人滑膜成纤维细胞在类风湿关节炎治疗中的应用的制作方法

本发明涉及一种新型的类风湿关节炎的生物治疗方法，特别涉及通过膝关节腔注射人滑膜来源的成纤维细胞治疗类风湿关节炎的方法。本发明属于生物与新医药技术领域。

背景技术：

类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，ra)是由免疫活性细胞和多种细胞因子介导的慢性全身性自身免疫性疾病。本病在我国人口的患病率为0.34％-0.36％，女性发病率比男性高三倍以上，是造成我国人群丧失劳动力和致残的主要原因之一。ra的临床表现为多发性对称性关节病变、关节疼痛、肿胀、僵直和运动障碍。基本病理变化是滑膜炎和进行性关节破坏。免疫系统的紊乱和失衡是引起类风湿关节炎发生和发展的主要原因。t、b淋巴细胞及其分泌的细胞因子在ra的发病以及疾病进展中发挥着重要作用。对于ra的临床治疗，目前主要应用非甾体类抗炎药、改善病情抗风湿药、糖皮质激素和生物制剂来控制病情，但不能有效阻止该疾病的发展。所以，进一步探索该类疾病的发病机制并且为患者提供新的治疗药物仍是一项重大任务。

滑膜成纤维细胞是从人膝关节表面滑膜组织中分离出来的一类基质细胞，研究显示，滑膜成纤维细胞在体外具有强大的扩增能力，重要的是，该细胞的增殖能力不受供者的年龄及体外传代次数的影响，提示滑膜成纤维细胞作为临床上治疗骨和软骨损伤性疾病的种子细胞具有很大的应用前景。与此同时，滑膜组织取材方便，在晚期骨关节炎或骨创伤的患者行手术治疗时即可被移除。然而，迄今为止，关于人滑膜来源的成纤维细胞在类风湿关节炎领域中的应用尚无研究报道。

本发明利用了滑膜来源的成纤维细胞具有的潜在免疫调节能力的特点，通过膝关节腔注射的方法将其应用到ra的治疗中。目前与之相关或相似的治疗方法在国内外均无报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种新型的类风湿关节炎的生物治疗方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明利用了滑膜来源的成纤维细胞具有的潜在免疫调节能力的特点，通过膝关节腔注射的方法将其应用于ii型胶原诱导性关节炎(collageniiinducedarthritis,cia)小鼠的关节炎预防和治疗。

具体的，本发明的技术方案包括：

1、分离、培养人滑膜来源的成纤维细胞。

2、从形态学、多向分化能力及表面抗原分子的表达三方面分析人滑膜成纤维细胞的生物学特性。

3、构建类风湿关节炎动物模型cia关节炎小鼠模型，应用人滑膜来源的成纤维细胞在造模后对小鼠进行膝关节腔注射，从小鼠关节肿胀程度及小鼠关节滑膜组织炎性细胞因子基因表达水平情况两方面观察该细胞对关节炎的治疗作用。

上述研究结果表明：采用膝关节腔注射人滑膜成纤维细胞显著可显著改善小鼠的关节炎症状。

因此，在上述研究的基础上，本发明提出了人滑膜成纤维细胞在制备治疗类风湿关节炎药物中的用途。

其中，所述的药物是通过膝关节腔注射的方式达到治疗类风湿关节炎的目的。

其中，优选的，所述的人滑膜成纤维细胞是通过以下方法制备得到的：将在无菌条件下取出的骨关节炎患者的膝关节滑膜组织，经剪碎、消化、过滤、培养、传代得到p3代的人滑膜来源的成纤维细胞，即可用于制备治疗类风湿关节炎的药物。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1.本发明利用了滑膜来源的成纤维细胞来调节类风湿关节炎的免疫失衡状态。成纤维细胞表现为与msc相似的生物学特性及体内的免疫调节作用，为类风湿关节炎患者的治疗提供了有效的生物治疗手段，具有极大的社会和经济效益价值。

