本发明涉及医药领域，更具体的说是涉及一种载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物的制备方法。
背景技术：
骨质疏松症是一种渐进性的骨吸收和骨形成失衡的系统性骨疾病，骨质疏松症发生的细胞学基础是相对较弱的成骨细胞活性和/或较强的破骨细胞活性，导致了骨代谢失衡。目前的骨质疏松治疗药物可以分为两大类，抗骨吸收药物和促骨合成药物，抗骨吸收药物的主要作用机理是以破骨细胞为靶标，抑制病理性骨吸收。而促骨合成药物以成骨细胞为靶标，主要促进骨合成代谢和骨形成，使骨容量和骨密度增加。然而，大多数抗骨吸收药物有抑制骨质合成，促骨合成药有非特异性促进骨吸收的副作用。为了获得更好的疗效，一些学者也尝试联合应用抗骨吸收药和促骨合成药物，然而联合用药并不一定比单一药物具有更好的疗效，产生这种现象的原因是：不管是促骨合成药物还是抗骨质吸收药物，药物在骨组织内均是非特异性分布，药物可以同时作用于成骨细胞和破骨细胞，不可避免地带来副作用。目前的骨靶向药物传递系统仅仅能实现骨组织靶向，而不能实现药物在骨组织内精准的细胞靶向传递。
骨的吸收和重建是一个动态平衡的过程，骨改建过程发生于所有骨的bmu中，包括活化、骨吸收、反转和骨形成四个不同阶段并不断循环发生，从而在bmu中形成明显的骨吸收区和骨形成区。成骨细胞和破骨细胞在bmu中的空间分布明显不同。在骨吸收区，大量破骨细胞附着于成熟骨表面使骨溶解；在骨形成区，成骨细胞成为主导细胞并形成新骨。在骨吸收区均为成熟骨质，矿化程度高，羟基磷灰石结晶度高；而在骨形成区为新生骨质，矿化程度低，羟基磷灰石结晶度低。一些特殊多肽对不同结晶度羟基磷灰石显示出了选择性吸附特性，天冬氨酸、丝氨酸重复序列可特异性吸附在低结晶度羟基磷灰石表面；在体外天冬氨酸、丝氨酸重复序列也显示出良好地吸附至成骨细胞矿化结节和无定形磷酸钙的特性。促骨合成药物在天冬氨酸、丝氨酸重复序列引导下可以特异性作用于骨形成区集聚的成骨细胞。因此，天冬氨酸、丝氨酸重复序列可以作为特异性靶向分子，实现促骨合成药物的细胞靶向传递。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物的制备方法，使促骨合成药物在天冬氨酸、丝氨酸重复序列引导下可以特异性作用于骨形成区集聚的成骨细胞，可以大大减少促骨合成药物促进骨吸收的副作用。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物的制备方法，
步骤一、采用多肽固相合成法制备sdssdc；
步骤二、在脂质体上外接sdssdc，得到sdssdc-脂质体；
步骤三、以促骨合成药物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga、卵磷脂和sdssdc-脂质体为原料制备载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物。
作为本发明的进一步改进，所述脂质体为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺共聚、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺共聚、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-硅烷共聚、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基共聚或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇共聚的一种。
作为本发明的进一步改进，所述步骤二中合成sdssdc-脂质体的具体步骤如下：
采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂活化sdssdc羧基端3-4h，再加入脂质体，在室温下混合反应12-24h，透析，冻干，待用。
作为本发明的进一步改进，所述sdssdc与脂质体的质量比为1：10-1:20。
作为本发明的进一步改进，所述步骤三的具体步骤如下：
a、将9-12mg卵磷脂、4-6mgsdssdc-脂质体溶于15-25ml质量浓度3-6％的乙醇水溶液中得到a溶液；
b、将促骨合成药物加入到水或乙腈中混合均匀，然后倒入a溶液中并混合均匀得到b溶液，使促骨合成药物的浓度为200-400ug/ml；
c、将plga溶于质量分数为80％的乙腈水溶液中得到浓度为2mg/ml的c溶液，将20-30mlc溶液加入b溶液中混合均匀得到d溶液；
d、将d溶液用超声破碎仪超声5-10min，期间逐滴加完毕5-15mlc溶液；
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kda的超滤管内离心超滤三次，即得载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物。
6、根据权利要求5所述的一种载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物的制备方法，其特征在于：步骤a中向a溶液中加入5-10ml浓度为40-80mg/ml的蔗糖、甘露糖、人血蛋白或明胶水溶液中的一种保护剂。
作为本发明的进一步改进，所述卵磷脂为大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和氢化蛋黄卵磷脂中的一种或几种。
作为本发明的进一步改进，所述步骤d中超声破碎仪的频率为21-25khz，功率为130-140w。
