
表1
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。