2.本发明中所涉及的人滑膜成纤维细胞可以有效地改善cia小鼠关节炎的发生和进展。

3.本发明所应用的治疗能够广泛减少病灶局部炎症细胞因子在基因水平上的表达。

附图说明

图1为滑膜成纤维细胞的生物学特性；

(a):滑膜成纤维细胞在标准培养条件下呈成纤维细胞样贴壁生长(b):滑膜成纤维细胞集落形成的能力(c):流式细胞学检测表面抗原分子的表达(d):滑膜成纤维细胞成脂、成骨诱导分化；

图2为膝关节腔应用人滑膜来源的成纤维细胞治疗小鼠的关节炎症状的相关结果；

(a)：对照组与成纤维细胞治疗组小鼠足爪的形态比较；(b)：对照组与成纤维细胞治疗组小鼠的关节炎评分结果；(c)：对照组与成纤维细胞治疗组小鼠的后爪厚度(mm)；

图3为cia小鼠膝关节腔应用人滑膜来源的成纤维细胞后，小鼠膝关节滑膜组织炎性细胞因子基因表达水平的检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：分离培养人滑膜组织来源的成纤维细胞

1、方法

(1)无菌条件下取骨关节炎患者膝关节滑膜组织，经剪碎、消化、过滤、培养、传代得到p3代滑膜成纤维细胞；

(2)显微镜下p3代滑膜成纤维细胞的形态学观察；

(3)p3代成纤维细胞在成脂诱导分化培养基和成骨诱导分化培养基中培养21天，分别用油红o和茜素红对其进行染色，进行多向分化潜能的检测分析；

(4)流式细胞术的方法进行p3代成纤维细胞表面抗原分子的检测。

2、结果

滑膜成纤维细胞的生物学特性如图1所示，其中图1(a)显示了滑膜成纤维细胞在标准培养条件下呈成纤维细胞样贴壁生长；图1(b)显示滑膜成纤维细胞集落形成的能力；图1(c)显示流式细胞学检测滑膜成纤维细胞表面抗原分子的表达；图1(d)显示滑膜成纤维细胞具有成脂、成骨诱导分化的潜能。

实施例2：膝关节腔注射人滑膜来源的成纤维细胞对cia小鼠的治疗效果

1、方法

(1)ⅱ型胶原诱导性关节炎(cia)小鼠模型的建立：所有造模组小鼠，d0天和d21天于尾根部皮下注射100μg牛ii型胶原；

(2)右膝关节腔注射人滑膜来源的成纤维细胞治疗cia小鼠：用10μl含1×10⁶个成纤维细胞的pbs，在一免后的d28、d32、d38天对cia小鼠右膝关节腔注射；对照组右膝关节腔注射10μlpbs；

(3)cia关节炎评价：二次免疫后每隔一天对造模组小鼠的关节炎评分。评分采用双盲法，评分标准：0分正常；1分红肿涉及一个指关节；2分≥2个指关节或整个足爪轻度红肿；3分整个足爪红肿较重；4分重度红肿，僵直，缺乏弹性。

2、结果

结果如图2所示，图2(a)显示对照组与成纤维细胞治疗组小鼠足爪的形态比较；图2(b)为对照组与成纤维细胞治疗组小鼠的关节炎评分结果；图2(c)为对照组与成纤维细胞治疗组小鼠的后爪厚度(mm)，从该结果可以看出采用膝关节腔注射人滑膜来源的成纤维细胞显著可显著改善小鼠的关节炎症状。

实施例3：检测细胞因子在滑膜组织中的mrna表达水平

第70天处死实施例2的对照组与成纤维细胞治疗组中小鼠，分离髌骨和邻近的滑膜组织，realtime-pcr检测滑膜组织中细胞因子的mrna水平。

结果如图3所示，从该结果可以看出，人滑膜来源的成纤维细胞可减少肿瘤坏死因子α(tnf-α)、干扰素γ(ifn-γ)炎性因子il-17a以及转化生长因子(tgf-β)的分泌，并上调免疫调节分子il-10以及il-4的水平。可见，人滑膜来源的成纤维细胞具有免疫调节作用及组织修复能力，在类风湿关节炎的治疗领域中将具有广阔的应用前景。