作为本发明的进一步改进，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga中乙交酯：丙交酯＝20:60～85:15，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为2000-50000。
作为本发明的进一步改进，所述促骨合成药物为特立帕肽或甲状旁腺素中的一种。
本发明利用bmu中破骨细胞集聚的骨吸收区和成骨细胞集聚的骨形成区的骨质矿化差异，设计一种特异选择性的纳米靶向药物传递系统，以外接sdssdc的脂质体、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和卵磷脂为原料，并加入促进骨合成药物，合成载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物，装载促骨合成药物的纳米颗粒与矿化程度低的羟基磷灰石有特异亲和力，进入骨组织后特异性分布于成骨细胞聚集的骨形成区，可以大大减少促骨合成药物促进骨吸收的副作用。纳米载药系统有自身长循环、靶向、缓控释等优势，可以克服现有促骨合成药物生物利用率低、稳定性差、药理作用时间短等缺陷。
附图说明
图1为本发明制备的载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物的制备过程示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明做进一步的详述。
多肽ser-asp-ser-ser-asp-cys简称sdssdc；
二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺简称dspe-peg-maleimide；
二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺简称dspe-peg-nhs；
二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-硅烷简称dspe-peg-silane；
二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇简称mpeg-dspe；
二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基简称dspe-peg-nh2；
聚乳酸-羟基乙酸共聚物简称plga。
实施例1
一种载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物的制备方法：
步骤一、采用多肽固相合成法制备sdssdc。
步骤二、在dspe-peg-nhs上外接sdssdc，得到dss6-dspe-peg-nhs；
首先将10mg的sdssdc溶解于30ml磷酸缓冲溶液中，然后加入4.8mg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和3.5mgn-羟基琥珀酰亚胺活化sdssdc羧基端3h，再加入160mgdspe-peg-nhs，在室温和搅拌下混合反应18h，透析，冻干，待用。
步骤三、以特立帕肽、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、氢化大豆卵磷脂和dss6-dspe-peg-nhs为原料制备载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物：
所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乙交酯：丙交酯＝10：3，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为20000。
a、将10mg氢化大豆卵磷脂、5.5mgdss6-dspe-peg-nhs溶于18ml质量浓度4％的乙醇水溶液中得到a溶液；再加入6ml浓度为50mg/ml的人血蛋白水溶液；
b、将特立帕肽加入到30ml的乙腈中混合均匀，然后倒入a溶液中并混合均匀得到b溶液，使b溶液中特立帕肽的浓度为200ug/ml；
c、将plga溶于质量分数为80％的乙腈水溶液中得到浓度为200mg/ml的c溶液，将25mlc溶液加入b溶液中混合均匀得到d溶液；
d、将d溶液用超声破碎仪超声5min，期间逐滴加完毕8mlc溶液；超声破碎仪的频率为22khz，功率为130w。
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kda的超滤管内离心超滤三次，即得载特立帕肽纳米颗粒脂-聚合物。
实施例2
一种载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物的制备方法：
步骤一、采用多肽固相合成法制备sdssdc。
步骤二、在dspe-peg-nh2上外接sdssdc，得到dss6-dspe-peg-nh2；
首先将10mg的sdssdc溶解于30ml磷酸缓冲溶液中，然后加入5.5mg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和4.3mgn-羟基琥珀酰亚胺活化sdssdc羧基端4h，再加入180mgdspe-peg-nhs，在室温和搅拌下混合反应23h，透析，冻干，待用。
步骤三、以特立帕肽、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、大豆卵磷脂和dss6-dspe-peg-nhs为原料制备载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物：
