一种高浓度人间充质干细胞提取物及其制备方法与流程

本发明涉及细胞生物技术领域，尤其是一种高浓度人间充质干细胞提取物及其制备方法。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymalstemcells,msc)是一组源于基质的异质细胞群，可以从人体大多数组织获取。它们具有自我更新能力、组织修复、免疫调节能力，可以向中胚层谱系分化，例如：脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等，此外还能够向其它胚层谱系细胞分化，例如向表皮细胞、血管内皮细胞分化。

间充质干细胞培养体系中含有多种大量的活性成分，如：干细胞生长因子(scf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、内皮细胞生长因子(vegf)、表皮细胞生长因子(egf)、细胞集落刺激因子、白细胞介素(il)、胶原蛋白、透明质酸等80余种活性物质。目前，已经有将间充质干细胞应用于损伤修复和自身免疫性疾病的报道,但是由于活性细胞的存活条件比较苛刻，很容易死亡因此由活细胞所起的作用也会大打折扣。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，提供一种高浓度人间充质干细胞提取物及其制备方法，利用高浓度的间充质干细胞分泌的多种细胞因子，为间充质干细胞应用提供高效、快捷、方便的途径。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种高浓度人间充质干细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)人间充质干细胞培养：从细胞库中选取p2-p6的人间充质干细胞复苏，接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳体积比浓度5％；

(2)第一批次细胞融合度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养；

(3)饥饿培养12-24小时后，第一批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；

(4)取培养的第二批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，用步骤(3)中细胞培养上清进行饥饿培养；

(5)饥饿培养12-24小时后，第二批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；

(6)取培养的第三批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(5)中细胞培养上清进行饥饿培养；

(7)饥饿培养12-24小时后，第三批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清，得到高浓度间充质干细胞提取物。

上述高浓度人间充质干细胞提取物的制备方法得到的高浓度人间充质干细胞提取物。

本发明有益效果：将细胞进行饥饿培养，使得细胞分泌的各种活性成分的浓度都得到了提高，并且在短时间内使用饥饿上清重复饥饿间充质干细胞，使细胞提取物浓度进一步增加。而高浓度的间充质干细胞提取物为干细胞提取物提供了高效的制备方法。

附图说明

图1本发明实施例1的方法培养的人脐带间充质干细胞图；

图2实施例1不同饥饿次数人脐带间充质干细胞提取物中有效因子分泌量比较图；

图3本发明实施例2的方法培养的人脂肪间充质干细胞图；

图4实施例2不同饥饿次数人脂肪间充质干细胞提取物中有效因子分泌量比较图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的高浓度人间充质干细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)人间充质干细胞培养：从细胞库中选取p2-p6的人间充质干细胞复苏，接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳体积比浓度5％；

(2)第一批次细胞融合度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养；

(3)饥饿培养12-24小时后，第一批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；

(4)取培养的第二批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，用步骤(3)中细胞培养上清进行饥饿培养；

(5)饥饿培养12-24小时后，第二批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；

(6)取培养的第三批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(5)中细胞培养上清进行饥饿培养；

(7)饥饿培养12-24小时后，第三批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清，得到高浓度间充质干细胞提取物。

上述高浓度人间充质干细胞提取物的制备方法得到的高浓度人间充质干细胞提取物

制备的高浓度人间充质干细胞提取物可用于损伤修复和炎症治疗等。

实施例1

(1)人脐带间充质干细胞培养：从细胞库中选取p4的人脐带间充质干细胞复苏，细胞总数4.2*10⁷。接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的60％(每瓶接种细胞数：9*10⁶,接种细胞三瓶)、40％(每瓶接种细胞数：6*10⁶，接种细胞两瓶)、20％(接种细胞数：3*10⁶，接种细胞一瓶),培养体系均为40ml。培养细胞所用完全培养基为无酚红dmem/df12和体积比浓度为10％胎牛血清，接种细胞瓶为t-175培养瓶。细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳体积比浓度5％；

(2)培养30小时,此时第一批次细胞融合度达到75％时，见(图1)，以生理盐水清洗细胞2次，每瓶用40ml复方电解质注射液(中国大冢制药有限公司生产的复方电解质葡萄糖mg3注射液)进行饥饿培养；

(3)饥饿培养18小时后，第一批次细胞融合度达95％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用；

(4)取培养的第二批次细胞，此时细胞融合度达到70％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，用步骤(3)中细胞培养上清40ml进行饥饿培养；

(5)饥饿培养18小时后，第二批次细胞融合度达95％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用；

(6)取培养的第三批次细胞，此时细胞融合度达到70％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(5)中细胞培养上清40ml进行饥饿培养；(7)饥饿培养24小时后，第三批次细胞融合度达90％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用。检测步骤(3)、步骤(5)和步骤(7)中的备用上清细胞因子含量，见(图2)。

实施例2

(1)人脂肪间充质干细胞培养：从细胞库中选取p5的人脂肪间充质干细胞复苏，细胞总数3.84*10⁷。接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的50％(每瓶接种细胞数：8*10⁶,接种细胞三瓶)、35％(每瓶接种细胞数：5.6*10⁶，接种细胞两瓶)、20％(接种细胞数：3.2*10⁶，接种细胞一瓶),培养体系均为40ml。培养细胞所用完全培养基为无酚红amem和体积比浓度为10％胎牛血清，接种细胞瓶为t-175培养瓶。细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳浓度5％；

(2)培养35小时,此时第一批次细胞融合度达到70％时，见(图3)，以生理盐水清洗细胞2次，每瓶用40ml复方电解质注射液进行饥饿培养；

(3)饥饿培养18小时后，第一批次细胞融合度达95％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用；

(4)取培养的第二批次细胞，此时细胞融合度达到70％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，每瓶用步骤(3)中细胞培养上清40ml进行饥饿培养；

(5)饥饿培养18小时后，第二批次细胞融合度达95％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用；

(6)取培养的第三批次细胞，此时细胞融合度达到75％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(5)中细胞培养上清40ml进行饥饿培养；

(7)饥饿培养24小时后，第三批次细胞融合度达90％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用。检测步骤(3)、步骤(5)和步骤(7)的细胞因子含量,见(图4)。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。