所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乙交酯：丙交酯＝13：3，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为30000。
a、将9.5mg大豆卵磷脂、11.5mgdss6-dspe-peg-nhs溶于25ml质量浓度3％的乙醇水溶液中得到a溶液；再加入8ml浓度为50mg/ml的蔗糖水溶液；
b、将特立帕肽加入到50ml的乙腈中混合均匀，然后倒入a溶液中并混合均匀得到b溶液，使b溶液中特立帕肽的浓度为400ug/ml；
c、将plga溶于质量分数为80％的乙腈水溶液中得到浓度为200mg/ml的c溶液，将30mlc溶液加入b溶液中混合均匀得到d溶液；
d、将d溶液用超声破碎仪超声10min，期间逐滴加完毕15mlc溶液；超声破碎仪的频率为214khz，功率为135w。
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kda的超滤管内离心超滤三次，即得载特立帕肽纳米颗粒脂-聚合物。
实施例3
一种载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物的制备方法：
步骤一、采用多肽固相合成法制备sdssdc。
步骤二、在mpeg-dspe上外接sdssdc，得到dss6-mpeg-dspe；
首先将12mg的sdssdc溶解于35ml磷酸缓冲溶液中，然后加入4.8mg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和3.6mgn-羟基琥珀酰亚胺活化sdssdc羧基端3h，再加入190mgmpeg-dspe，在室温和搅拌下混合反应24h，透析，冻干，待用。
步骤三、以甲状旁腺素、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、氢化蛋黄卵磷脂和dss6-mpeg-dspe为原料制备载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物：
所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乙交酯：丙交酯＝5：1，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为30000。
a、将10mg氢化蛋黄卵磷脂、6mgdss6-mpeg-dspe溶于24ml质量浓度6％的乙醇水溶液中得到a溶液；再加入10ml浓度为60mg/ml的人血蛋白水溶液；
b、将甲状旁腺素加入到35ml的水中混合均匀，然后倒入a溶液中并混合均匀得到b溶液，使b溶液中特立帕肽的浓度为250ug/ml；
c、将plga溶于质量分数为80％的乙腈水溶液中得到浓度为200mg/ml的c溶液，将25mlc溶液加入b溶液中混合均匀得到d溶液；
d、将d溶液用超声破碎仪超声5min，期间逐滴加完毕8mlc溶液；超声破碎仪的频率为21khz，功率为140w。
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kda的超滤管内离心超滤三次，即得载甲状旁腺素纳米颗粒脂-聚合物。
实施例4
一种载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物的制备方法：
步骤一、采用多肽固相合成法制备sdssdc。
步骤二、在dspe-peg-maleimide上外接sdssdc，得到dss6-dspe-peg-maleimide；
首先将10mg的sdssdc溶解于25ml磷酸缓冲溶液中，然后加入3.6mg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和2.1mgn-羟基琥珀酰亚胺活化sdssdc羧基端4h，再加入180mgdspe-peg-maleimide，在室温和搅拌下混合反应20h，透析，冻干，待用。
步骤三、以甲状旁腺素、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、蛋黄卵磷脂和dss6-dspe-peg-maleimide为原料制备载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物：
所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乙交酯：丙交酯＝2：1，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为50000。
a、将11mg蛋黄卵磷脂、4.5mgdss6-dspe-peg-maleimide溶于22ml质量浓度3％的乙醇水溶液中得到a溶液；再加入10ml浓度为80mg/ml的甘露糖水溶液；
b、将甲状旁腺素加入到45ml的水中混合均匀，然后倒入a溶液中并混合均匀得到b溶液，使b溶液中特立帕肽的浓度为400ug/ml；
c、将plga溶于质量分数为80％的乙腈水溶液中得到浓度为200mg/ml的c溶液，将25mlc溶液加入b溶液中混合均匀得到d溶液；
d、将d溶液用超声破碎仪超声5min，期间逐滴加完毕13mlc溶液；超声破碎仪的频率为25khz，功率为130w。
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kda的超滤管内离心超滤三次，即得载甲状旁腺素纳米颗粒脂-聚合物。
实施例5
一种载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物的制备方法：
步骤一、采用多肽固相合成法制备sdssdc。
步骤二、在dspe-peg-maleimide上外接sdssdc，得到dss6-dspe-peg-maleimide：
首先将15mg的sdssdc溶解于40ml磷酸缓冲溶液中，然后加入4.8mg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和3.3mgn-羟基琥珀酰亚胺活化sdssdc羧基端3h，再加入160mgdspe-peg-maleimide，在室温和搅拌下混合反应12h，透析，冻干，待用。
步骤三、以特立帕肽、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、大豆卵磷脂和dss6-dspe-peg-maleimide为原料制备载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物：
所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乙交酯：丙交酯＝20：60，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为50000。
a、将12mg大豆卵磷脂、6mgdss6-dspe-peg-maleimide溶于15ml质量浓度3％的乙醇水溶液中得到a溶液；再加入5ml浓度为40mg/ml的蔗糖水溶液；
b、将特立帕肽加入到50ml的乙腈中混合均匀，然后倒入a溶液中并混合均匀得到b溶液，使b溶液中特立帕肽的浓度为250ug/ml；
c、将plga溶于质量分数为80％的乙腈水溶液中得到浓度为200mg/ml的c溶液，将20mlc溶液加入b溶液中混合均匀得到d溶液；
d、将d溶液用超声破碎仪超声5min，期间逐滴加完毕15mlc溶液；超声破碎仪的频率为24khz，功率为130w。
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kda的超滤管内离心超滤三次，即得载特立帕肽纳米颗粒脂-聚合物。
实施例6
一种载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物的制备方法：
步骤一、采用多肽固相合成法制备sdssdc。
步骤二、在dspe-peg-silane上外接sdssdc，得到dss6-dspe-peg-silane；
首先将16mg的sdssdc溶解于45ml磷酸缓冲溶液中，然后加入4.5mg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和3.8mgn-羟基琥珀酰亚胺活化sdssdc羧基端4h，再加入190mgdspe-peg-silane，在室温和搅拌下混合反应22h，透析，冻干，待用。
步骤三、以甲状旁腺素、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、氢化蛋黄卵磷脂和dss6-dspe-peg-silane为原料制备载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物：
所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乙交酯：丙交酯＝2：3，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为20000。
a、将10.5mg氢化蛋黄卵磷脂、5mgdss6-dspe-peg-silane溶于20ml质量浓度5％的乙醇水溶液中得到a溶液；再加入8ml浓度为60mg/ml的明胶水溶液；
b、将甲状旁腺素加入到30ml的水中混合均匀，然后倒入a溶液中并混合均匀得到b溶液，使b溶液中特立帕肽的浓度为350ug/ml；
c、将plga溶于质量分数为80％的乙腈水溶液中得到浓度为200mg/ml的c溶液，将25mlc溶液加入b溶液中混合均匀得到d溶液；
d、将d溶液用超声破碎仪超声10min，期间逐滴加完毕11mlc溶液；超声破碎仪的频率为21khz，功率为135w。
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kda的超滤管内离心超滤三次，即得载甲状旁腺素纳米颗粒脂-聚合物。
检测结果：
一、物理特征
对实施例4得到的载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物进行nmr和傅里叶红外检测，结果显示氢核磁谱和傅里叶红外光谱上同时出现sdssdc和dspe-peg-maleimide的特征峰，证明sdssdc与dspe-peg-maleimide成功连接；用透射电镜进行扫描，测得平均直径为120nm左右,显示形貌为均一的球形结构。
二、细胞摄取能力及毒理实验
使用mg63细胞与实施例1-6得到的载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物共孵育显示，细胞可以很好的摄取此纳米粒子。
使用mtt法检测未见实施例1-6得到的载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物有明显毒性，使用2％兔血悬液检测无明显的溶血与凝集效应。
三、骨亲和力
与未连接多肽的纳米粒子相比，实施例1-6得到的载促骨合成药物纳米颗粒脂-聚合物在体外与羟基磷灰石有更好的亲和力。使用小动物活体荧光成像仪显示其在动物体内也有较好的骨靶向能力，可以在骨组织内沉积。
四、抗骨质疏松作用
在体内，分组实验1、阴性对照(未使用药物的骨质疏松动物)；2、阳性对照(骨质正常的动物)；3、给予游离特立帕肽；4、给予实施例6中得到载特立帕肽纳米颗粒脂-聚合物。
六个月后结束实验显示4组的动物抗骨质疏松效果最佳，骨密度最高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。